專(zhuān)利名稱(chēng)：一種奇異變形桿菌菌株及其轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)s-雌馬酚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)菌株(LH-52)及該菌株將大豆中富含的大豆苷元(daidzein)直接轉(zhuǎn)化為高活性植物雌激素S-雌馬酚(S-equol)的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大豆異黃酮具有與雌激素雌二醇類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，被廣泛稱(chēng)為“植物雌激素(phytoestrogen)”。大量的研究發(fā)現(xiàn)以大豆苷元(daidzein)和染料木素(genistein)為主要成分的大豆異黃酮具有非常廣泛的生物學(xué)活性，除了雌激素樣作用外還具有抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等功能。雌馬酚(equol)為大豆苷元的腸道菌代謝產(chǎn)物，相對(duì)于大豆苷元和染料木素而言，雌馬酚具有更高的雌激素活性和抗氧化活性。病理學(xué)研究表明equol在預(yù) 防乳腺癌，前列腺癌，骨質(zhì)疏松癥以及更年期綜合癥方面有顯著療效。特別是作為雌二醇類(lèi)似物，可以與雌激素受體結(jié)合，在治療更年期綜合癥以及乳腺增生、乳腺癌等雌激素分泌失調(diào)疾病上有顯著療效。然而Lampe Jff, Karr SC, Hutchins AM等的研究表明，由于腸道菌群、飲食結(jié)構(gòu)等的不同，大約只有309Γ45%的人群體內(nèi)能產(chǎn)生equol，也就是說(shuō)人類(lèi)攝入大豆制品或者大豆異黃酮后，并非所有人都能在體內(nèi)產(chǎn)生equol，對(duì)于非雌馬酚產(chǎn)生者而言攝入大豆制品或大豆異黃酮所產(chǎn)生的健康效應(yīng)相對(duì)弱于雌馬酚產(chǎn)生者。因此研究雌馬酚的合成機(jī)制及篩選生產(chǎn)菌種，進(jìn)一步合成高生物活性的雌馬酚對(duì)人類(lèi)健康而言具有重要的意義。雌馬酹具有兩種不同的手性結(jié)構(gòu)R-equol和S-equol,其中S_equol是生物天然合成的形態(tài)，與雌激素受體具有更強(qiáng)的結(jié)合力。S-equol對(duì)β_人體雌激素受體(β -Estrogen Receptor,簡(jiǎn)稱(chēng)β-ER)的親和力要比R-型雌馬酹高13倍、比消旋體雌馬酹(equol)高兩倍。雌馬酚的合成途徑目前主要有化學(xué)合成和生物合成兩種，其中化學(xué)方法合成的雌馬酚為外消旋體雌馬酚，而生物合成的雌馬酚全部為S-equol，因而生物合成法更適用于相關(guān)藥物和食品添加劑的生產(chǎn)。韓國(guó)專(zhuān)利PTC/KR2005/001285公布了一種能將二氫大豆苷元轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的革蘭氏陰性菌株Eggerthella Julong 732,但該菌株卻不能直接將大豆苷元轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚。二氫大豆苷元是大豆苷元的加氫還原產(chǎn)物，目前雖然能以大豆苷元為原料通過(guò)化學(xué)氫轉(zhuǎn)移法進(jìn)行合成，但價(jià)格昂貴。此外有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)混合菌培養(yǎng)，先將大豆苷元轉(zhuǎn)化為二氫大豆苷元然后再使用Eggerthella Julong 732將二氫大豆苷元轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚，但此方法混合菌的接種比例以及接種時(shí)機(jī)難以控制，并且培養(yǎng)條件苛刻，比較難以實(shí)現(xiàn)。國(guó)內(nèi)專(zhuān)利CN 101338294B和CN 102021130A描述的不動(dòng)桿菌AUH-JLM455以及雙酶梭菌菌株為嚴(yán)格厭氧菌，相比較而言本發(fā)明的奇異變形桿菌為兼性厭氧菌，培養(yǎng)條件更為粗放，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供了一種奇異變形桿菌菌株LH-52及其轉(zhuǎn)化大豆苷元(daidzein)生產(chǎn)S-雌馬酚的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚難以實(shí)現(xiàn)的問(wèn)題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉(zhuǎn)化為手性化合物S-雌馬酚的單一功能微生物菌株及其制備方法。