專利名稱:油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及甘藍(lán)型油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)及其緊密連鎖的分子標(biāo)記,同時還涉及該分子標(biāo)記在油菜高抗裂角育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
油菜是世界第三大油料作物,也是我國繼水稻、小麥、玉米和大豆之后的第五大農(nóng)作物,全世界大約13%的植物油來自于油菜。除了作為食用油的主要原料之外,油菜也是重 要的工業(yè)原料和歐盟主要成員國可再生能源的主要生物資源。我國油菜的種植面積和總產(chǎn)量均占世界的30%左右,它不僅關(guān)系到我國種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整、優(yōu)化和近億農(nóng)民的增收,也關(guān)系到滿足人民生活水平提高、膳食結(jié)構(gòu)改善及保障國家食物安全的需要,因此,加強(qiáng)油菜生產(chǎn)意義重大。機(jī)械化是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向,而油菜角果易開裂正是目前制約油菜產(chǎn)業(yè)機(jī)械化收獲的瓶頸,嚴(yán)重地影響著油菜產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效率的提高。由于目前生產(chǎn)上利用的甘藍(lán)型油菜在成熟時特別容易裂角,一般都會造成產(chǎn)量損失10%左右,機(jī)械化收割損失將更加嚴(yán)重。如果遇到成熟期氣候比較惡劣,產(chǎn)量損失可高達(dá)50%以上,造成豐產(chǎn)不豐收。而且,易裂角除了帶來產(chǎn)量損失外還會造成一系列其他的不良影響,如落地籽粒在條件適宜時會萌發(fā)形成自生苗,影響下茬作物生長,同時也增加了使用除草劑去除再生苗的成本。未來隨著轉(zhuǎn)基因油菜的推廣應(yīng)用,角果開裂種子散落還會帶來生態(tài)風(fēng)險。目前生產(chǎn)上為了避免裂角造成的產(chǎn)量損失和對下茬作物的不良影響,通常是提前收獲,但這樣做會造成油菜籽含油量下降,種子中葉綠素含量過高,影響食用油的品質(zhì)。因此,選育抗裂角的油菜品種對油菜生產(chǎn)顯得極為重要。但一般甘藍(lán)型油菜品種間抗裂角特性變異不大,在其他的近緣種中雖然存在抗裂角特性,但通過遠(yuǎn)緣雜交很難除去不良農(nóng)藝性狀的影響。雖然目前在擬南芥中已有許多與角果發(fā)育和開裂有關(guān)的基因被克隆,利用這些基因來抑制油菜角果開裂和防止種子損失已經(jīng)成為可能,但有關(guān)基因轉(zhuǎn)化的結(jié)果是導(dǎo)致角果成筒狀結(jié)構(gòu),致使角果完全不能開裂,造成脫粒十分困難。因此,對甘藍(lán)型油菜抗裂角資源的發(fā)掘以及對抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的開發(fā),有助于我們未來培育適用的抗裂角優(yōu)異甘藍(lán)型油菜品種。大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn),如產(chǎn)量性狀、含油量、成熟期、品質(zhì)、抗旱性等。數(shù)量性狀易受環(huán)境條件的影響,因此選擇效果不好。傳統(tǒng)育種方法周期長,主要是由數(shù)量性狀造成的。由于分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,人們已可將復(fù)雜的數(shù)量性狀進(jìn)行分解,像研究質(zhì)量性狀基因一樣對控制數(shù)量性狀的多個基因進(jìn)行研究。數(shù)量性狀基因座(quantitat ive trait locus,簡稱QTL)是在高密度的遺傳圖譜基礎(chǔ)上,通過一定實(shí)驗設(shè)計,獲得分子標(biāo)記,借助Mapmaker軟件分析確定控制某一性狀的基因在染色體上的位置。當(dāng)目標(biāo)性狀由少數(shù)幾個基因控制時用標(biāo)記選擇,對發(fā)掘遺傳潛力非常有效。本研究通過遺傳分析及QTL定位,旨在篩選出對油菜抗裂角具有正向效應(yīng)的QTL,用于油菜抗裂角的分子標(biāo)記輔助選擇、分子育種及抗裂角基因的克隆。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是在于提供了一個油菜抗裂角性狀的主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記BrSF0007-39,該分子標(biāo)記不僅有助于輔助篩選抗裂角材料,同時也有助于深入了解中雙11號高抗裂角性狀構(gòu)成的分子機(jī)理,為今后主效QTL的精細(xì)定位及克隆奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個目的在于一個油菜抗裂角性狀的主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記的弓I物,對今后中雙11號及其及其衍生品系的抗裂角性狀育種提供了極大的便利。