專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物甾醇酯/植物甾烷醇酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種留醇酯的合成方法，具體涉及一種通過(guò)超聲輔助強(qiáng)化酶催化酯化合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，用于提高酶促酯化的速度和過(guò)量脂肪酸的皂化去除效率。
背景技術(shù)：
研究表明，由植物留醇與脂肪酸通過(guò)酯化反應(yīng)制得的植物留醇酯/植物留烷醇酯，可以大大增加植物留醇/植物留烷醇酯的脂溶性，從而能比較方便地添加到油脂或含油脂食品中。另外，植物留醇酯的吸收利用率是植物留醇的5倍，且具有更好的親脂性和更佳的降膽固醇效果，是一種新型的功能性食品基料。2010年，植物留醇酯已被我國(guó)衛(wèi)生部列入新食品資源。目前，植物留醇酯/植物留烷醇酯的合成主要有化學(xué)法和酶法兩種?；瘜W(xué)法合成植物留醇酯的途徑有直接酯化法、酰氯酯化法、酸酐酯化法、酯交換法等。通常使用甲醇鈉、乙醇鈉等烷氧基堿金屬化合物作為催化劑，易于工業(yè)化但容易腐蝕設(shè)備；且反應(yīng)過(guò)程需要高溫，易產(chǎn)生副產(chǎn)物；同時(shí)，由于產(chǎn)物色澤深，還需要脫色等在后處理步驟、易造成三廢污染環(huán)境等嚴(yán)重缺點(diǎn)。酶催化合成法條件溫和，避免了高溫產(chǎn)生的副反應(yīng)，且產(chǎn)物容易分離純化。但研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶雖然可以較好地催化酯化反應(yīng)的進(jìn)行，但存在底物(留醇)溶解度差，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率比較低，而且反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶使用量大，產(chǎn)量低，成本高等問(wèn)題。如何提高產(chǎn)物產(chǎn)率，縮短反應(yīng)時(shí)間同時(shí)減少酶的用量成為酶催化留醇酯合成中亟待解決的問(wèn)題。超聲波是彈性介質(zhì)中的一種機(jī)械波，功率超聲是一種能量形式，可用于影響或改變媒介的性質(zhì)。超聲波在傳播過(guò)程中，對(duì)介質(zhì)的影響主要有三個(gè)作用加熱作用、機(jī)械傳質(zhì)作用及空化作用。超聲波作用于酶分子時(shí)，會(huì)促進(jìn)酶分子的構(gòu)象發(fā)生改變。超聲波作為一種物理作用，對(duì)加速化學(xué)反應(yīng)，提高反應(yīng)產(chǎn)率，甚至改變反應(yīng)歷程，都起到一定的作用，并已廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工，醫(yī)學(xué)和工業(yè)等領(lǐng)域。超聲波輔助酶法酯化反應(yīng)報(bào)道不多，目前尚未見(jiàn)超聲波應(yīng)用于酶促合成留醇酯/植物留烷醇酯的相關(guān)資料公開(kāi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，使用本方法不但可以縮短酶促酯化反應(yīng)的時(shí)間和減少酶的使用量，并且可以促進(jìn)脂肪酸的皂化反應(yīng)速度，從而提高分離純化的效率。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，其特征在于它包括如下步驟I)配制非均相酶反應(yīng)體系按摩爾比I : I. 2-2稱(chēng)取植物留醇(或植物留烷醇酯)和脂肪酸(即反應(yīng)底物)，加入反應(yīng)釜中，然后加入反應(yīng)溶劑，保持植物留醇或植物甾烷醇酯濃度為100-200mmol/L ;然后加入酶和分子篩，酶加入量為6_20g/L，分子篩加入量為20-60g/L,反應(yīng)溫度控制在50-60°C，采用機(jī)械攪拌充分混勻；2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度在50_60°C之間，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，在機(jī)械攪拌下進(jìn)行持續(xù)超聲波輻射，輻射時(shí)間O. 5-3h，輻射完畢后保持在機(jī)械攪拌下繼續(xù)反應(yīng)4-10h ；3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，采用皂化反應(yīng)除去未反應(yīng)的脂肪酸，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出反應(yīng)溶劑，得到植物甾醇酯粗品或植物留烷醇酯粗品 ；加入植物留醇酯粗品或植物留烷醇酯粗品體積O. 4-0. 6倍的5wt%碳酸氫鈉水溶液(即弱堿水溶液)進(jìn)行脂肪酸皂化，溫度在40-60°C，攪拌速度為100-200rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器持續(xù)輻射5_30min，然后停止超聲，繼續(xù)攪拌5_25min，皂化完畢后，得到植物留醇酯/植物留烷醇酯和脂肪酸皂混合物；采用該植物留醇酯/植物甾烷醇酯和脂肪酸皂混合物體積I. 5-2倍的有機(jī)溶劑萃取植物留醇酯/植物留烷醇酯，有機(jī)溶劑層回收(即脫溶劑)，減壓除去有機(jī)溶劑，即得到精制的植物留醇酯/植物留烷醇酯。