一株高產(chǎn)纖維素酶菌株及發(fā)酵產(chǎn)中性纖維素酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)纖維素酶的木酶屬里氏木酶菌株Trichodema?reesei?QZ-5，已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC?NO：M2012204，保藏日期2012年6月5日。同時(shí)還發(fā)明了以該菌為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和以玉米漿、硫酸銨等為氮源，以葡萄糖、麩皮等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)中性纖維素酶的方法，發(fā)酵液最高酶活可達(dá)5000IU/L以上，所產(chǎn)中性纖維素酶可廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說(shuō)明】一株高產(chǎn)纖維素酶菌株及發(fā)酵產(chǎn)中性纖維素酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明利用一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株(Trichodema reesei QZ-5)及利用該菌株經(jīng)種子培養(yǎng)和以玉米漿、硫酸銨等為氮源、以葡萄糖、麩皮等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)中性纖維素酶的方法，所制備的酶能被應(yīng)用于紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是一類能夠降解纖維素成葡萄糖的多組分復(fù)合酶系，可廣泛應(yīng)用于能源、紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，近年來(lái)，隨著全球資源能源短缺問(wèn)題日顯突出，纖維素酶是將自然界中分布最廣、含量最多、最為廉價(jià)的纖維素作為再生資源的主要酶系，從而使生產(chǎn)制備纖維素酶的研究成了全球科研工作者更關(guān)注的課題。
[0003]纖維素酶廣泛分布于真菌、植物、動(dòng)物、細(xì)菌和昆蟲中。但用于生產(chǎn)纖維素酶的主要是木酶屬的里氏木酶菌。里氏木酶產(chǎn)生的纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)和β —葡萄糖苷酶(CB)，依據(jù)應(yīng)用條件，可分為酸性纖維素酶、中性纖維素酶、堿性纖維素酶。
[0004]我國(guó)中性纖維素酶年需求量約4萬(wàn)噸(10000IU/g)，重點(diǎn)應(yīng)用于紡織、食品、飼料、造紙等領(lǐng)域，目前基本依賴進(jìn)口。盡管我國(guó)已成為繼美國(guó)、日本、丹麥之后世界上第4個(gè)能生產(chǎn)纖維素酶的國(guó)家，但目前我國(guó)中性纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)發(fā)達(dá)國(guó)家還比較落后，酶活力低、成本高、規(guī)模小，其根源是沒(méi)有篩選到產(chǎn)酶活高的野生菌種或基因改造工程菌技術(shù)尚處于發(fā)展階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明篩選并提供了一株高`產(chǎn)纖維素酶的野生菌株(Trichodema reesei QZ-5)及利用該菌株經(jīng)種子培養(yǎng)和以玉米漿、硫酸銨等為氮源、以葡萄糖、麩皮等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)中性纖維素酶的方法，所制備的酶能被應(yīng)用于紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，來(lái)替代價(jià)格昂貴的進(jìn)口中性纖維素酶。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種高產(chǎn)纖維素酶的木酶屬菌株，其命名為Trichodemareesei QZ-5，已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2012204,保藏日期2012年6月5日。
[0007]用該菌為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和以玉米漿、硫酸銨等為氮源、以葡萄糖、麩皮等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)中性纖維素酶；工藝為:
[0008](I)種子培養(yǎng)
[0009]種子培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨3g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀3g/L, CaCl2.2Η200.3g/L, MgSO4.7Η200.3g/L, 115°C滅菌待用。
[0010]接種工藝:取斜面菌種一環(huán)在PDA平板上點(diǎn)接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無(wú)菌水沖洗，并打碎成均勻的孢子懸液.取Iml孢子懸液接入250ml規(guī)格的三角瓶，裝液量為50ml。[0011]培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30度，恒溫培養(yǎng)2天，即為發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶的種子。