本發(fā)明還有一個目的是提供了一個油菜抗裂角性狀的主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記在油菜產(chǎn)量育種中的應(yīng)用。分子標(biāo)記篩選主要優(yōu)點(diǎn)就是可以在苗期篩選,大大節(jié)約成本和篩選工作量。常規(guī)篩選方法需要等到油菜完全成熟以后才能選擇,不能在苗期淘汰掉絕大部分不抗裂角的材料,進(jìn)而可以快速篩選出高抗裂角株系用于油菜抗裂角育種。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記,其篩選步驟是a)利用在抗裂角指數(shù)上有極顯著差異的油菜品種中雙11(抗裂角指數(shù)為0. 83)和73290 (抗裂角指數(shù)為0. 48)雜交,雜種Fl代自交產(chǎn)生F2和F2:3代分離群體;b)采用CTAB法提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉片總DNA,過程中所用到的試劑包括提取液(I. 4M NaCiaOOmM Tris, pH8. 0,20mM EDTA, pH8. 0,2%CTAB)、氯仿、異戊醇、無水乙醇;c)合成油菜SSR引物,并對親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,染色和顯影后對條帶的大小進(jìn)行判別,篩選多態(tài)性引物;d)利用多態(tài)性引物對F2代分離群體進(jìn)行基因型分析和遺傳圖譜的構(gòu)建,結(jié)合其抗裂角指數(shù)的性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位,檢測到油菜第9染色體具有一個QTL位點(diǎn)Psr. A9 (見表2),與其性狀緊密連鎖的SSR標(biāo)記為BrSF0007_39,該標(biāo)記位于QTL位點(diǎn)Psr. A9的置信區(qū)間內(nèi),在中雙11號中可擴(kuò)增出大小為204bp和228bp的兩條帶,在73290中只能擴(kuò)出大小為228bp和260bp的兩條帶(圖4),引物序列為BrSF0007_39_F 5’ -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’,BrSF0007_39-R : 5’ -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’ ;Joinmap3. 0作圖軟件用于對所獲得的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析,WinQTL cart2. 5軟件用于QTL分析。本研究用到的兩個親本材料抗裂角指數(shù)相差接近一倍,均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所油菜生物技術(shù)育種課題組科技人員在王漢中研究員帶領(lǐng)下育成。中雙11號及73290來源詳見遺傳資源來源披露登記表。油菜兩親本、后代分離群體單株抗裂角指數(shù)的測定參照文獻(xiàn)(文雁成,甘藍(lán)型油菜抗裂角品種的篩選與分析,作物學(xué)報,2008,I)中的隨機(jī)碰撞法完成,植物葉片總DNA的提取、PCR及聚丙烯酰胺凝膠電泳均為常用的分子生物學(xué)技術(shù),通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),和 Draper 等人,Blackwell,科學(xué)出版社,1988 中的條件進(jìn)行。實(shí)驗過程中涉及的所有試劑[包括CTAB提取液(0.2M Tris — C1,0. 25M NaCl, 25mMEDT A,0. 5% (質(zhì)量比)SDS, pH7. 5,Taq酶,dNTP,丙烯酰胺,尿素,冰醋酸,AgNO3,氯仿,異戊醇,RNA酶和無水乙醇]均可從商業(yè)途徑獲得,并按照實(shí)驗手冊中的條件或所用試劑制造廠商所建議的條件使用。
利用上述技術(shù)措施,申請人最終獲得了一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記,具體如下該標(biāo)記位于QTL位點(diǎn)Psr. A9的置信區(qū)間內(nèi),其引物序列為BrSF0007_39_F 5’ -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’,BrSF0007-39-R :5’ -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3 。Psr. A9,該主效基因位點(diǎn)位于油菜第9染色體,和分子標(biāo)記BrSF0007-39緊密連鎖,利用QTLCart2. 5軟件分析測得其對油菜抗裂角性狀的貢獻(xiàn)率為32. 7%,加性效應(yīng)為0. 87,顯性效應(yīng)為0. 97,屬于完全顯性遺傳。