按上述方案，步驟I)中所述的植物留醇可以是豆留醇、谷留醇、菜油留醇、菜油甾醇等中的任意一種或二種以上按任意配比的混合物；植物留烷醇由上述植物留醇?xì)浠@得(即由豆留醇、谷留醇、菜油留醇、菜油留醇等中的任意一種或二種以上按任意配比的混合物氫化獲得)。按上述方案，步驟I)中所述的脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等中的任意一種或二種以上按任意配比的混合物，也可以是植物油水解得到的混合脂肪酸。按上述方案，步驟I)中所述的反應(yīng)溶劑即超聲輔助酶促酯化的反應(yīng)溶劑)為正己烷、異辛烷、環(huán)己烷、正庚烷等中的任意一種或二種以上按任意配比的混合物。優(yōu)選正己烷。按上述方案，步驟2)中所述的酶為活力大于10000U/g的游離的脂肪酶或固定化的脂肪酶(即固定化酶)，包括來(lái)來(lái)源于微生物發(fā)酵的皺褶假絲酵母、解脂假絲酵母、南極假絲酵母或洋蔥假單胞菌脂肪酶。優(yōu)選來(lái)源于皺褶假絲酵母、南極假絲酵母和解脂假絲酵母的脂肪酶。按上述方案，步驟2)中超聲波發(fā)生器的頻率為20_40kHz，功率為100-300W ;步驟3)中超聲波發(fā)生器的頻率為30-60kHz，功率為100-200W。按上述方案，步驟3)中有機(jī)溶劑可以是正己烷、異辛烷、環(huán)己烷或石油醚。步驟I)中配制非均相酶反應(yīng)體系時(shí)，機(jī)械攪拌速度為100_300rpm，混合時(shí)間為10_30min。步驟2)中超聲輔助酶促酯化時(shí)只需在反應(yīng)初始階段進(jìn)行超聲輻射，超聲時(shí)間為
O.5-3h ;超聲結(jié)束后保持機(jī)械攪拌下繼續(xù)反應(yīng)4-10h，攪拌速度為100-300rpm。本發(fā)明采用將超聲輻射探頭直接浸入反應(yīng)體系中的超聲模式而不是使用超聲波清洗機(jī)的間接超聲模式。本發(fā)明的有益結(jié)果是(I)超聲波在使用適當(dāng)頻率和功率的超聲波輻射不僅不會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)，而且可以使脂肪酶的活性位點(diǎn)充分暴露，從而提高酶的催化活性，同時(shí)超聲波可以促進(jìn)酶和反應(yīng)底物的充分接觸，與單純機(jī)械攪拌相比，酶促酯化反應(yīng)時(shí)間縮短50% -60%，酶用量減少20% -30%。即采用本方法可以縮短酶促酯化反應(yīng)的時(shí)間并減少酶的使用量。(2)超聲波預(yù)處理可以顯著提高反應(yīng)底物(植物甾醇/植物甾烷醇)的溶解度，從而提高反應(yīng)體系中底物的濃度，增大單次反應(yīng)留醇酯的產(chǎn)量，反應(yīng)總收率高(反應(yīng)總收率大于80% ) o(3)由于本發(fā)明只需在酶促酯 化反應(yīng)和皂化去除脂肪酸的初始階段進(jìn)行超聲輔助，超聲時(shí)間短，能耗低，且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。(4)由于本發(fā)明采用浸入式超聲波輻射模式，超聲波的能量可以零損失的完全傳遞到反應(yīng)體系中，因此只需在常規(guī)攪拌反應(yīng)釜上加裝超聲波探頭和相應(yīng)的發(fā)生裝置即可，設(shè)備投資小，效率高。(5)本發(fā)明超聲波輻射可以顯著提高皂化去除脂肪酸的效率，只需皂化處理I次，就可以使產(chǎn)品酸價(jià)小于I. 0mgK0H/g，過(guò)氧化值小于5meq/kg，且處理時(shí)間較常規(guī)攪拌縮短20%以上。即可以促進(jìn)脂肪酸的皂化反應(yīng)速度，從而提高分離純化的效率。(6)與現(xiàn)有的植物留醇酯/植物留烷醇生產(chǎn)方法相比，本方法制得的植物留醇酯/植物留烷醇酯產(chǎn)品具有色澤淺，品質(zhì)高的特點(diǎn)，無(wú)需進(jìn)一步吸附脫色，從而減少了吸附脫色等后處理步驟造成的產(chǎn)品損失。


圖I為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施的工藝流程框圖。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。實(shí)施例I :如圖I所示，一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯的方法，它包括如下步驟I)配制非均相酶反應(yīng)體系稱(chēng)取413g(lM)植物甾醇(豆甾醇)，417g(l. 5M) a-亞麻酸加入反應(yīng)釜中，然后加入IOL異辛烷(此時(shí)植物留醇濃度為100mmol/L)，加入解脂假絲酵母脂肪酶150g，分子篩加入量為600g，溶液溫度加熱至55°C，采用機(jī)械攪拌充分混勻。2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度為55°C，以IOOrpm的速度攪拌混合均勻，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到20Hz，功率為100W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射40min后停止，繼續(xù)機(jī)械攪拌反應(yīng)5h，酯化率可達(dá)85%以上。