專利名稱：唐氏綜合征產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種唐氏綜合征產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，本診斷試劑盒能夠?qū)Φ?周后的孕婦進(jìn)行早期的檢測(cè)和診斷，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用鏈?zhǔn)確診斷出胎兒是否患有唐氏綜合征。
背景技術(shù)：
新生兒中有少部分存在先天性遺傳病或出生缺陷，給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。2007年中國(guó)有1564萬(wàn)新生兒出生，其中出生缺陷率超過(guò)1%。出生缺陷是影響我國(guó)全民健康水平和人口素質(zhì)的重要問(wèn)題。國(guó)家“十一五”規(guī)劃綱要將生殖健康相關(guān)技術(shù)列為科技發(fā)展優(yōu)先主題；2006-2020年國(guó)家中長(zhǎng)期規(guī)劃也將“出生缺陷防治”作為重點(diǎn)領(lǐng)域和優(yōu)先主題。我國(guó)每年約出生80 120萬(wàn)缺陷嬰兒；造成經(jīng)濟(jì)損失約10億元人民幣。 遺傳病是新生兒缺陷的最主要原因之一，而且許多先天性出生缺陷往往缺乏有效的治療方法，因此早期診斷和預(yù)防是目前降低出生缺陷的最有效措施。唐氏綜合征是小兒最為常見(jiàn)的由常染色體畸變性所導(dǎo)致的出生缺陷類疾病。顧名思義，該病是由先天因素造成的具有特殊表型的智能障礙。我國(guó)活產(chǎn)嬰兒中唐氏綜合征的發(fā)生率約為0.5%。-O. 6%。，男女之比為3 2，60%的患兒在胎兒早期即夭折流產(chǎn)?；純旱闹饕R床特征為智能障礙、體格發(fā)育落后和特殊面容，并可伴有多發(fā)畸形，給患兒及家庭帶來(lái)極大的痛苦。因此，胎兒有否換上唐氏綜合征是孕婦選擇進(jìn)行產(chǎn)前檢查的主要原因，是降低畸形兒出生率最為有效的辦法之一。現(xiàn)在世界上進(jìn)行這類診斷通常是在孕期第16到18周間進(jìn)行的，辦法一是通過(guò)子宮穿刺羊膜腔，從羊水中獲取胚胎細(xì)胞，二是提取胎盤(pán)組織進(jìn)行活體檢查，但這兩種辦法都比較復(fù)雜，且都是采用介入式方法進(jìn)行，對(duì)孕婦和胎兒有可能引起一定的損傷，甚至有時(shí)會(huì)引發(fā)宮內(nèi)感染、羊膜破裂、流產(chǎn)、胎兒畸形或死亡等。由于其潛在的風(fēng)險(xiǎn)，此類診斷臨床上一般只針對(duì)高齡孕婦和有家族畸形遺傳史的孕婦進(jìn)行，其排查和檢測(cè)的范圍小，因此，也難以對(duì)整個(gè)新生兒先天性遺傳病或出生缺陷的產(chǎn)前診斷做出足夠的貢獻(xiàn)。目前，開(kāi)發(fā)新的方便、安全的胎兒基因或染色體診斷技術(shù)是國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的熱點(diǎn)領(lǐng)域。比如從外周血中獲取或富集胚胎細(xì)胞用于胎兒遺傳診斷近年來(lái)取得了一定的進(jìn)展。如法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生與醫(yī)學(xué)研究所(INSERM)的科學(xué)家利用胚胎細(xì)胞比母體血液細(xì)胞大的特點(diǎn)，嘗試從孕婦的血液中分離出胚胎細(xì)胞，然后再通過(guò)分析母體和父體基因的遺傳特性， 進(jìn)行細(xì)胞篩選。對(duì)13名孕期為11到12周的孕婦進(jìn)行的診斷實(shí)驗(yàn)表明，這種細(xì)胞篩選法是可行的，母體血液化驗(yàn)法在理論上可以替代羊膜腔穿刺術(shù)和胎盤(pán)活組織檢查。但是其檢查不同胎兒畸形癥狀時(shí)的敏感性、可靠性還有待確認(rèn)，且由于胚胎細(xì)胞數(shù)量少，對(duì)于檢驗(yàn)仍然存在較大的困難。本領(lǐng)域需要提供更方便、安全的非介入性胎兒基因或染色體診斷相關(guān)技術(shù)。本試劑盒正是基于此而開(kāi)發(fā)的，只要孕婦的孕周達(dá)到12周，即可向醫(yī)生咨詢進(jìn)行非侵入性的唐氏綜合征無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，大大減輕了孕婦的痛苦和風(fēng)險(xiǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
基于能夠利用孕婦血液循環(huán)中游離的DNA來(lái)建立胎兒的有效DNA文庫(kù)，從而同時(shí)完成21號(hào)染色體三體綜合征，13三體綜合征，18三體綜合征的檢測(cè)。且結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)假陽(yáng)性和無(wú)假陰性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種唐氏綜合征產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括T4 DNA連接酶緩沖液；Klenow 片段(5 單位 /ul)；T4多核苷酸激酶(T4 PNK)；接頭序列；DNA測(cè)序引物；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(duì)(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 測(cè)序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_(kāi)20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I.檢測(cè)試劑盒的使用I. DNA 的獲取從孕婦的離體外周血液中提取的DNA片段。