一種抗裂角主效基因位點(diǎn)Psr. A9的分子標(biāo)記BrSF0007_39在油菜產(chǎn)量育種中的應(yīng)用利用Psr. A9位點(diǎn)的分子標(biāo)記BrSF0007_39對兩親本的F3代進(jìn)行基因型鑒定,并在收獲后進(jìn)行抗裂角性狀的考種。結(jié)果表明,通過分子標(biāo)記輔助選擇得到的植株抗裂角指數(shù)超過F2:3家系均值(抗裂角指數(shù)0. 655)的占85. 7%,在保留下來的植株再篩選高油、高產(chǎn)的株系。常規(guī)篩選方法需要等到油菜完全成熟以后才能選擇,不能在苗期淘汰掉絕大部分 不抗裂角的材料,通過鑒定上述抗裂角主效基因位點(diǎn)來預(yù)測油菜抗裂角性,可迅速提高油菜高抗裂角、高產(chǎn)品種篩選的效率,加快育種進(jìn)程。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明首次定位了油菜品種中雙11控制抗裂角性狀的主效基因位點(diǎn),它對油菜抗裂角性狀的貢獻(xiàn)率為32. 7%,使得油菜抗裂角主效基因位點(diǎn)的定位工作居于同領(lǐng)域世界前列,基于此位點(diǎn)篩選連鎖分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀判斷的準(zhǔn)確性大大提高。2、在常規(guī)育種方法中,抗裂角性狀鑒定要等到成熟期收獲后考種,受環(huán)境影響較大而且費(fèi)時費(fèi)力。因此,選擇效率低且成本高。通過檢測抗裂角性狀主效QTL位點(diǎn),可以在苗期進(jìn)行淘汰,不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率。3、本發(fā)明中抗裂角主效基因位點(diǎn)位置明確,主效基因位點(diǎn)的檢測方法方便快速,不受環(huán)境影響。通過檢測與抗裂角性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,即可以預(yù)測抗裂角指數(shù)的高低,進(jìn)而可以快速篩選高抗裂角株系,輔助育種選擇目標(biāo)明確,節(jié)約成本。
圖I為一種中雙11X73290組合F2和F2:3群體在武漢種植時的抗裂角指數(shù)分布圖。結(jié)果表明抗裂角表型呈連續(xù)性分布,證明抗裂角屬于數(shù)量性狀。圖2為一種A9連鎖群標(biāo)記示意圖。右半部分指示該連鎖群上的標(biāo)記名稱,左半部分指示每個標(biāo)記對應(yīng)的遺傳圖距。圖3為一種位于第9連鎖群上的抗裂角主效基因位點(diǎn)LOD曲線示意圖。圖中橫坐標(biāo)代表連鎖群,縱坐標(biāo)代表LOD值。圖4為一種利用分子標(biāo)記BrSF0007_39對F3單株進(jìn)行基因型分析和篩選示意圖。圖中1-39為F3單株編號,最后兩個Pl和P2分別代表親本中雙11和73290。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I.油菜抗裂角分離群體的構(gòu)建及性狀測定本實(shí)施例中使用的群體為油菜高抗裂角和不抗裂角親本(中雙11 :抗裂角指數(shù)0.83 ;73290 :抗裂角指數(shù)0. 48)雜交后代一 F2和F2:3群體。親本、F2和F2:3群體的抗裂角表型在成熟期收獲后經(jīng)考種鑒定。F2和F2:3分離群體抗裂角指數(shù)結(jié)果表明兩群體抗裂角指數(shù)均呈連續(xù)分布,但變異分布不呈典型正態(tài)分布,證明抗裂角性狀屬于數(shù)量性狀且存在主效基因位點(diǎn)(圖I)。
實(shí)施例2.親本、F2和F2:3分離群體葉片總DNA的提取利用CTAB法提取葉片總DNA,具體步驟如下A.取0. I克油菜葉片鮮樣放入研磨,加700微升提取液研磨,隨即裝入I. 5毫升離心管中置于65° C恒溫水浴60分鐘,其間混合2-3次;B.加等體積的苯酚氯仿異戊醇(25 24 :1,V / V / V),輕輕顛倒使其充分混勻;12000rpm離心10分鐘使其分層,輕輕吸取上清液轉(zhuǎn)入另一 I. 5毫升離心管;加等體積的氯仿異戊醇(24 :1,V / V)重新抽提一次;C.加入I毫升的-20° C預(yù)冷無水乙醇,置于-20° C冷凍不超過30分鐘讓DNA析出;12000rpm離心10分鐘,倒掉離心管中乙醇溶液;用75%乙醇清洗2_3次;倒掉浸泡液,打開離心管蓋置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干;D.干燥后加入 TE (IOmM Tris, pH8. 0 ;lmM EDTA, pH8. 0)溶解 DNA ;紫外分光光度計測定DNA的濃度,于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆?;?shí)施例3.引物的開發(fā)合成及多態(tài)性的篩選我們采用的SSR引物包括兩類一類是已發(fā)表文章和蕓苔屬數(shù)據(jù)庫中公開的引物序列(http://www. brassica. info/resource/markers/ssr-exchange. php),包括 CB, CNU,niab, MR, FITO, 01,BRMS, BRAS, Ni, Na, BN, NGA, MB, BnGMS, BrGMS, BoGMS, BnEMS,等許多系列;另一類是我們根據(jù)白菜和甘藍(lán)測序后拼接成的scaffold序列開發(fā)的,分別命名為BrSF和BoSF系列,具體的開發(fā)方法是先利用SSRHunter軟件在每個scaffold搜索SSR,然后用Primer3. 