相對(duì)于以往報(bào)道的嚴(yán)格厭氧雌馬酚轉(zhuǎn)化菌株以及混合菌轉(zhuǎn)化，本發(fā)明得到的奇異變形桿菌Proteus mirabilis LH-52菌株為兼性厭氧菌，更適合于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案—種奇異變形桿菌菌株LH-52,該LH-52菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC M 2011390，保藏日期為2011年11月13日。所述的奇異變形桿菌Proteus mirabilis菌株LH-52的制備方法如下I.樣品的采集 取大鼠腸道盲腸5厘米內(nèi)的腸道內(nèi)容物，懸浮于生理鹽水中，過(guò)濾去除其中的固形物，然后取濾液200微升接種于新鮮滅菌的液體培養(yǎng)基中37°C厭氧活化培養(yǎng)24小時(shí)。其中所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。2.樣品的抗生素抑制與特定功能菌株的分離篩選(I)樣品的抗生素抑制取100微升活化后菌株分別接種于新鮮滅菌并添加大豆苷元(終濃度為100微摩爾/升)以及分別對(duì)應(yīng)以下一種抗生素(所述的抗生素采用諾氟沙星、土霉素、琥乙紅霉素、硫酸慶大霉素)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C培養(yǎng)4天后用高效液相色譜儀檢測(cè)是否有雌馬酚產(chǎn)生，從而得出結(jié)論為添加土霉素的一組有雌馬酚產(chǎn)生。其中所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。(2)單一菌落的分離篩選用新鮮滅菌的液體培養(yǎng)基(所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27.5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。)將添加土霉素組的菌群液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e稀釋為 10-1、10_2、10' 10_4、I O-5、10' 10' 10_8、10_9、ΙΟ—1。倍，再分別取 40微升上述稀釋倍數(shù)的微生物菌群稀釋液均勻涂布在預(yù)先準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基(上述液體培養(yǎng)基添加15克/升的瓊脂)上，將涂布微生物菌群稀釋液的固體培養(yǎng)基于37°C厭氧培養(yǎng)12小時(shí)之后，從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落并劃線(xiàn)在斜面培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分同上述固體培養(yǎng)基)，37°C厭氧培養(yǎng)18 24小時(shí)，同時(shí)對(duì)單菌落進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)。(3)具有轉(zhuǎn)化功能的單菌落篩選準(zhǔn)備含100微摩爾/升大豆苷元并滅菌的新鮮液體培養(yǎng)基(所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。)，分裝入10毫升的厭氧瓶?jī)?nèi)，分別接種入已編號(hào)的單菌落并于37°C培養(yǎng)4天，然后用高效液相色譜儀檢測(cè)，結(jié)論為有雌馬酚生成的對(duì)應(yīng)單菌落即為具有轉(zhuǎn)化功能的單菌落。3.單一功能微生物菌種的純化培養(yǎng)、菌種初步鑒定與保藏(I)單菌落的純化培養(yǎng)
將篩選出的單一微生物菌落在固體培養(yǎng)基(上述液體培養(yǎng)基添加15克/升的瓊月旨)上反復(fù)純化培養(yǎng)3次，確保菌落形態(tài)一致，將純化的單一菌株接種到已滅菌的液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24小時(shí)，之后菌液添加30%甘油混合均勻并保藏在-83°C的超低溫冰箱內(nèi)，并定期進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化活性測(cè)定。(2)對(duì)篩選出的單一功能微生物菌株進(jìn)行菌種鑒定根據(jù)菌落及菌體形態(tài)、革蘭氏染色、常規(guī)生化鑒定以及16S rDNA基因測(cè)序等多項(xiàng)指標(biāo)，將分離到的功能菌株LH-52初步鑒定為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)菌株。