專利名稱：一株產(chǎn)木糖醇的酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)木糖醇的酵母菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木糖醇是一種五碳糖醇，在自然界，它存在于許多水果和蔬菜中。木糖醇的甜度是蔗糖的I. 05倍，熱量與蔗糖相當，其代謝不需胰島素。因此可作為糖尿病患者食用的甜味齊U。木糖醇不被細菌發(fā)酵，因此在口香糖中作為甜味劑，不僅有防齲齒的功能，而且在口中有清涼感。此外。木糖醇還有降低肝臟轉(zhuǎn)氨酶和防止呼吸道感染等功能。因此，木糖醇不僅是甜味劑，還可作為一種輔助治療藥物。由于木糖醇在水果和蔬菜中的含量都很低，直接提取困難而不經(jīng)濟。目前工業(yè)上生產(chǎn)木糖醇采用化學法，即木糖化學催化加氫的方法。該方法需要單獨制氫，在高溫高壓下反應(yīng)，工藝復雜、安全性差、成本較高，因此，用生物法取代化學法已成為木糖醇生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。用于發(fā)酵法制備木糖醇的微生物幾乎都是酵母菌，既有自然菌種，也有基因工程菌。自然菌種發(fā)酵以木糖為底物，一部分木糖將用于輔酶再生，理論轉(zhuǎn)化率為O. 887g/g,即
O.875mol木糖醇/mol木糖(厭氧條件下)和O. 917g/g,即O. 905mol木糖醇/mol木糖(半?yún)捬鯒l件下)(Paraj0j C, DOMINGUEZ H, DOMINGUEZ J M. Biotechnological productionof xylitol,Part I. Interest of xylitol and fundamentals of its biosynthesis[J].Biore Technol, 1998,65(3) :191-201.)?；蚬こ叹l(fā)酵的底物除木糖外，另有其它碳源用于輔酶再生，對木糖的理論轉(zhuǎn)化率為1.013g/g,即Imol木糖醇/mol木糖。自然菌種的生產(chǎn)水平為轉(zhuǎn)化率O. 56 O. 74克(木糖醇)/克(木糖)，產(chǎn)率O. 2 O. 5克(木糖醇)/升 小時；基因工程菌的生產(chǎn)水平為轉(zhuǎn)化率可接近理論值，產(chǎn)率O. 6 1.0克(木糖醇)/升 小時(Leathers FEMS Yeast Research，3133-140，2003)。在木糖醇的生產(chǎn)中，雖然基因工程菌優(yōu)于自然菌種，但需要添加葡萄糖、乙醇、乙酸、甘油等作為輔底物來再生輔酶，從而提高了成本。無論是基因工程菌或自然菌種，其綜合生產(chǎn)水平仍不能滿足產(chǎn)業(yè)化的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一株產(chǎn)木糖醇的酵母菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的產(chǎn)木糖醇的酵母菌是麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa),其菌株號為XU316，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5695。該菌種已于2012年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)?，F(xiàn)有的能培養(yǎng)麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)的培養(yǎng)基均可用于培養(yǎng)麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695，其培養(yǎng)溫度可為24_37°C，培養(yǎng)時間可為4-48h ;最適培養(yǎng)溫度為28-32°C。培養(yǎng)基中的碳源可為木糖和/或葡萄糖；氮源可為蛋白胨和/或酵母提取物和/或牛肉膏和/或玉米漿和/或銨鹽。 將麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No. 5695固定后得到的固定化酵母細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No. 5695或其固定化酵母細胞在將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種低成本且具有較高產(chǎn)率的木糖醇生產(chǎn)方法。本發(fā)明所提供的木糖醇生產(chǎn)方法，以含木糖的物質(zhì)作為反應(yīng)底物，利用麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No. 5695或其固定化酵母細胞將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。所述含木糖的物質(zhì)不限于下述I)-3)，還可包括其它含木糖的液體1)木糖溶液；2)木糖母液；3)含半纖維素物質(zhì)的水解物，所述含半纖維素物質(zhì)的水解物中含有木糖。