3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出異辛烷，大約可得到580g a -亞麻酸留醇酯(留醇酯粗品，體積約為600mL),加入240mL的5wt %碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸阜化,溫度控制在40°C，攪拌速度為200rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到30kHz，功率為100W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射IOmin后停止，繼續(xù)攪拌20min，皂化完畢后，得到留醇酯和脂肪酸皂混合物(體積約為800mL);采用1200mL的正己烷(有機(jī)溶劑)萃取甾醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶劑，可得到約550g精制的植物甾醇酯(甾醇酯產(chǎn)品)，反應(yīng)總收率大于80%。此時(shí)得到的甾醇酯含量大于97wt%,酸價(jià)小于I. 0mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kgo實(shí)施例2 一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯的方法，它包括如下步驟
I)配制非均相酶反應(yīng)體系稱(chēng)取621g(l. 5M)植物甾醇(谷甾醇)，630g(2. 25M)亞油酸加入反應(yīng)釜中，然后加入IOL正己烷(此時(shí)植物留醇濃度為150mmol/L)，分子篩加入量為400g,加入南極假絲酵母固定化酶IOOg(Novozym 435,諾維信(中國(guó))生物科技有限公司)溶液溫度加熱至50°C，采用機(jī)械攪拌充分混勻。 2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度為50°C，以200rpm的速度攪拌混合均勻，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到25Hz，功率為200W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射Ih后停止，繼續(xù)機(jī)械攪拌反應(yīng)6h，化率可達(dá)87 %以上。3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出正己烷，大約可得到890g亞油酸甾醇酯(甾醇酯粗品，體積約為900mL)，加入450mL的5wt%碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸皂化，溫度控制在50°C，攪拌速度為150rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到30kHz，功率為150W，伴隨機(jī)械攪拌超聲波輻射5min后停止，繼續(xù)攪拌25min，皂化完畢后，得到留醇酯和脂肪酸皂混合物(體積約為1300mL);加入2600mL正己烷(有機(jī)溶劑)萃取甾醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶劑，可得到約830g精制甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例3 一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯的方法，它包括如下步驟I)配制非均相酶反應(yīng)體系稱(chēng)取800g(2M)植物甾醇(菜油甾醇)，672g(2. 4M)葵花籽油水解得到的混合脂肪酸加入反應(yīng)釜中，然后加入IOL異辛烷(此時(shí)植物留醇濃度為200mmol/L)，加入皺褶假絲酵母酶80g，分子篩加入量為200g，溶液溫度加熱至55°C，采用攪拌充分混勻。2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度為55°C，以200rpm的速度攪拌混合均勻，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到30kHz，功率為300W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射I. 5h后停止，繼續(xù)攪拌反應(yīng)8h，化率可達(dá)90%以上。3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出異辛烷，大約可得到1240g留醇酯(留醇酯粗品，體積約為1250mL)，加入750mL的5wt %碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸皂化，溫度控制在55°C，攪拌速度為200rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到40Hz，功率為200W，伴隨機(jī)械攪拌超聲波輻射IOmin后停止，繼續(xù)攪拌20min，皂化完畢后，得到留醇酯和脂肪酸皂混合物(體積約為1900mL);加入3000mL正己烷(有機(jī)溶劑)萃取甾醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶齊U，可得到約1130g精制甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于82%。得到的精制甾醇酯含量大于98wt%,酸價(jià)小于0. 5mgK0H/g,過(guò)氧化值小于4. Omeq/kg。實(shí)施例4 一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯的方法，它包括如下步驟I)配制非均相酶反應(yīng)體系稱(chēng)取812g(2M)植物甾醇(混合甾醇，豆甾醇、谷甾醇和菜油甾醇的重量各占l/3)，1120g(4M)葵花油油水解得到的混合脂肪酸加入反應(yīng)釜中，然后加入IOL正己燒(此時(shí)植物留醇濃度為200mmol/L),加入皺裙假絲酵母酶60g,分子篩加入量為200g，溶液溫 度加熱至60°C，采用攪拌充分混勻。