轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因檢測用的檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測方法。方法包括PCR擴增反應液和上游引物Te9-F：5’-TTTGAGAATGAACAAAAGGACCATAT-3’；下游引物Te9-R：5’-GG?TTTTCGCTATCGAACTGTGA-3’；Taqman-MGB探針Te9-MGBP：FAM-ATTCATTAACTCTTCTCCATCC-MGB。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測方法包括轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品DNA的提取、Te9基因的實時熒光PCR擴增和使用熒光定量PCR儀隨機軟件分析擴增結(jié)果并進行結(jié)果判定。其優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便。
【專利說明】轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因檢測用的檢測方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測用檢測方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]在發(fā)展中國家，人口增長和食物短缺的矛盾日益尖銳，同時伴隨著耕地減少、生物種植和生存環(huán)境的惡化，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是解決這些問題的最有效途徑，轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅極大地提高了作物育種的效率，育成了一些具有突出特點的新品種，而且轉(zhuǎn)基因作物無論是在產(chǎn)量、品質(zhì)還是抗逆能力等方面都有顯著的優(yōu)勢，更突出的是轉(zhuǎn)基因技術(shù)可極大地降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成本，緩解不斷惡化的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境。自1983年第一例轉(zhuǎn)基因植株問世以來，世界已在35個科120多個種中獲得了轉(zhuǎn)基因植株，主要集中在大豆、玉米、油菜、棉花、馬鈴薯、西瓜、西葫蘆和木瓜上。
[0003]在享有轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶來的巨大實惠的同時，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品潛在的生態(tài)安全、食品安全問題也日益引起人們的關(guān)注，各國紛紛制定相應的法律法規(guī)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行監(jiān)管。除美國、加拿大、阿根廷和中國香港特區(qū)實行自愿標識制度外，國際上大多數(shù)國家如歐盟各國、匈牙利、瑞士、波蘭、日本、韓國等均制定了強制性標識制度。我國于2001年、2002年頒布實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》及《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，啟動了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)督監(jiān)管機制。我國政府規(guī)定，凡是列入標識管理目錄并用于銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物，應當加以標識，未標識和不按規(guī)定標識的，不得進口和銷售，因此，必須對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行有效的檢測。
[0004]目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測，主要采用蛋白檢測和DNA檢測的方法。兩類方法，對于不同產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢出和定量檢測，各有優(yōu)、缺點。以DNA為測試對象的方法與以蛋白為測試對象的方法相比，在產(chǎn)品成分復雜的情況下，目標DNA可以有效提取，受產(chǎn)品機制的影響較??；此外，DNA比較穩(wěn)定，不像蛋白質(zhì)組成那樣易受加工工藝的影響。Te9基因為來源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的終止子，可作為轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的篩選基因，利用熒光PCR技術(shù)檢測具有靈敏、特異的優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測技術(shù)，具體地說是用實時熒光PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測用方法，以克服基于蛋白的檢測方法在某些產(chǎn)品檢測中的局限性，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測提供有效工具，從而加強轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)督監(jiān)管，確保產(chǎn)品標簽的一致性，保護消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)。