[0012]⑵產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0013]產(chǎn)酶培養(yǎng)基:玉米漿30g/L、麩皮10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏0.5g/L，蛋白胨3g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 3g/L, CaCl2.2Η200.3g/L, MgSO4.7Η200.3g/L, FeSO4.7Η200.005g/L,MnSO4.H2O0.016g/L, ZnSO4.7Η200.0014g/L, CoCl20.002g/L,吐溫-800.2g/L, 115°C滅菌待用。
[0014]發(fā)酵罐:規(guī)格為容量7L.實(shí)際發(fā)酵裝液量為5L.[0015]發(fā)酵參數(shù):轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30度.通氣量1.4L/min/L.發(fā)酵時(shí)間150小時(shí)。
[0016]根據(jù)上述條件，按10%接種量在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液的中性纖維素酶活力最高達(dá)5000U/L以上。
[0017]本發(fā)明從津市市保河堤食用菌培植基地腐爛土樣、腐質(zhì)稻草、平菇栽培染菌料等采集的樣品中篩選出一株高產(chǎn)中性纖維素酶的野生木酶屬里氏木酶菌株，命名為Trichodema reesei QZ-51,本菌株的篩選:
[0018]1.1平板初篩
[0019]樣品的處理方法:將材料用少量無(wú)菌水30°C浸泡24h，之后采用梯度稀釋法稀釋至10_8，取ImL均勻涂布在1 21°C滅菌20min的剛果紅篩選平板培養(yǎng)基(MgSO40.50g/L,(NH4) 2S042.00g/L, KH2PO4L 00g/L，NaC10.50g/L,剛果紅 0.20g/L，瓊脂 20.00g/L，CMC2.0Og/L,自然pH值)上28°C恒溫培養(yǎng)3-4天，挑取有水解透明圈且透明圈較圓整邊緣清晰的的菌落在新的剛果紅篩選平板培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)3-4天，挑取透明圈圓整邊緣清晰且透明圈直徑與菌落直徑比值(H/d)較大的菌落作為篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20.00g/L)作為復(fù)篩菌株。
[0020]1.2搖瓶復(fù)篩
[0021]將長(zhǎng)滿菌絲的PDA平板用IOmL無(wú)菌水沖洗，吸取ImL接入種子培養(yǎng)基(葡萄糖 15g/L，酵母膏 2g/L，蛋白胨 3g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 3g/L，CaCl2.2Η200.3g/L，MgSO4.7H200.3g/L)，種子培養(yǎng)基裝液量為250mL三角瓶中裝50mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30°C、轉(zhuǎn)速200r/min搖床恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，取菌懸液(按接種量10% )接入液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(玉米衆(zhòng)30g/L、麩皮10g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏0.5g/L,蛋白胨3g/L,硫酸銨2g/L,磷酸二氫鉀 3g/L, CaCl2.2Η200.3g/L, MgSO4.7Η200.3g/L, FeSO4.7Η200.005g/L, MnSO4.H2O0.016g/L，ZnSO4.7H200.0014g/L, CoCl20.002g/L,吐溫-800.2g/L)，液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝液量為250mL三角瓶中裝50mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30°C、轉(zhuǎn)速200r/min，搖床恒溫培養(yǎng)8天。
[0022]1.3經(jīng)上述兩種方法篩選最終篩選到一株中性纖維素酶活力相對(duì)較高的菌株，平板菌落(圖1)，電鏡(圖2.)，18S rDNA序列鑒定(見(jiàn)序列表)并鑒定確定為木酶菌屬中的里氏木酶，命名為 Trichodema reesei QZ-51。
[0023]2、酶活的測(cè)定方法
[0024]2.1酶活定義
[0025]在50°C，pH為6.0條件下，每分鐘從濃度為5mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放Iymol還原糖所需要的酶量為一個(gè)活力單位(IU)，還原糖以葡萄糖等量。
[0026]2.2 原理