2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度為60°C，以200rpm的速度攪拌混合均勻，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到40Hz，功率為300W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射2h后停止，繼續(xù)攪拌反應(yīng)8h，酯化率可達(dá)92 %以上。3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出正己烷，大約可得到1280g留醇酯(留醇酯粗品，體積約為1300mL)，加入780mL的5wt %碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸皂化，溫度控制在60°C，攪拌速度為200rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到60kHz，功率為200W，伴隨機(jī)械攪拌超聲波輻射20min后停止，繼續(xù)攪拌20min，皂化完畢后，得到留醇酯和脂肪酸皂混合物(體積約為2000mL);加入3000mL正己烷萃取甾醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶劑，可得到約1171g精制甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于85%。得到的精制甾醇酯含量大于98wt%，酸價(jià)小于O. 5mgK0H/g,過(guò)氧化值小于4. Omeq/kg。實(shí)施例5 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟I)中α-亞麻酸由棕櫚酸替代；植物甾醇為豆留醇和谷留醇，豆留醇和谷留醇的質(zhì)量各占1/2 ;異辛烷由正己烷替代。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%，酸價(jià)小于
O.8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于 5. Omeq/kg。實(shí)施例6 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟I)中α-亞麻酸由硬脂酸替代。得到的精制的留醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的留醇酯含量大于96wt%，酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例7 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟I)中α -亞麻酸由油酸替代；植物甾醇為菜籽留醇和菜油留醇，菜籽留醇和菜油留醇的質(zhì)量各占1/2 ;異辛烷由環(huán)己烷替代。得到的精制的留醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的留醇酯含量大于96wt%，酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例8 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟I)中α -亞麻酸由棕櫚酸和硬脂酸替代，棕櫚酸和硬脂酸的質(zhì)量各占1/2 ;植物留醇為菜籽留醇和菜油留醇，菜籽留醇和菜油甾醇的質(zhì)量各占1/2 ;異辛烷由環(huán)己烷和正庚烷替代，環(huán)己烷和正庚烷的質(zhì)量各占1/2。得到的精制的留醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的留醇酯含量大于96wt%，酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例9 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟I)中α-亞麻酸由亞油酸和Y-亞麻酸替代,亞油酸和亞麻酸的質(zhì)量各占1/2。得到的精制的留醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例10 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟2)中輻射時(shí)間為O. 5h ;解脂假絲酵母脂肪酶由皺褶假絲酵母脂肪酶替代。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例11 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟2)中在機(jī)械攪拌超聲波輻射5h后停止，繼續(xù)機(jī)械攪拌反應(yīng)4h ;超聲波發(fā)生器的頻率為40kHz，功率為IOOW ;解脂假絲酵母脂肪酶由皺褶假絲酵母脂肪酶替代。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例12 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟2)中解脂假絲酵母脂肪酶由南極假絲酵母脂肪酶替代。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例13 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟2)中解脂假絲酵母脂肪酶由洋蔥假單胞菌脂肪酶替代。