本發(fā)明的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) LH-52具有以下微生物學(xué)特性I、形態(tài)學(xué)特征在顯微鏡下觀(guān)察在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株時(shí)，菌體呈桿狀，具有運(yùn)動(dòng)能力，菌體長(zhǎng)度3飛微米，革蘭氏染色陰性。 2、培養(yǎng)學(xué)特征在37°C下，固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明菌株呈膜狀的白色干燥菌落。3、生理特征本發(fā)明的菌株是一種兼性厭氧菌，在35 37°C下顯示最佳生長(zhǎng)能力，本發(fā)明的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) LH-52與奇異變形桿菌的生理生化特征上的異同見(jiàn)表I。一種奇異變形桿菌菌株轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法，包括以下步驟I)奇異變形桿菌菌株LH-52的培養(yǎng)將保藏號(hào)為CCTCC M 2011390的奇異變形桿菌菌株LH-52，37°C厭氧活化培養(yǎng)12 18小時(shí)后，接種于已滅菌的新鮮液體培養(yǎng)基。2)底物的加入采用大豆苷元(daidzein)作為底物；按照I : 100的接種量將步驟I)中菌液接種于含100微摩爾/升底物大豆苷元的滅菌液體培養(yǎng)基，繼續(xù)厭氧37°C培養(yǎng)4天，即可轉(zhuǎn)化底物為S-雌馬酚。3)代謝產(chǎn)物的分離純化將步驟2)中得到的培養(yǎng)物濃縮后用3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，然后加入100%純甲醇溶解，在半制備型高效液相色譜儀上可分離制備得到S-雌馬酚。所述步驟I)和步驟2)中的液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。代謝產(chǎn)物的手性純度檢測(cè)將培養(yǎng)物萃取液蒸干后，用100%純甲醇溶解，在Daicel OJ-H手性柱上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件如下A相為正己烷，B相為異丙醇，A:B=70:30，檢測(cè)器波長(zhǎng)280nm。對(duì)比外消旋標(biāo)準(zhǔn)品以及S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜確定產(chǎn)物的手性，并計(jì)算對(duì)映體過(guò)量值(％e. e)。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚難以實(shí)現(xiàn)的問(wèn)題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉(zhuǎn)化為手性化合物S-雌馬酚的單一功能微生物菌株及其制備方法。相對(duì)于以往報(bào)道的嚴(yán)格厭氧雌馬酚轉(zhuǎn)化菌株以及混合菌轉(zhuǎn)化，本發(fā)明得到的奇異變形桿菌Proteus mirabilis LH-52菌株為兼性厭氧菌,更適合于工業(yè)生產(chǎn)。


本發(fā)明的奇異變形桿菌LH-52菌株已于2011年11月13日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)保藏，保藏號(hào)為CCTCC M 2011390 ；表I是本發(fā)明奇異變形桿菌菌株LH-52與奇異變形桿菌的生理生化特征比較表；圖I為本發(fā)明實(shí)施例中大鼠腸道分離菌株LH-52轉(zhuǎn)化大豆苷元為S-雌馬酚的代謝過(guò)程圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例中大鼠腸道分離菌株LH-52轉(zhuǎn)化大豆苷元的發(fā)酵萃取液的HPLC圖譜；圖3為本發(fā)明實(shí)施例中大豆苷元與雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜；圖4為本發(fā)明實(shí)施例中大鼠腸道分離菌株LH-52轉(zhuǎn)化大豆苷元代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖；
