專利名稱：微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種低溫木聚糖酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫木聚糖酶主要應(yīng)用于造紙工業(yè)、食品飲料、飼料、功能性低聚糖的制備、以及其他木聚糖酶應(yīng)用行業(yè)?？商岣咴系睦寐?、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率，降低能耗和生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。
背景技術(shù)：
廣義的木聚糖酶是指能夠降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱(劉瑞田等，工業(yè)微生物，1998),包括內(nèi)切3 -1,4-D-木聚糖酶(endo-3 -1,4_D_xyIanase) (EC3. 2. I. 8), P-D-木糖苷酶(3-D-xylosidases) (EC 3.2.1.37)，a-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(a-L-arabinofuranosidases), a-D-葡萄糖醒酸苷酶(a-D-glucuronidases)(EC3. 2. 2. 39)。但通常所說的木聚糖酶僅限于內(nèi)切0-1,4-D-木聚糖酶，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶(朱會(huì)芳等，菌物學(xué)報(bào)，2010)，其作用是降解木聚糖主鏈骨架。木聚糖酶作為生物酶制劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于造紙工業(yè)、食品飲料、飼料、功能性低聚糖的制備等行業(yè)中(江正強(qiáng)，中國食品學(xué)報(bào)，2005)。目前國內(nèi)外對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的研究已比較深入，主要包括菌種篩選、誘導(dǎo)產(chǎn)酶、酶的分離純化、酶學(xué)特性以及木聚糖酶基因的克隆與表達(dá)等研究(朱會(huì)芳等，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2009)，但僅限于中、高溫木聚糖酶，；而微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶的研究尚在起步階段，其產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用還未見報(bào)道。低溫木聚糖酶與中、高溫木聚糖酶相比具有更松散、柔順的分子結(jié)構(gòu)(陳秀蘭等，中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2007)，使其在自然條件下具有更高酶活及催化效率，從而提高底物利用率，降低能耗，縮短處理過程的時(shí)間；低溫木聚糖酶對(duì)熱反應(yīng)敏感的特點(diǎn)，可以通過溫和的熱處理使其變性失活，從而控制酶水解程度，使產(chǎn)品品質(zhì)不受影響。鑒于微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫木聚糖酶在降低生產(chǎn)成本及降低能耗方面的巨大優(yōu)勢(shì)，可從根本上擺脫中、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝，這將為人類擺脫生存和發(fā)展中所面臨的諸如饑餓、資源、能源危機(jī)以及環(huán)境污染等困境提供現(xiàn)實(shí)的機(jī)遇。因此，微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫木聚糖酶具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶的方法，該發(fā)明主要是微生物經(jīng)過低溫馴化后，在10 16°C液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫木聚糖酶活性可以達(dá)到200U/ml，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。該酶制劑應(yīng)用操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、成本低?？梢詮母旧媳苊庵袦亍⒏邷孛傅募訜?、冷卻設(shè)備和工藝。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶的方法具體包括以下步驟(I)將產(chǎn)生木聚糖酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；
(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的木聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 16°C培養(yǎng)72 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶結(jié)束；(4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生長(zhǎng)條件按菌種保藏單位提供的說明進(jìn)行。木聚糖酶產(chǎn)生菌(CGMCC編號(hào)I. 265或I. 518)先活化、定向馴化后，按本發(fā)明產(chǎn)酶條件發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶，低溫馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個(gè)月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在-80°C條件下可以長(zhǎng)期保藏。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，pH
7.4 7. 6,121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. Og, NaCl 2. 5
8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸餾水 I. 0L, pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養(yǎng)基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自來水I. 0L, pH自然，121°C滅菌30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基麩皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. 0g，酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐溫-800. 05 0. Ig,自來水 I. 0L, pH 自然，121。。高壓蒸汽滅菌30min。(培養(yǎng)基添加3-4種成分)(2)將產(chǎn)生木聚糖酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進(jìn)行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的木聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C培養(yǎng)24 36h而后按5 8%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3 5%的接種量接入10L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10 12°C培養(yǎng)120 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫木聚糖酶制劑。
實(shí)施例二 (I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，pH
7.4 7. 6,121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. Og, NaCl 2. 5
8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸餾水 I. 0L, pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。 ③液體種子培養(yǎng)基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自來水I. 0L, pH自然，121°C滅菌30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基麩皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. Og,酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐溫-800. 05 0. Ig,自來水 I. 0L, pH 自然，121。。高壓蒸汽滅菌30min。(培養(yǎng)基添加3-4種成分)(2)將產(chǎn)生木聚糖酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進(jìn)行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的木聚糖酶產(chǎn)生菌在10 6°C培養(yǎng)24 36h而后按5 8%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積5 7%的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在12 14°C培養(yǎng)96 120h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫木聚糖酶制劑。實(shí)施例三(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水I. 0L，pH
7.4 7. 6,121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基玉米芯2. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g, NaCl 2. 5
8.5g，K2HPO4O. I 0. 8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸餾水 I. 0L, pH 自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養(yǎng)基牛肉膏I. 0 8. 0g，蛋白胨5. 0 15. 0g，NaCl 2. 5 10. 5g，自來水I. 0L, pH自然，121°C滅菌30min。④發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基麩皮5. 0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. Og,酵母粉2. 0 8. Og,NaCl 5. 0 16. 0g, MgSO4O. I 0. 9g,吐溫-800. 05 0. Ig,自來水 I. 0L, pH 自然，121。。高壓蒸汽滅菌30min。(培養(yǎng)基添加3-4種成分)(2)將產(chǎn)生木聚糖酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進(jìn)行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的木聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C培養(yǎng)24 36h而后按5 8%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積7 9%的接種量接入100L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在14 16°C培養(yǎng)72 96h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫木聚糖酶制劑。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶的方法，其包括以下步驟 (1)將產(chǎn)生木聚糖酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好； (2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的木聚糖酶產(chǎn)生菌在10 16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子； (3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10 16°C培養(yǎng)72 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶結(jié)束； (4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體；收集到的液體即為粗酶液； (5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，在步驟(5)之后進(jìn)一步包括將步驟(5)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為 (1)菌種低溫馴化培養(yǎng)基:玉米芯2.0 8.0g，蛋白胨5.0 15. 0g，NaCl 2. 5 8. 5g，K2HPO4O. I 0.8g，MgSO4. 7H20 0. I 0. 8g，蒸餾水 I. 0L, pH 值自然，121°C 高壓蒸汽滅菌30mino (2)液體種子培養(yǎng)基牛肉膏I.0 8. 0g，蛋白胨5.0 15. OgjNaCl 2. 5 10. 5g,自來水1.01，？11值自然，1211滅菌30min。
(3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基麩皮5.0 15. 0g，蛋白胨8. 0 16. Og,酵母粉2. 0 8. Og, NaCl.5.0 16. Og, MgSO4O. I 0. 9g，吐溫-800. 05 0. Ig,自來水 I. 0L，pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶的方法是將產(chǎn)生低溫木聚糖酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；將低溫馴化后的木聚糖酶產(chǎn)生菌在10～16℃逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)72～144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫木聚糖酶結(jié)束；發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，可以將粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102653748SQ201210106590
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者于爽, 張慶芳, 王曉輝, 竇少華, 遲乃玉, 馬莉 申請(qǐng)人:大連大學(xué)