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例14 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟3)中開(kāi)啟超聲波發(fā)生器持續(xù)輻射30min，然后停止超聲；超聲波發(fā)生器的頻率為36kHz，功率為IOOW ；萃取的有機(jī)溶劑“正己烷”由異辛烷代替。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例15 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟3)中萃取的有機(jī)溶劑“正己烷”由環(huán)己烷代替。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例16 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟3)中萃取的有機(jī)溶劑“正己烷”由石油醚代替。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例17 與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于步驟I)中解脂假絲酵母脂肪酶200g，溶液溫度加熱至60°C;步驟2)中輻射時(shí)間3h，輻射完畢后保持在機(jī)械攪拌下繼續(xù)反應(yīng)10h。步驟3)中溫度控制在60°C,攪拌速度為IOOrpm,開(kāi)啟超聲波發(fā)生器,伴隨機(jī)械攪拌超聲波福射30min后停止,繼續(xù)攪拌5min。得到的精制的甾醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。植物甾烷醇的制備將約200g的甾醇溶于正丙醇，放入反應(yīng)釜中，加入1600mL正丙醇，甾醇質(zhì)量4%的鈀碳催化劑，300r/min的攪拌速率，壓力2MPa，65°C下反應(yīng)7小時(shí)，通過(guò)測(cè)定碘值計(jì)算反應(yīng)氫化率大于95%，得到植物留烷醇。植物留烷醇包 括豆留烷醇、谷留烷醇、菜油留烷醇、菜油留烷醇等中的任意一種或二種以上按任意配比的混合物。實(shí)施例18 一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留烷醇酯的方法，它包括如下步驟I)配制非均相酶反應(yīng)體系稱(chēng)取411g(lM)植物甾烷醇酯(豆甾烷醇)，417g(1.5M) a-亞麻酸加入反應(yīng)釜中，然后加入IOL異辛烷(此時(shí)植物留醇濃度為lOOmmol/L)，加入解脂假絲酵母脂肪酶150g，分子篩加入量為600g，溶液溫度加熱至55°C，采用機(jī)械攪拌充分混勻。2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度為55°C，以IOOrpm的速度攪拌混合均勻，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到20Hz，功率為100W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射40min后停止，繼續(xù)機(jī)械攪拌反應(yīng)5h，酯化率可達(dá)85%以上。3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出異辛烷，大約可得到580g a -亞麻酸留烷醇酯(留烷醇酯粗品，體積約為600mL),加入240mL的5wt%碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸阜化,溫度控制在40°C，攪拌速度為200rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到30kHz，功率為100W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射IOmin后停止，繼續(xù)攪拌20min，皂化完畢后，得到留烷醇酯和脂肪酸皂混合物(體積約為800mL);采用1200mL的正己烷(有機(jī)溶劑)萃取甾烷醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶劑，可得到約550g精制的植物留烷醇酯(留烷醇酯產(chǎn)品)，反應(yīng)總收率大于80%。此時(shí)得到的植物甾烷醇酯含量大于97wt%，酸價(jià)小于I. 0mgK0H/g，過(guò)氧化值小于 5.0meq/kgo實(shí)施例19 一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留烷醇酯的方法，它包括如下步驟I)配制非均相酶反應(yīng)體系稱(chēng)取618g(1.5M)植物甾烷醇酯(谷甾烷醇)，630g(2. 25M)亞油酸加入反應(yīng)釜中，然后加入10L正己烷(此時(shí)植物甾醇濃度為150mmol/U，分子篩加入量為400g,加入南極假絲酵母固定化酶100g (Novozym 435,諾維信(中國(guó))生物科技有限公司)溶液溫度加熱至50°C，采用機(jī)械攪拌充分混勻。2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度為50°C，以200rpm的速度攪拌混合均勻，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到25Hz，功率為200W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射Ih后停止，繼續(xù)機(jī)械攪拌反應(yīng)6h，酯化率可達(dá)87%以上。