0軟件設(shè)計SSR引物。我們已經(jīng)通過生物公司合成了公共和新開發(fā)的SSR引物共3085對,篩選結(jié)果表明,有15%引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在雙親間存在長度多態(tài)性差異。多態(tài)性篩選程序如下(I)從親本中各隨機(jī)選擇10株DNA等量混合,作為篩選引物的模板。(2) PCR 反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記,其篩選步驟是 a)利用在抗裂角指數(shù)上有極顯著差異的油菜品種中雙11和73290雜交,雜種Fl代自交產(chǎn)生F2和F2:3代分離群體; b)采用CTAB法提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉片總DNA; c)合成油菜SSR引物,并對親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,染色和顯影后對條帶的大小進(jìn)行判別,篩選多態(tài)性引物; d)利用多態(tài)性引物對F2代分離群體進(jìn)行基因型分析和遺傳圖譜的構(gòu)建,結(jié)合其抗裂角指數(shù)的性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位,檢測到油菜第9染色體具有一個QTL位點(diǎn)Psr.A9,與其性狀緊密連鎖的SSR標(biāo)記為BrSF0007-39,該標(biāo)記位于QTL位點(diǎn)Psr. A9的置信區(qū)間內(nèi),在中雙11號中擴(kuò)增出大小為204 bp和228 bp的兩條帶,引物序列為 BrSF0007-39-F :5,-ACCAAACCAAACCAAACCAA-3,,即 SEQ ID NO:I, BrSF0007-39-R 5,-CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3,,即 SEQ ID NO:2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的分子標(biāo)記,其特征在于所述的QTL位點(diǎn)Psr. A9位于油菜第9染色體,對油菜抗裂角性狀的貢獻(xiàn)率為32. 7%,加性效應(yīng)為0. 87,顯性效應(yīng)為0. 97,屬于完全顯性遺傳。
3.權(quán)利要求I所述的一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)的SSR分子標(biāo)記,其特征在于分子標(biāo)記的引物序列為 fcSF0007-39-F :5’ -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’,BrSF0007-39-R 5’ -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’。
4.權(quán)利要求I或2所述分子標(biāo)記在油菜高抗裂角育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜抗裂角性狀主效基因位點(diǎn)分子標(biāo)記及應(yīng)用,步驟包括1)利用在抗裂角性狀上有顯著差異的甘藍(lán)型油菜品種中雙11和73290雜交,后代自交獲得抗裂角性狀分離的F2和F2:3分離群體;2)利用SSR引物對親本DNA進(jìn)行多態(tài)性的篩選,通過對F2代分離群體進(jìn)行SSR分子標(biāo)記基因型分析構(gòu)建遺傳連鎖圖譜;3)通過對F2和F2:3分離群體進(jìn)行田間實(shí)驗和考種獲得抗裂角性狀的表型數(shù)據(jù);4)結(jié)合開發(fā)的高密度分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜,以及分離群體的基因型和表型數(shù)據(jù),利用QTLCart2.5軟件進(jìn)行QTL檢測,檢測到甘藍(lán)型有愛A9連鎖群上控制油菜抗裂角的主效基因位點(diǎn)Psr.A9,與該主效基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記BrSF0007-39,利用該標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇可大大提高抗裂角育種的選擇效率。
文檔編號C12Q1/68GK102747080SQ20121024336
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者劉貴華, 華瑋, 師家勤, 楊慶, 王新發(fā), 王漢中, 胡志勇, 黃順謀 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所