[0027]在一定溫度和pH條件下纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生單糖和寡糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團(tuán)的單糖在沸水浴條件下與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生還原糖的量成正比，還原糖生成量與反應(yīng)液中纖維素酶活力成正比，通過(guò)分光比色測(cè)定反應(yīng)液吸光度，可計(jì)算纖維素酶活力。
[0028]2.3儀器和設(shè)備:
[0029]2.3.1 分析天平:感量 0.0OOlg
[0030]2.3.2精密pH計(jì):精確至0.01
[0031]2.3.3磁力加熱攪拌器
[0032]2.3.4分光光度計(jì):應(yīng)符合GB9721有關(guān)規(guī)定，5mm比色皿
[0033]2.3.5 電熱恒溫水浴鍋:30 ~100°C，土0.5°C
[0034]2.3.6計(jì)時(shí)器:每小時(shí)誤差不超過(guò)五秒
[0035]2.3.7 移液器:100 ~1000 μ L
[0036]2.3.8微量進(jìn)樣器:0~50 μ L
[0037]2.4試劑和溶液
[0038]2.4.1 試 劑:
[0039]
檸檬酸C6H8OrH2O
檸檬酸三鈉Na3C6H5Or 2Η2Ο
酒石酸鉀鈉K0C0(CH0H)2C00Na_4H20
3，5-二硝基水楊酸C7H4N2O7
氫氧化鈉NaOH
苯酚C6H5OH
無(wú)水亞硫酸鈉Na2SO3
[0040]2.4.2 配制:
[0041 ] a.0.5M的磷酸二氫鈉溶液:
[0042]稱取39.0g磷酸二氫鈉完全溶于400ml的蒸餾水中，定容至500ml。標(biāo)記為A試液。
[0043]b.0.5M的磷酸氫二鈉溶液:
[0044]稱取89.5g磷酸氫二鈉完全溶于400ml的蒸懼水中，定容至500ml。標(biāo)記為B試液。
[0045]c.0.5M的磷酸鹽緩沖液:
[0046]取342.5ml的A試液與157.5ml的B試液混勻。標(biāo)記為C試液.[0047]d.0.05M的中性緩沖液:
[0048]取C試液500ml加入到4000ml的蒸餾水中。用精密pH計(jì)測(cè)定其pH值，必要時(shí)用3M的鹽酸溶液或3M氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.0后再定容至5000ml。搖勻后標(biāo)記為0.05M中性緩沖液，同時(shí)標(biāo)記pH = 6.0、配制日期。在4°C條件下保存。[0049]e.200g/L氫氧化鈉溶液:稱取氫氧化鈉200.0g加水溶解,定容至1000ml。
[0050]2.4.310mg/ml CMC 溶液:
[0051]精密稱取CMC(sigma c-5678) 1.0OOOg緩慢加入到80mL0.05M的中性緩沖液(d)中，磁力攪拌至完全溶解(室溫下2小時(shí)左右)。用3M鹽酸溶液或3M氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.0，再用0.05M的中性緩沖液(d)定容至100mL。標(biāo)記為10mg/ml CMC溶液，同時(shí)標(biāo)記PH及配制日期。4°C條件下保存，有效期7天。
[0052]2.4.410mg/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液:
[0053]精密稱取無(wú)水葡萄糖1.0OOOg置80ml蒸餾水中攪拌溶解，待完全溶解后定容至100ml0標(biāo)記為10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，同時(shí)標(biāo)記配制日期，4°C條件下保存。
[0054]2.4.0TNS試劑的配制[0055]稱取3，5-二硝基水楊酸31.50g緩慢加入5000ml蒸餾水中，不斷攪拌，水浴至45°C，逐步加入1000ml氫氧化鈉溶液(e)，不斷攪拌至溶液清澈透明(在加入氫氧化鈉溶液過(guò)程中，溶液溫度不要超過(guò)48°C ) ο再逐步加入四水酒石酸鉀鈉910.0g、苯酚25.0g、無(wú)水亞硫酸鈉25.0g,繼續(xù)45°C水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)水3000ml,不斷攪拌,至上述物質(zhì)完全溶解后，冷卻至室溫，并定容到10000ml。用濾布過(guò)濾，將濾液儲(chǔ)存于棕色瓶中，標(biāo)識(shí)名稱和配制日期，避光，室溫保存7天后可以使用，有效期6個(gè)月。
[0056]本發(fā)明的有益效果:
[0057]首先提供了一株高產(chǎn)中性纖維素酶的菌株及用該菌為出發(fā)菌株采用液態(tài)發(fā)酵制備中性纖維素酶的方法。本發(fā)明的菌種和發(fā)酵產(chǎn)酶方法具有如下特點(diǎn):
[0058]1、發(fā)酵性能穩(wěn)定，菌體易于培養(yǎng)。
[0059]2、產(chǎn)酶周期短，在第6天即可停止發(fā)酵。
[0060]3、產(chǎn)酶活力高，最高可達(dá)5000IU/L以上。
[0061]4、粗酶液中中性纖維素酶含量在胞外成為主導(dǎo)產(chǎn)物，便于分離純化。
[0062]5、粗酶性質(zhì)穩(wěn)定,最適溫度為55度,較耐熱。
[0063]6、作用底物和條件更溫和廣泛，具有更廣闊的應(yīng)用前景。
[0064]7、填補(bǔ)了我國(guó)中性纖維素酶發(fā)酵水平低需依賴進(jìn)口的空白。
[0065]因此本發(fā)明的菌株和發(fā)酵產(chǎn)中性纖維素酶的方法所生產(chǎn)出來(lái)的中性纖維素酶可廣泛使用于紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，并可替代價(jià)格昂貴的進(jìn)口中性纖維素酶，因此本發(fā)明的菌種和發(fā)酵產(chǎn)酶方法有廣泛的工業(yè)使用價(jià)值和顯著的經(jīng)濟(jì)效益前景。