3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出正己烷，大約可得到890g亞油酸留烷醇酯(留烷醇酯粗品，體積約為900mL),加入450mL的5wt %碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸阜化,溫度控制在50°C，攪拌速度為150rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到40kHz，功率為150W，伴隨機(jī)械攪拌超聲波輻射5min后停止，繼續(xù)攪拌25min，皂化完畢后，得到留烷醇酯和脂肪酸皂混合物(體積約為1300mL);加入2600mL正己烷(有機(jī)溶劑)萃取甾烷醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶劑，可得到約830g精制甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制甾燒醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgKOH/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例20 一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留烷醇酯的方法，它包括如下步驟I)配制非均相酶反應(yīng)體系稱(chēng)取600g(1.5M)植物甾烷醇酯(菜油甾烷醇)，672g(2. 4M)葵花籽油水解得到的混合脂肪酸加入反應(yīng)釜中，然后加入IOL異辛烷(此時(shí)植物甾醇濃度為200mmol/L)，加入皺褶假絲酵母酶80g，分子篩加入量為200g，溶液溫度加熱至55°C，采用攪拌充分混勻。2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度為55°C，以200rpm的速度攪拌混合均勻，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到30kHz，功率為300W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射I. 5h后停止，繼續(xù)攪拌反應(yīng)8h，酯化率可達(dá)90%以上。3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出異辛烷，大約可得到1240g留烷醇酯(留烷醇酯粗品，體積約為1250mL)，加入750mL的5wt%碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸皂化，溫度控制在55°C，攪拌速度為200rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到40Hz，功率為200W，伴隨機(jī)械攪拌超聲波輻射IOmin后停止，繼續(xù)攪拌20min，皂化完畢后，得到留烷醇酯和脂肪酸皂混合物(體積約為1900mL);加入3000mL正己烷(有機(jī)溶劑)萃取甾烷醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶劑，可得到約1130g精制留烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于82%。得到的精制留烷醇酯含量大于98wt%,酸價(jià)小于0. 5mgK0H/g,過(guò)氧化值小于4. Omeq/kg。實(shí)施例21 一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留烷醇酯的方法，它包括如下步驟I)配制非均相酶反應(yīng)體系稱(chēng)取810g(2M)植物甾烷醇(混合甾烷醇，豆甾烷醇、谷甾烷醇和菜油留烷醇的重量各占l/3)，1120g(4M)葵花油油水解得到的混合脂肪酸加入反應(yīng)釜中，然后加入IOL正己烷(此時(shí)植物留醇濃度為200mmol/L)，加入皺褶假絲酵母酶60g，分子篩加入量為200g，溶液溫度加熱至60°C，采用攪拌充分混勻。2)超聲輔助酶促酯化(酶促酯化反應(yīng)體系)保持反應(yīng)體系溫度為60°C，以200rpm的速度攪拌混合均勻，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到40Hz，功率為300W，在機(jī)械攪拌超聲波輻射2h后停止，繼續(xù)攪拌反應(yīng)8h，酯化率可達(dá)92 %以上。3)超聲輔助皂化去除脂肪酸酶促酯化反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出正己烷，大約可得到1280g留烷醇酯(留烷醇酯粗品，體積約為1300mL)，加入780mL的5wt %碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸皂化，溫度控制在60°C，攪拌速度為200rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，調(diào)整頻率到60kHz，功率為200W，伴隨機(jī)械攪拌超聲波輻射20min后停止，繼續(xù)攪拌20min，皂化完畢后，得到留烷醇酯和脂肪酸皂混合物(體積約為2000mL);加入3000mL正己烷萃取甾烷醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶劑，可得到約1171g精制留烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于85%。得到的精制留烷醇酯含量大于98wt%,酸價(jià)小于0. 