專利名稱：一種抑制結核分枝桿菌的化合物、其篩選方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法、采用所述篩選方法篩選所得抑制結核分枝桿菌的化合物以及該化合物的用途。
背景技術：
結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的傳染性疾病。根據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界約有1/3人口感染結核菌，每年約有880萬新發(fā)病例，200萬人因結核病而死亡。目前結核病治療藥物需長期使用，對人體的傷害很大，而且感染菌可在宿主的干酪化的病灶中長期潛伏而成為休眠菌，一旦防御免疫機能低下即可“死灰復燃”而重 新發(fā)病。目前多重耐藥結核分枝桿菌的出現(xiàn)及結核菌在患者體內的“持留”狀態(tài)，已經成為結核病預防和治療過程中的重大問題。因此，尋找新的藥物作用靶點，建立新的藥物篩選模型，研制出能控制多重耐藥性結核桿菌和根除休眠菌的強力低毒抗結核藥物非常關鍵。目前尋找新型抗結核藥物的方法大多限于藥敏試驗，但是結核分枝桿菌由于生長速度緩慢，一次藥敏試驗周期長達3-4周，不適于大規(guī)模篩選，也難發(fā)現(xiàn)新型藥物。傳統(tǒng)抗結核藥物通過抑制細胞壁合成或細菌生長來殺滅MTB，但同時會產生MTB選擇性壓力。靶向分泌型毒力因子的藥物有效解決了這個問題，也避免了藥物通過細胞壁時產生滲透性障礙。對于免疫系統(tǒng)受到損害的患者(如HIV感染者)及高風險感染TB的醫(yī)務工作者，這些藥物也能降低感染幾率。此類抑制劑與傳統(tǒng)的抗生素聯(lián)用還可以有效清除感染，減少MTB抗性產生。mPTPA/mPTPB是MTB的分泌型毒力因子，以mPTPA/mPTPB為藥物靶標篩選出很多有應用前景的抑制劑，預示著未來TB治療的可選擇性。目前很多mPTPA/mPTPB的抑制劑有進一步發(fā)展的潛力。新發(fā)現(xiàn)的有雙位點活性的isoxazole-salicylate化合物具有細胞活性，在感染MTB的巨噬細胞內證明了其治療效應。與對照相比，消減了巨噬細胞內MTB90%的生長。其獨特雙位點結合抑制模型是其較高活性及選擇性的結構基礎，這種結構也為以后設計新抑制劑提供了思路。但是，更多的抑制劑由于缺乏晶體結構信息，阻礙了它們的進一步優(yōu)化。作為判斷治療藥物的標準，對抑制劑與靶標結合復合物進行晶體結構研究及動物模式實驗是目前急需的。酪氨酸磷酸酶能特異地水解蛋白質底物上的酪氨酸磷酸酯鍵，脫去磷酸，從而調節(jié)該蛋白質功能的酶。蛋白酪氨酸殘基的磷酸化作用對于調節(jié)生理應答過程起著重要作用，例如細胞增殖和分化、細胞遷移、免疫細胞活化和凋亡等。因此，如果細胞中的酪氨酸磷酸化作用失調會引起嚴重的后果，包括可能會引起自體免疫、非正常代謝應答和細胞轉化等，隨之而來的是許多疾病的產生，包括癌癥，糖尿病和自身免疫缺陷。有報道PTPB特異性抑制劑有望提高胰島素的敏感性，有效地治療2型糖尿病、胰島素抵抗和肥胖癥。這就提示我們，酪氨酸酶抑制劑可能在治療誘因是mPTPB引起的疾病方面也有顯著效果，包括糖尿病、肥胖、高脂血、高甘油三酯血、高膽固醇血、低HDL水平、動脈粥樣硬化、血管再狹窄、炎性腸病、胰腺炎、脂肪細胞腫瘤、脂肪細胞癌、脂肉瘤、血脂異常、腫瘤、癌癥，自身免疫疾病等。
結核病作為全球性的公共健康問題，通過借鑒抗癌藥物研究成果及研究思路，結合癌細胞中蛋白磷酸酶的信號機制及抑制劑篩選的方法，有助于加速新的抗結核藥物面市。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法；同時本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法篩選得到的抑制結核分枝桿菌的化合物，以及所述化合物的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為一種抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法，包括以下步驟(I)建立以酪氨酸磷酸酶為靶點的篩選模型以結核菌H37Rv株基因組DNA為模板，PCR克隆酪氨酸磷酸酶基因，轉化寄主細胞，培養(yǎng)轉化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酪氨酸磷酸酶，進行酶活分析，建立以酪氨酸磷酸酶為靶點的篩選模型；