圖5為本發(fā)明實(shí)施例中外消旋雌馬酚和大豆苷元的混合標(biāo)準(zhǔn)品手性柱HPLC圖譜；圖6為本發(fā)明實(shí)施例中S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品手性柱HPLC圖譜；圖7為本發(fā)明實(shí)施例中發(fā)酵萃取液手性柱HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)附圖和具體實(shí)施對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但并不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。本實(shí)施例的一種奇異變形桿菌菌株LH-52,該LH-52菌株于保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC M 2011390，保藏日期為2011年11月13日。所述的奇異變形桿菌Proteus mirabilis菌株LH-52的制備方法如下I.樣品的采集取大鼠腸道盲腸5厘米內(nèi)的腸道內(nèi)容物，懸浮于生理鹽水中，過(guò)濾去除其中的固形物，然后取濾液200微升接種于新鮮滅菌的液體培養(yǎng)基中37°C厭氧活化培養(yǎng)24小時(shí)。其中所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。2.樣品的抗生素抑制與特定功能菌株的分離篩選( I)樣品的抗生素抑制取100微升活化后菌株分別接種于新鮮滅菌并添加大豆苷元(終濃度為100微摩爾/升)以及分別對(duì)應(yīng)以下一種抗生素(所述的抗生素采用諾氟沙星、土霉素、琥乙紅霉素、硫酸慶大霉素)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C培養(yǎng)4天后用高效液相色譜儀檢測(cè)是否有雌馬酚產(chǎn)生，通過(guò)液相色譜圖比對(duì)，得出結(jié)論為添加土霉素的一組有雌馬酚產(chǎn)生。其中所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2.5克/升。(2)單一菌落的分離篩選用新鮮滅菌的液體培養(yǎng)基(所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27.5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。)將添加土霉素組的菌群液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e稀釋為 10-1、10_2、10' 10_4、I O-5、10' 10' 10_8、10_9、10_10 倍，再分別取 40微升上述稀釋倍數(shù)的微生物菌群稀釋液均勻涂布在預(yù)先準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基(上述液體培養(yǎng)基添加15克/升的瓊脂)上，將涂布微生物菌群稀釋液的固體培養(yǎng)基于37°C厭氧培養(yǎng)12小時(shí)之后，從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落并劃線(xiàn)在斜面培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分同上述固體培養(yǎng)基)，37°C厭氧培養(yǎng)18 24小時(shí)，同時(shí)對(duì)單菌落進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)。(3)具有轉(zhuǎn)化功能的單菌落的篩選準(zhǔn)備含100微摩爾/升大豆苷元并滅菌的新鮮液體培養(yǎng)基(所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。)，分裝入10毫升的厭氧瓶?jī)?nèi)，分別接種入已編號(hào)的單菌落并于37°C培養(yǎng)4天，然后用高效液相色譜儀檢測(cè)，通過(guò)液相色譜圖比對(duì)，得出的結(jié)論為有雌馬酚生成的對(duì)應(yīng)單菌落即為具有轉(zhuǎn)化功能的單菌落。3.單一功能微生物菌種的純化培養(yǎng)、菌種初步鑒定與保藏( I)單菌落的純化培養(yǎng) 將篩選出的單一微生物菌落在固體培養(yǎng)基(上述液體培養(yǎng)基添加15克/升的瓊月旨)上反復(fù)純化培養(yǎng)3次，確保菌落形態(tài)一致，將純化的單一菌株接種到已滅菌的液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24小時(shí)，之后菌液添加30%甘油混合均勻并保藏在_83°C的超低溫冰箱內(nèi)，并定期進(jìn)行平板劃線(xiàn)分離復(fù)壯培養(yǎng)以及用高效液相色譜對(duì)菌株轉(zhuǎn)化活性進(jìn)行測(cè)定。(2)對(duì)篩選出的單一功能微生物菌株進(jìn)行菌種鑒定根據(jù)菌落及菌體形態(tài)、革蘭氏染色、常規(guī)生化鑒定以及16S rDNA基因測(cè)序等多項(xiàng)指標(biāo)，將分離到的功能菌株LH-52初步鑒定為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)菌株。