5mgKOH/g,過(guò)氧化值小于4. Omeq/kg實(shí)施例22 與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟I)中a -亞麻酸由棕櫚酸替代；植物甾烷醇為豆留烷醇和谷留烷醇，豆留烷醇和谷留烷醇的質(zhì)量各占1/2 ;異辛烷由正己烷替代。得到的精制的留烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的留烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例23 與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟I)中a-亞麻酸由硬脂酸替代。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%，酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例24 與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟I)中a-亞麻酸由油酸替代；植物甾烷醇為菜籽留烷醇和菜油留烷醇，菜籽留烷醇和菜油留烷醇的質(zhì)量各占1/2 ;異辛烷由環(huán)己烷替代。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例25:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟I)中a -亞麻酸由棕櫚酸和硬脂酸替代，棕櫚酸和硬脂酸的質(zhì)量各占1/2 ;植物留烷醇為菜籽留烷醇和菜油留烷醇，菜籽留烷醇和菜油留烷醇的質(zhì)量各占1/2 ;異辛烷由環(huán)己烷和正庚烷替代，環(huán)己烷和正庚烷的質(zhì)量各占1/2。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例26:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟I)中a-亞麻酸由亞油酸和Y-亞麻酸替代，亞油酸和亞麻酸的質(zhì)量各占1/2。得到的精制的留烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80 %。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt %，酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5.0meq/kgo實(shí)施例27:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟2)中輻射時(shí)間為0.5h;解脂假絲酵母脂肪酶由皺褶假絲酵母脂肪酶替代。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例28:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟2)中在機(jī)械攪拌超聲波輻射5h后停止，繼續(xù)機(jī)械攪拌反應(yīng)4h ;超聲波發(fā)生器的頻率為40kHz，功率為100W ;解脂假絲酵母脂肪酶由皺褶假絲酵母脂肪酶替代。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于0. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。
實(shí)施例29:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟2)中解脂假絲酵母脂肪酶由南極假絲酵母脂肪酶替代。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例30:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟2)中解脂假絲酵母脂肪酶由洋蔥假單胞菌脂肪酶替代。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。 實(shí)施例31:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟3)中開(kāi)啟超聲波發(fā)生器持續(xù)輻射30min，然后停止超聲；超聲波發(fā)生器的頻率為36kHz，功率為IOOW ；萃取的有機(jī)溶劑“正己烷”由異辛烷代替。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例32:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟3)中萃取的有機(jī)溶劑“正己烷”由環(huán)己烷代替。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例33:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟3)中萃取的有機(jī)溶劑“正己烷”由石油醚代替。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。實(shí)施例34:與實(shí)施例18基本相同，不同之處在于步驟I)中解脂假絲酵母脂肪酶200g，溶液溫度加熱至60°C;步驟2)中輻射時(shí)間3h，輻射完畢后保持在機(jī)械攪拌下繼續(xù)反應(yīng)10h。步驟3)中溫度控制在60°C,攪拌速度為IOOrpm,開(kāi)啟超聲波發(fā)生器,伴隨機(jī)械攪拌超聲波福射30min后停止,繼續(xù)攪拌5min。