[0066]附圖表說(shuō)明
[0067]圖1和圖2分別為Trichodema reesei QZ-5菌株平板菌落和掃描電鏡形態(tài)。
[0068]序列表為Trichodema reesei QZ-5 菌株的 18S rDNA 序列鑒定。
[0069]生物材料樣品保藏
[0070]Trichodema reesei QZ-5已保存于已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2012204，保藏日期 2012 年 6 月 5 日。
【具體實(shí)施方式】
[0071]實(shí)施例1
[0072]取斜面菌種一環(huán)在PDA平板上點(diǎn)接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無(wú)菌水沖洗，并打碎成均勻的孢子懸液，取Iml孢子懸液接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，準(zhǔn)備若干份。培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30度，恒溫培養(yǎng)3天，即為發(fā)酵種子液。
[0073]在7L發(fā)酵罐中裝入5L產(chǎn)酶培養(yǎng)基，再加入2.5ml消泡劑，121°C滅菌30分，冷卻后，按10%接種量，加入500ml上述發(fā)酵種子液，培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速200r/min，溫度30°C，通氣量1.2L/min/L，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間150小時(shí)后，提取粗酶液，并按測(cè)酶活方法測(cè)酶活，發(fā)酵液酶活力達(dá)5080IU/L。
[0074]產(chǎn)酶培養(yǎng)基為玉米衆(zhòng)30g/L、麩皮10g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏0.5g/L,蛋白胨3g/L，硫酸銨 2g/L，磷酸二氫鉀 3g/L, CaCl2.2Η200.3g/L, MgSO4.7Η200.3g/L, FeSO4.7Η200.005g/L, MnSO4.H2O0.016g/L, ZnSO`4.7`Η200.0014g/LCoCl2`0.002g/L,吐溫-800.2g/L。
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)纖維素酶的木酶屬里氏木酶菌株，命名為Trichodema reeseiQZ-5,已保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2012204，保藏日期2012年06月05曰。
2.用權(quán)利要求1所述的菌株發(fā)酵產(chǎn)中性纖維素酶的方法，其特征在于用該菌為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和以玉米漿、硫酸銨等為氮源，以葡萄糖、麩皮等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)中性纖維素酶工藝為: (1)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基:葡萄糖15g/L,酵母膏2g/L,蛋白胨3g/L,硫酸銨2g/L,磷酸二氫鉀3g/L,CaCl2.2H200.3g/L, MgSO4.7H200.3g/L。 接種工藝:取斜面菌種一環(huán)在PDA平板上點(diǎn)接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無(wú)菌水沖洗，并打碎成均勻的孢子懸液.取Iml孢子懸液接入250ml規(guī)格的三角瓶，裝液量為50ml。 培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30°C，恒溫培養(yǎng)2天，即為發(fā)酵產(chǎn)酶的種子。 (2)產(chǎn)酶培養(yǎng) 產(chǎn)酶培養(yǎng)基:玉米衆(zhòng)30g/L、麩皮10g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏0.5g/L,蛋白胨3g/L,硫酸銨 2g/L,磷酸二氫鉀 3g/L, CaCl2.2Η200.3g`/L, MgSO4.7Η200.3g/L, FeSO4.7Η200.005g/L,MnSO4.H2O0.016g/L, ZnSO4.7Η200.0014g/LCoCl20.002g/L,吐溫-800.2g/L。pH:自然。 發(fā)酵罐:規(guī)格為7L容量.實(shí)際發(fā)酵裝液量為5L。 發(fā)酵參數(shù):接種量10%，轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30度.通氣量1.2L/min/L.培養(yǎng)時(shí)間150小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK103509721SQ201210211311
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月26日
【發(fā)明者】李洪兵, 張峰, 張明, 胡永明 申請(qǐng)人:湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司