(2)利用步驟(I)所建立的篩選模型篩選對酪氨酸磷酸酶具有抑制活性的化合物。作為本發(fā)明所述抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(O中采用的宿主細胞為大腸桿菌，用表達載體的目的片段經雙酶切，與pET-28a(+)載體連接，轉化至大腸桿菌BL21，經IPTG誘導，得到高效可溶性表達，獲得重組酪氨酸磷酸酶。作為本發(fā)明所述抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法的優(yōu)選實施方式，所述的IPTG終濃度為O. I O. 2mM,誘導溫度為18 37°C。作為本發(fā)明所述抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(I)中采用酪氨酸磷酸酶試劑盒(RediPlate. % Fn/Chek. TyrosinePhosphatase AssayKit, Molecular Probes, Inc)對重組酪氨酸磷酸酶進行酶活分析。同時，本發(fā)明還提供一種抑制結核分枝桿菌的化合物，所述化合物采用上述的篩選方法篩選得到。所述化合物的作用靶點為酪氨酸磷酸酶。所篩選得到的化合物具有抗結核分枝桿菌的功效，能夠有效抑制酪氨酸磷酸酶活性。所述化合物命名為Bostrycin。作為本發(fā)明所述抑制結核分枝桿菌的化合物的優(yōu)選實施方式，所述化合物命名為Bostrycin,所述化合物的分子結構式為
O OH OH O OH
O作為本發(fā)明所述抑制結核分枝桿菌的化合物的優(yōu)選實施方式，所述化合物是海洋微生物天然代謝活性產物。作為本發(fā)明所述抑制結核分枝桿菌的化合物的優(yōu)選實施方式，所述化合物抑制結核分枝桿菌的最低濃度為7. 5 μ g/mL，此結果采用微量刃天青法測定所得。作為本發(fā)明所述抑制結核分枝桿菌的化合物的優(yōu)選實施方式，所述化合物的作用靶點為酪氨酸磷酸酶。所述化合物的作用靶點的驗證方法包括以下步驟
( I)利用權利要求I中步驟(I)所建立的模型驗證化合物對酪氨酸磷酸酶的酶活抑制活性；(2)利用Docking軟件進行生物信息學預測，化合物與酪氨酸磷酸酶相互作用；(3)利用熒光光譜驗證，化合物與酪氨酸磷酸酶相互作用；(4)利用圓二色譜驗證，化合物 酪氨酸磷酸酶相互作用。本發(fā)明還提供了如上所述抑制結核分枝桿菌的化合物在制備用于治療誘因或誘因之一是酪氨酸磷酸酶的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明所述抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法，首先建立以酪氨酸磷酸酶為靶點的篩選模型，建立的篩選模型能快速、高效篩選具有抗結核分枝桿菌功效的酪氨酸磷酸酶抑制劑，減少工作量，加快工作效率，提高獲得陽性實驗結果的幾率。采用本發(fā)明所述篩選方法篩選得到的化合物，具有抗結核分枝桿菌的功效，以酪氨酸磷酸酶為作用靶點，能夠有效抑制酪氨酸磷酸酶活性，具有較大的臨床應用前景和潛力。


圖I為本發(fā)明抑制結核分枝桿菌的化合物的分子結構式。圖2為結核分枝桿菌H37Rv基因組中酪氨酸磷酸酶在E. coli BL21 (PlysS)中表達圖；圖2中，M為標準蛋白分子量maker，I為重組蛋白粗提物，2為純化的重組蛋白。圖3為不同濃度酪氨酸磷酸酶酶活圖；圖3中，從^Te，酪氨酸磷酸酶濃度呈10倍增加。圖4為基于酪氨酸磷酸酶活性的抑制劑篩選圖；圖4中，I號為空白對照，2號為原礬酸鈉正對照，3號為陰性對照，Γ29號為所篩選的化合物。圖5為基于酪氨酸磷酸酶活性的抑制劑篩選圖；圖5中，30號為空白對照，31號為原礬酸鈉正對照，32號為陰性對照，33 59號為所篩選的化合物。圖6為部分化合物抑制結核分枝桿菌H37Ra的效果圖；圖6中，37代表化合物Bostrycin, 38 41代表Bostrycin的衍生物。圖7為部分化合物抑制結核分枝桿菌H37Ra的效果圖；圖7中，42 44代表Bostrycin的衍生物，45代表藥物利福平，46代表溶解化合物的溶劑DMSO。圖8為Bostrycin與mPTPB相互作用示意9為25°C時不同濃度比的化合物Bostrycin與酪氨酸磷酸酶mPTPB相互作用的熒光發(fā)射光譜圖；圖 9 中，a 0 ；b :0· 25 ；c :0· 5 ；d :0· 75 ；e :1 ；f I. 25 ；g :1. 5。圖10為25°C時不同濃度比的DMSO與酪氨酸磷酸酶mPTPB相互作用的熒光發(fā)射光譜；圖 10 中，a 0 ；b :0· 25 ；c :0· 5 ；d :0· 75 ；e :1 ；f I. 25 ；g :1. 5。圖11為不同濃度比的化合物Bostrycin與酪氨酸磷酸酶mPTPB相互作用的⑶光譜圖；圖11 中，a 0 ；b :0· 5 ；c :1 ；d :1. 5。圖12為不同濃度比的甲醇與酪氨酸磷酸酶mPTPB相互作用的⑶光譜圖；圖 12 中，a :0 ;b :0. 5 ;c :1 ;d :1· 5。