本發(fā)明的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) LH-52具有以下微生物學(xué)特性I、形態(tài)學(xué)特征在顯微鏡下觀(guān)察在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株時(shí)，菌體呈桿狀，具有運(yùn)動(dòng)能力，菌體長(zhǎng)度3飛微米，革蘭氏染色陰性。2、培養(yǎng)學(xué)特征在37 °C下，固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明菌株呈膜狀的白色干燥菌落。3、生理特征本發(fā)明的菌株是一種兼性厭氧菌，在35 37°C下顯示最佳生長(zhǎng)能力，本發(fā)明的奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) LH-52與奇異變形桿菌的生理生化特征上的異同見(jiàn)表I。本實(shí)施例的一種奇異變形桿菌菌株轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法，包括以下步驟I)將保藏號(hào)為CCTCC M 2011390的奇異變形桿菌菌株LH-52用接種環(huán)將2 3環(huán)奇異變形桿菌菌株P(guān)roteus mirabilis LH-52接種在10毫升滅菌的新鮮液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧活化培養(yǎng)12 18小時(shí)；所述的新鮮液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。2)底物的加入采用大豆苷元(daidzein)作為底物；按照I : 100的接種量接種于含100微摩爾/升底物大豆苷元的滅菌液體培養(yǎng)基，繼續(xù)37°C厭氧培養(yǎng)4天；即可轉(zhuǎn)化底物為S-雌馬酚。3)代謝產(chǎn)物的分離純化將步驟2)中得到的培養(yǎng)物濃縮后用3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。加入100%純甲醇溶解，在半制備型高效液相色譜儀上可分離制備得到S-雌馬酌·。A.代謝產(chǎn)物S-雌馬酚的制備
將上述步驟得到的S-雌馬酚培養(yǎng)液蒸干后的粗提品溶解在100%甲醇中，過(guò)O. 22 μ m尼龍濾膜后，在高效液相色譜上進(jìn)行分離，最終得到8. 3毫克的S-雌馬酚純品(純度>95%)。本發(fā)明中使用依利特P230型高效液相色譜儀，所用制備柱為Angilent 5 μ m C18色譜柱(250X9. 4mm)，選用甲醇和水作為流動(dòng)相，HPLC分離制備時(shí)，A液為甲醇，B液為水，A B=55 45，流動(dòng)相流速為2毫升/分，檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為280納米。B.代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定(I)根據(jù)代謝產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品雌馬酚在高效液相色譜儀上的保留時(shí)間初步確定代謝產(chǎn)物為雌馬酚。如圖I所示，其為大鼠腸道分離菌株LH-52轉(zhuǎn)化大豆苷元為雌馬酚的過(guò)程圖。如圖2所示，其為大鼠腸道分離菌株LH-52轉(zhuǎn)化大豆苷元的發(fā)酵萃取液的HPLC圖
-i'Tfe P曰。如圖3所示，其為混合標(biāo)準(zhǔn)品大豆苷元和雌馬酚的HPLC圖譜。由圖2和圖3所示，本實(shí)施例制備的雌馬酚保留時(shí)間為13. 881分鐘，標(biāo)準(zhǔn)品雌馬酚的保留時(shí)間為13. 829分鐘，可以初步確定為本實(shí)施例制備的產(chǎn)品為雌馬酚。(2)代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜測(cè)定(ESI-TOF MS)如圖4所示，菌株LH-52轉(zhuǎn)化大豆苷元的代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜表明，該代謝產(chǎn)物的分子離子峰為m/z 241 [Μ-ΗΓ，這與雌馬酚的分子量(C15H14O3)相一致。(3)代謝產(chǎn)物的核磁共振圖譜大鼠腸道分離菌株LH-52轉(zhuǎn)化大豆苷元的代謝產(chǎn)物的核磁共振氫譜和碳譜與以往報(bào)道的雌馬酚的氫譜和碳譜基本一致，具體結(jié)果如下1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 7. I 2 (d, 9. OHz, 2Η) , 6. 95 (d, 8. OHz, 1Η),6. 82 (d, 8. OHz，2Η)，6. 40 (dd, 2. 