[0006]本發(fā)明的主要原理為:針對保守序列設(shè)計一組引物(上游引物:Te9_F:5，-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3 ;下游引物 Te9_R:5，-ggttttcgctatcgaactgtga-3?；Taqman-MGB 探針 Te9_MGBP:FAM_attcattaactcttctccatcc_MGB。)。進行核算檢測時，模板DNA經(jīng)加熱至94-95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman-MGB探針與模板特異性集合。MGB探針的5端標記有報告集團，3端由非熒光淬滅集團，同時還連接有MGB修飾集團(MinorGroove Binder)。當探針完整的時候,報告集團所發(fā)射的突光能被淬滅集團吸收,儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結(jié)合的探針時，其3’一 5’外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告集團原理淬滅集團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。隨著PCR循環(huán)的增加，目的片段成指數(shù)增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反映模板數(shù)量。
[0007]本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測方法，其中的試劑包括如下:
[0008](I) PCR擴增反應液A
[0009]包括10父？0?反應緩沖液、0.1-0.411111101/1dNTP、2_4mmol/L硫酸鎂、1-2U Taq 酶、
0.2-0.6ymol/L 上游引物、0.2-0.6 μ mol/L 下游引物、0.2-0.6ymol/L Taqman-MGB 探針；
[0010]其中IOXPCR反應緩沖液含有100mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和I %曲拉通X-100 ;
[0011]上游引物Te9-F:5，-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3?；下游引物 Te9-R:5，-ggttttcgctatcgaactgtga-3，；Taqman_MGB 探針 Te9_MGBP:FAM_attcattaactcttctccatcc-MGBo
[0012]其中上游引物、下游引物、Taqman-MGB探針的體積比為:1:1:1;
[0013]其中dNTP內(nèi)的四種脫氧 核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
[0014]⑵陽性對照DNA
[0015]上面所述PCR擴增反應液A，每管24 μ L的最佳組成為:2.5μ L IOXPCR反應緩沖液、2 μ L 2.5mmol/LdNTP(四種脫氧核糖核酸的混合物)、2 μ L 25mmol/L硫酸鎂、I μ L1(^11101/1上游引物、14 1^ 1(^11101/1下游引物、14 1^ 10ymol/L Taqman-MGB探針、0.3 μ LTaq 酶、14.2μ L ddH20。
[0016]使用上述試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品中Te9基因的方法，依次包括下列步驟
(1)-(3):
[0017](I)待檢樣品DNA的提取
[0018]DNA提取可采用DNA提取試劑盒。
[0019](2)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品中Te9基因的實時熒光PCR擴增
[0020]A.在裝有24 μ L PCR擴增反應液A的反應管中加入I μ L待檢樣品DNA，混勻。
[0021]B.將PCR反應管放入熒光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0022]95 0C 3min，l 個循環(huán)；
[0023]95°C 30s, 60°C 30s，共 40 個循環(huán)。
[0024](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結(jié)果。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0026]實施例1
[0027]按下述方法檢測轉(zhuǎn)基因油菜GT73，使用MSlxRFl、MSIxRF2、MS8xRF3轉(zhuǎn)基因油菜品系做陰性對照:[0028]包括10XPCR 反應緩沖液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸鎂、1.5U Taq酶、0.4ymol/L 上游引物 Te9-F:5，-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3，；下游引物 Te9_R:5，-ggttttcgctatcgaactgtga-3，；Taqman-MGB 探針 Te9_MGBP:FAM-attcattaactcttctccatcc-MGB。其中 10XPCR 反應緩沖液含有 10Ommol /I, ρΗ8.8 的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X-100 ；
[0029]按照以下程序進行檢測:
[0030](I)待測轉(zhuǎn)基因植物樣品DNA的提取
[0031]采用安比奧試劑盒(GenoDNAPlant Mini Kit)
[0032]A.充分研磨
[0033]B.最多每75mg鮮料或 15mg干材料樣品中加400 μ g Buffer API, 0.5 μ I RNaseA,充分混勻；
[0034]C.在65°C培養(yǎng)lOmin，期間上下顛倒離心管2-3次；
[0035]D.力[]130μ1 Buffer AP2,混勻，冰上放置 5min, 14000rpm 離心 5min ;
[0036]E.將上清轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管內(nèi)，加1.5倍體積的Buffer AP3/E,顛倒3-4次，混勻；
[0037]F.把溶液小心轉(zhuǎn)入2ml收集管的吸附柱內(nèi)，1000Orpm離心lmin，如果一次離不完，
可多次加樣直至過柱完成，倒掉收集管中的液體；
[0038]G.加 500 μ I Buffer AWl, 1000Orpm 離心 lmin,倒掉收集管中的液體；
[0039]H.加 500 μ I Buffer AW2, 1000Orpm 離心 lmin,倒掉收集管中的液體;
[0040]1.重復8步一次；