具體實施例方式為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面將結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例I抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法中篩選模型的建立本實施例以酚氯仿抽提法提取了結核菌H37Rv基因組DNA，并以之為模板，PCR克隆mptpb基因，使其在E. coli BL21 (PlysS)中高效表達，見附圖2 所示，利用鎳離子親和層析柱純化得到mPTPB蛋白，利用酪氨酸磷酸酶試劑盒(RediPlate. 96 EnzChek TyrosinePhosphatase Assay Kit, Molecular Probes, Inc)進行酶活分析,建立了以酪氨酸憐酸酶為靶點的篩選模型。不同濃度的酪氨酸磷酸酶酶活如附圖3所示。實施例2抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法中篩選模型的應用I、抑制劑篩選利用實施例I建立的以酪氨酸磷酸酶為靶點的篩選模型，對化合物抑制酪氨酸磷酸酶mPIPB酶活性進行分析，采用酪氨酸磷酸酶試劑盒(RediPlate. 96 EnzChek(R)Tyrosine Phosphatase Assay Kit, Molecular Probes, Inc),對 84 種分離自海洋真菌的化合物及其衍生物進行了篩選，其中42種化合物具有酶的抑制活性，對H37Ra進行的藥敏試驗和MIC試驗發(fā)現(xiàn)有39種具有抑菌圈。其中，化合物Bostrycin (分子結構式見附圖I所示)及其衍生物，抑制酶活性與抑菌圈的出現(xiàn)有較強的相關性，說明該藥物的作用靶點為mPTPB。本實施例所用抑制mPTPB酶活性的正對照為原釩酸鈉(Na3VO4),試驗設計詳見表
Io表I篩選新型抗結核藥物試驗設計
權利要求
1.一種抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)建立以酪氨酸磷酸酶為靶點的篩選模型以結核菌H37RV株基因組DNA為模板，PCR克隆酪氨酸磷酸酶基因，轉化寄主細胞，培養(yǎng)轉化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酪氨酸磷酸酶，進行酶活分析，建立以酪氨酸磷酸酶為靶點的篩選模型； (2)利用步驟(I)所建立的篩選模型篩選對酪氨酸磷酸酶具有抑制活性的化合物。
2.如權利要求I所述的抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法，其特征在于，所述步驟(O中采用的宿主細胞為大腸桿菌，用表達載體的目的片段經雙酶切，與pET-28a(+)載體連接，轉化至大腸桿菌BL21，經IPTG誘導，得到高效可溶性表達，獲得重組酪氨酸磷酸酶。
3.如權利要求I所述的抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法，其特征在于，所述步驟(I)中采用酪氨酸磷酸酶試劑盒對重組酪氨酸磷酸酶進行酶活分析。
4.一種抑制結核分枝桿菌的化合物，其特征在于，所述化合物采用權利要求I中的方法篩選得到。
5.如權利要求3所述的抑制結核分枝桿菌的化合物，其特征在于，所述化合物命名為Bostrycin,所述化合物的分子結構式為
6.如權利要求4或5所述的抑制結核分枝桿菌的化合物，其特征在于，所述化合物是海洋微生物天然代謝活性產物。
7.如權利要求4或5所述的抑制結核分枝桿菌的化合物，其特征在于，所述化合物抑制結核分枝桿菌的最低濃度為7. 5 μ g/mL。
8.—種如權利要求4或5所述的化合物，其特征在于，所述化合物的作用靶點為酪氨酸磷酸酶。
9.一種如權利要求8所述的化合物，其特征在于，所述化合物的作用靶點的驗證方法包括以下步驟 (1)利用權利要求I中步驟(I)所建立的模型驗證化合物對酪氨酸磷酸酶的酶活抑制活性； (2)利用Docking軟件進行生物信息學預測，化合物與酪氨酸磷酸酶相互作用； (3)利用熒光光譜驗證，化合物與酪氨酸磷酸酶相互作用； (4)利用圓二色譜驗證，化合物與酪氨酸磷酸酶相互作用。
10.一種如權利要求4或5所述化合物在制備用于治療誘因或誘因之一是酪氨酸磷酸酶的疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開一種抑制結核分枝桿菌化合物的篩選方法，包括以下步驟(1)建立以酪氨酸磷酸酶為靶點的篩選模型以結核菌H37Rv株基因組DNA為模板，PCR克隆酪氨酸磷酸酶基因，轉化寄主細胞，培養(yǎng)轉化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酪氨酸磷酸酶，進行酶活分析，建立以酪氨酸磷酸酶為靶點的篩選模型；(2)利用步驟(1)所建立的篩選模型篩選對酪氨酸磷酸酶具有抑制活性的化合物。采用所述方法能快速、高效篩選具有抗結核分枝桿菌功效的酪氨酸磷酸酶抑制劑。另外，本發(fā)明還公開了一種采用所述篩選方法篩選得到的化合物，以及所述化合物在制備用于治療誘因或誘因之一是酪氨酸磷酸酶的疾病的藥物中的用途。
文檔編號C12Q1/02GK102732474SQ20121016114
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權日2012年5月21日
發(fā)明者佘志剛, 牛長紅, 陸勇軍, 陳洪 申請人:中山大學