5Ηζ, 9. OHz，I H)，6. 37 (d, 2. 5Hz, 1Η)，4. 30 (dd, 10. OHz, 2. 5Hz, 1Η)，3. 97 (t, 10. 5Hz, 1Η)，3. 17 (m, 1Η)，2. 94 (m, 2Η)。13C 匪R(125MHz, CDCl3) δ 155. 1，154. 9，154. 5，133. 6，130. 4，128. 6，128. 6，115. 6，115. 6，114. 4，108. 0,103. 2,71. 1,37. 9,31. 8。C.代謝產(chǎn)物雌馬酚手性征測(cè)定如圖6所示為S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品的手性柱HPLC圖譜，圖5為外消旋雌馬酚和大豆苷元的混合標(biāo)準(zhǔn)品手性柱HPLC圖譜，圖7為培養(yǎng)萃取液的HPLC圖譜，S-雌馬酚的保留時(shí)間為18. 657分鐘，對(duì)應(yīng)的R-雌馬酚保留時(shí)間為23. 397分鐘，大豆苷元的保留時(shí)間為14. 973分鐘，培養(yǎng)萃取液在14. 562分鐘和18. 531分鐘處出現(xiàn)2個(gè)峰，根據(jù)峰面積計(jì)算得到產(chǎn)物雌馬酚的對(duì)映體過(guò)量值(％e. e.)為100%。本實(shí)施例解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚難以實(shí)現(xiàn)的問(wèn)題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉(zhuǎn)化為手性化合物S-雌馬酚的功能微生物菌株及其制備方法。相對(duì)于以往報(bào)道的嚴(yán)格厭氧雌馬酚轉(zhuǎn)化菌株以及混合菌轉(zhuǎn)化，本發(fā)明得到的奇異變形桿菌Proteus mirabilis LH-52菌株為兼性厭氧菌,更適合于工業(yè)生產(chǎn)。表I
權(quán)利要求
1.一種奇異變形桿菌菌株，其特征在于該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2011390，保藏日期為2011年11月13日。
2.一種如權(quán)利要求I所述的奇異變形桿菌菌株轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法，其特征在于包括以下步驟 1)奇異變形桿菌菌株的培養(yǎng)將奇異變形桿菌菌株，37°C厭氧活化培養(yǎng)12 18小時(shí)后，接種于已滅菌的液體培養(yǎng)基。
2)底物的加入采用大豆苷元(daidzein)作為底物；按照I: 100的接種量將步驟I)中菌液接種于含100微摩爾/升底物大豆苷元的滅菌液體培養(yǎng)基，繼續(xù)厭氧37°C培養(yǎng)4天，即可轉(zhuǎn)化底物為S-雌馬酚。
3)代謝產(chǎn)物的分離純化將步驟2)中得到的培養(yǎng)物濃縮后用3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。加入100%純甲醇溶解，在半制備型高效液相色譜儀上可分離制備得到S-雌馬酚。
3.如權(quán)利要求2所述的一種奇異變形桿菌菌株轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法，其特征在于所述步驟I)和步驟2)中的液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨27. 5克/升，葡萄糖2. O克/升，氯化鈉5. O克/升，磷酸氫二鈉2. 5克/升。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種奇異變形桿菌菌株，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2011390，保藏日期為2011年11月13日；以及利用奇異變形桿菌菌株轉(zhuǎn)化大豆苷元生產(chǎn)S-雌馬酚的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚難以實(shí)現(xiàn)的問(wèn)題，提供一種能將潛手性化合物大豆苷元直接轉(zhuǎn)化為手性化合物S-雌馬酚的單一功能微生物菌株及其制備方法。相對(duì)于以往報(bào)道的嚴(yán)格厭氧雌馬酚轉(zhuǎn)化菌株以及混合菌轉(zhuǎn)化，本發(fā)明得到的奇異變形桿菌Proteus mirabilis LH-52菌株為兼性厭氧菌，更適合于工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102925378SQ20121014674
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者肖美添 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)