得到的精制的甾烷醇酯產(chǎn)品，反應(yīng)總收率大于80%。得到的精制的甾烷醇酯含量大于96wt%,酸價(jià)小于O. 8mgK0H/g,過(guò)氧化值小于5. Omeq/kg。本發(fā)明所列舉的各原料，以及本發(fā)明各原料的上下限、區(qū)間取值，以及工藝參數(shù)(如溫度、時(shí)間等)的上下限、區(qū)間取值都能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，在此不一一列舉實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，其特征在于它包括如下步驟 1)配制非均相酶反應(yīng)體系按摩爾比I: I. 2-2稱(chēng)取植物留醇/植物留烷醇和脂肪酸，加入反應(yīng)釜中，然后加入反應(yīng)溶劑，保持植物留醇或植物留烷醇濃度為100-200mmol/L ;然后加入酶和分子篩，酶加入量為6-20g/L，分子篩加入量為20-60g/L，反應(yīng)溫度控制在50-60°C，采用機(jī)械攪拌充分混勻； 2)超聲輔助酶促酯化保持反應(yīng)體系溫度在50-60°C之間，將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，在機(jī)械攪拌下進(jìn)行持續(xù)超聲波輻射，輻射時(shí)間0. 5-3h，輻射完畢后保持在機(jī)械攪拌下繼續(xù)反應(yīng)4-10h ； 3)超聲輔助皂化去除脂肪酸待反應(yīng)體系溫度降至室溫，離心除去酶和分子篩，減壓蒸餾出反應(yīng)溶劑，得到留醇酯粗品或留烷醇酯粗品；加入留醇酯粗品或留烷醇酯粗品體積0. 4-0. 6倍的5wt%碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行脂肪酸皂化，溫度在40-60°C，攪拌速度為100-200rpm，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器持續(xù)輻射5-30min，然后停止超聲，繼續(xù)攪拌5-25min，皂化完畢后，得到留醇酯/留烷醇酯和脂肪酸皂混合物；采用該留醇酯/留烷醇酯和脂肪酸皂混合物體積I. 5-2倍的有機(jī)溶劑萃取留醇酯/留烷醇酯，有機(jī)溶劑層回收，減壓除去有機(jī)溶齊U，即得到精制的植物留醇酯/植物留烷醇酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，其特征在于步驟I)中所述的植物留醇是豆留醇、谷留醇、菜籽留醇、菜油留醇中的任意一種或二種以上按任意配比的混合物；植物留烷醇由上述植物留醇經(jīng)氫化獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，其特征在于步驟I)中所述的脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的任意一種或二種以上按任意配比的混合物，或是植物油水解得到的混合脂肪酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，其特征在于步驟I)中所述的反應(yīng)溶劑為正己烷、異辛烷、環(huán)己烷、正庚烷中的任意一種或二種以上按任意配比的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，其特征在于步驟2)中所述的酶為活力大于10000U/g的游離或固定化的脂肪酶，包括來(lái)來(lái)源于微生物發(fā)酵的皺褶假絲酵母、解脂假絲酵母、南極假絲酵母或洋蔥假單胞菌脂肪酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，其特征在于步驟2)中超聲波發(fā)生器的頻率為20-40kHz，功率為100-300W ;步驟3)中超聲波發(fā)生器的頻率為30-60kHz，功率為100-200W。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物留醇酯/植物留烷醇酯的方法，其特征在于步驟3)中有機(jī)溶劑是正己烷、異辛烷、環(huán)己烷或石油醚。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甾醇酯的制備方法。一種利用超聲波強(qiáng)化酶促合成植物甾醇酯/植物甾烷醇酯的方法，其特征在于它包括如下步驟1)配制非均相酶反應(yīng)體系按摩爾比1∶1.2-2稱(chēng)取植物甾醇/植物甾烷醇酯和脂肪酸，然后加入反應(yīng)溶劑；然后加入酶和分子篩；2)超聲輔助酶促酯化將超聲波探頭浸入反應(yīng)溶液，開(kāi)啟超聲波發(fā)生器，在機(jī)械攪拌下進(jìn)行持續(xù)超聲波輻射，輻射時(shí)間0.5-3h，輻射完畢后保持在機(jī)械攪拌下繼續(xù)反應(yīng)4-10h；3)超聲輔助皂化去除脂肪酸，得到產(chǎn)品。本發(fā)明不但可以顯著縮短酶促酯化反應(yīng)的時(shí)間并減少酶的使用量，并且可以加快過(guò)量脂肪酸的皂化反應(yīng)速度，從而提高分離純化的效率，得到的甾醇酯/甾烷醇酯產(chǎn)品具有色澤淺、純度高、安全無(wú)污染的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P33/02GK102618615SQ20121009943
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者萬(wàn)楚筠, 劉昌盛, 李文林, 楊湄, 楊金娥, 許繼取, 鄧乾春, 鄭明明, 郭萍梅, 鈕琰星, 黃鳳洪, 黃慶德 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所