[0041]J.14000rpm離心3min,將離心柱轉(zhuǎn)移至一干凈1.5ml離心管內(nèi)；
[0042]K.小心加50-100 μ I Buffer AE至吸附柱濾膜上,室溫靜置l_5min, 1000Orpm離心lmin ;4°C保存。也可等同采用CTAB法。
[0043](2)待測轉(zhuǎn)基因植物樣品DNA的實時熒光PCR擴增
[0044]A.在PCR反應管中加入24 μ L PCR反應液A和I μ L樣品DNA，混勻。
[0045]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0046]95°C 3min, I 個循環(huán)；
[0047]950C 30s, 600C 30s，共 40 個循環(huán)。
[0048](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結(jié)果。
[0049]實施例2
[0050]按下述方法檢測轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788，使用MSlxRFl、MSIxRF2、MS8xRF3轉(zhuǎn)基因油菜品系做陰性對照:
[0051]包括10XPCR 反應緩沖液、0.2mmol/L dNTP、2mmol/L 硫酸鎂、1.5U Taq酶、0.4ymol/L 上游引物 Te9-F:5，-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3，；下游引物 Te9_R:5，-ggttttcgctatcgaactgtga-3，；Taqman-MGB 探針 Te9_MGBP:FAM-attcattaactcttctccatcc-MGB。其中 10XPCR 反應緩沖液含有 10Ommol /I, ρΗ8.8 的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1%曲拉通X-100 ；
[0052]按照以下程序進行檢測:
[0053](I)待測轉(zhuǎn)基因植物樣品DNA的提取[0054]采用安比奧試劑盒(GenoDNAPlant Mini Kit)
[0055]A.充分研磨
[0056]B.最多每75mg鮮料或 15mg干材料樣品中加400μ g Buffer ΑΡΙ,Ο.5μ I RNaseA,充分混勻；
[0057]C.在65°C培養(yǎng)lOmin，期間上下顛倒離心管2-3次；
[0058]D.力[]130μ1 Buffer AP2,混勻，冰上放置 5min, 14000rpm 離心 5min ;
[0059]E.將上清轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管內(nèi)，加1.5倍體積的Buffer AP3/E,顛倒3-4次，混勻；
[0060]F.把溶液小心轉(zhuǎn)入2ml收集管的吸附柱內(nèi)，1000Orpm離心lmin，如果一次離不完，
可多次加樣直至過柱完成，倒掉收集管中的液體；
[0061]G.加 500 μ I Buffer AWl, 1000Orpm 離心 lmin,倒掉收集管中的液體；
[0062]H.加 500 μ I Buffer AW2, 1000Orpm 離心 lmin,倒掉收集管中的液體;
[0063]1.重復8步一次；
[0064]J.14000rpm離 心3min,將離心柱轉(zhuǎn)移至一干凈1.5ml離心管內(nèi)；
[0065]K.小心加50-100 μ I Buffer AE至吸附柱濾膜上，室溫靜置l_5min, 1000Orpm離心lmin;4°C保存。也可等同采用CTAB法。
[0066](2)待測轉(zhuǎn)基因植物樣品DNA的實時熒光PCR擴增
[0067]A.在PCR反應管中加入24 μ L PCR反應液A和I μ L樣品DNA，混勻。
[0068]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0069]95°C 3min, I 個循環(huán)；
[0070]950C 30s, 600C 30s，共 40 個循環(huán)。
[0071](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結(jié)果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0072]圖1油菜GT73熒光PCR產(chǎn)物的曲線圖。圖中坐標軸以外實橫線以上為陽性樣品，以下為陰性樣品或空白對照。
[0073]圖2大豆M0N89788熒光PCR產(chǎn)物的曲線圖。圖中坐標軸以外實橫線以上為陽性樣品，以下為陰性樣品或空白對照。
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測方法，其特征在于其中的引物和探針:
上游引物 Te9-F 5’ -TTTGAGAATGAACAAAAGGACCATAT-3’ ；
下游引物 Te9-R:5’ -TTACTGTGTTTTTTATTCGGTTTTCG-3’。
探針 Te9-MGBP:F AM-ATTCATTAACTCTTCTCCATCC-MGB
2.一種使用權(quán)利要求一所述的快速檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的方法，其特征是依次包括下列步驟: (1)待檢樣品的DNA提?。? (2)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的實時熒光PCR擴增: 在裝有24 μ L的PCR擴增反應液的反應管中加入I μ L的待檢樣品DNA，混勻。按照下述步驟完成PCR擴增。
，95 0C 3min，l 個循環(huán)；
， 950C 30s, 600C 30s，共 40 個循環(huán)。 (3)使用擴增曲線分 析PCR 產(chǎn)物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484528SQ201210202227
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月13日
【發(fā)明者】王述柏, 高宏偉, 周茜, 孫敏 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學, 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心