獲取孕婦的離體外周血衆(zhòng)，使用試劑盒QIAamp DNA Midi reagent set (Qiagen, catlog#51183)提取血漿中的游離DNA，方法是使用該試劑盒中的血液和體液處理方法 ("blood and body fluid" protocol) qDNA 的純化過(guò)程使用 the QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒自動(dòng)進(jìn)行在QIAcube (Qiagen 9001292)上進(jìn)行，此步驟可通過(guò)這些試劑盒自動(dòng)完成?！?.末端修復(fù)從孕婦的血液中提取的DNA是雙鏈DNA片段，這些片段是平端的，或含有3或5'突出端。這一步是通過(guò)T4 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)，和多核苷酸激酶T4，使突出端磷酸化成平末端。3'到5'外切酶活性去除3'突出端，聚合酶活性填充5'突出端。Sambrook等(1989)對(duì)這一步過(guò)程做了更詳細(xì)的解釋。重要的是這種方法采用了大腸桿菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)，而不是用步驟三使用的缺失了到5'外切酶活性的Klenow片段。材料從血漿DNA 中提取 DNA (DNA I 至 5ng，30 μ I 水)。Τ4 DNA連接酶緩沖液與IOmM ΑΤΡ。dNTP s 的混合物(IOmM)。T4 DNA 聚合酶(3 單位 / μ I)。Klenow 片段(5 單位 / μ I)。Τ4 PNK (Τ4多核苷酸激酶，10單位/ μ I)，QIAquick PCR擴(kuò)增純化試劑盒(QIAGEN 公司，目錄編號(hào)#28104)。程序(I)以I : 5的比例，用水稀釋lU/ul濃度的DNA偶合聚合酶。(2)準(zhǔn)備以下反應(yīng)的組合
權(quán)利要求
1.一種用于唐氏綜合征產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)篩查的試劑盒，其特征在于T4 DNA連接酶緩沖液、Klenow片段(5單位/ul)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、接頭序列、DNA測(cè)序引物、PCR反應(yīng)組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的接頭序列是指將DNA片段進(jìn)行修飾，從而能夠在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增制備文庫(kù)的兩對(duì)特異性的接頭序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的PCR引物是指用PCR方法特異性擴(kuò)增出接頭序列修飾后的DNA片段的一對(duì)PCR引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測(cè)序引物是指針對(duì)于每個(gè) DNA文庫(kù)第I號(hào)-第22號(hào)染色體進(jìn)行測(cè)序統(tǒng)計(jì)分析的I條特異性測(cè)序引物序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的2對(duì)接頭序列如下(1)接頭序列l(wèi)a 5/ ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'接頭序列 Ib : 5' pGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT3'(2)接頭序列2a 5/ pGATCGGAAGAGCTCGTATG CCGTCTTCTGCTTG 3'接頭序列 2b :5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的I對(duì)PCR引物序列如下(1)PCR引物序列I5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3'(2)PCR 弓丨物序列 2:5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT3'。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的I條測(cè)序引物序列如下測(cè)序引物序列5' ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1) 0 反應(yīng)體系10父？0 反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對(duì)，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測(cè)序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_(kāi)20°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)唐氏綜合征的產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括T4DNA連接酶緩沖液、Klenow片段(5單位/ul)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、接頭序列、DNA測(cè)序引物、PCR反應(yīng)組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)從孕婦的外周血中建立離體的DNA文庫(kù)，能夠針對(duì)胎兒的基因組序列準(zhǔn)確測(cè)序，從而用于胎兒的唐氏綜合癥篩查，且結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)假陽(yáng)性和無(wú)假陰性。并且檢測(cè)可以用于少量的離體外周血樣本，大大減輕了孕婦的痛苦和風(fēng)險(xiǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605083SQ201210086800
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者伍建, 姜麗, 潘加奎 申請(qǐng)人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司