木糖母液是木糖生產(chǎn)過程中木糖結(jié)晶后殘留的含糖液體，其主要成分為木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖等。含半纖維素物質(zhì)包括(但不限于)玉米芯、甘蔗渣、碎木、木屑、各種秸桿、米糠等。所述水解物包括酸水解物、酶水解物以及酸酶聯(lián)合水解物。上述方法還可包括如下步驟麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCCNo. 5695或其固定化酵母細胞按照如下配比接入所述含木糖的物質(zhì)的水溶液中0. 3-0. 5g干細胞/克木糖(其中木糖濃度為50-250g/L)。其中，所述將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的反應(yīng)溫度可為為25°C _40°C，如30°C -35°C、30°C*35°C。所述將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的反應(yīng)時間可為12-500小時，如52-480小時、52-66小時、52小時、66小時、65小時或480小時。本發(fā)明的麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No. 5695不僅能用純木糖為原料生產(chǎn)木糖醇，還能利用木糖生產(chǎn)過程中的水解液作為主要原料生產(chǎn)木糖醇。轉(zhuǎn)化率可接近理論值，最高達O. 90克(木糖醇)/克(木糖)，產(chǎn)率最高可達3克(木糖醇)/升·小時以上，木糖醇濃度最高可達200克/升以上，可使生產(chǎn)成本大幅度降低，具有很好的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實施例詳細描述本發(fā)明，這些實施例用于理解而不是限制本發(fā)明。保藏說明菌種名稱麥芽糖假絲酵母拉丁名Candidamaltosa菌株編號XU316保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期2012年01月09日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 569具體實施例方式下述實施例中的方法如無特別說明均為常規(guī)方法。下述實施例3-5中的木糖和木糖醇均按照如下方法測定儀器為HPLC(Waters,USA)，色譜柱為 Aminex HPX_87H(BioRad，CA, USA)，檢測器為 RI08X detector (Waters,USA)。流動相為5mM H2SO4水溶液，流速0.6ml/min，柱溫為60°C。以外標法定量測定木糖和木糖醇的濃度。采用的木糖標準品購自sigma公司，純度> 99%，采用的木糖醇標準品購自sigma公司，純度> 99%。在該色譜條件下,木糖標準品的保留時間是10. 627分鐘，木糖醇標準品的保留時間是13. 293分鐘。在該色譜條件下，木糖的標準曲線是y =1452. 004x，其中y為峰面積，X為濃度，其單位是g/L，進樣量為IOul ;木糖醇的標準曲線是I = 1538. 614x，其中y為峰面積；x為濃度，其單位是g/L，進樣量為IOul。下述實施例4-5中的葡萄糖和阿拉伯糖均按照如下方法測定儀器為HPLC(Waters, USA),色譜柱為 Aminex HPX_87H(BioRad，CA, USA),檢測器為 RI08Xdetector (Waters, USA)。流動相為5mM H2SO4水溶液,流速O. 6ml/min,柱溫為60°C。以外標法定量測定葡萄糖和阿拉伯糖的濃度。采用的葡萄糖標準品購自sigma公司，純度> 99%，采用的阿拉伯糖標準品購自sigma公司，純度> 99%。在該色譜條件下，葡萄糖標準品的保留時間是9. 898分鐘，阿拉伯糖標準品的保留時間是11. 689分鐘。在該色譜條件下，葡萄糖的標準曲線是y= 1359. 440x,其中y為峰面積,X為濃度,其單位是g/L,進樣量為IOul ；阿拉伯糖的標準曲線是y= 1490. 792x，其中y為峰面積，X為濃度，其單位是g/L，進樣量為 IOul。
下述實施例5中的總糖使用糖度計測定(折光法)。實施例I、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No. 5695的分離及鑒定I、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No. 5695 的分離麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695是從中國北京地區(qū)含木材腐爛物的樣品中提取、分離、篩選、純化得到的。具體的方法如下用無菌水浸泡樣品，過濾除去不溶物，涂布于含木糖的固體平板培養(yǎng)基中，至于30°C溫箱中培養(yǎng)至長出單菌落，對單菌落逐個進行木糖轉(zhuǎn)化實驗，選取性狀優(yōu)良的菌株，得到麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)XU316CGMCC No. 5695。2、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695 的鑒定麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695，菌株呈卵形、橢圓形、柱形，大小為2-5. 5X3. 5-12 μ m，有菌環(huán)和醭膜形成；有假菌絲產(chǎn)生；菌落奶酪狀、乳白色，表面平滑至粗糙，不反光，邊緣樹根狀或流蘇狀。PCR擴增26SrDNA/Dl，D2序列，所用的PCR引物為上游 GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG，下游 GGTCCGTGTTTCAAGACGG ;擴增到的序列為序列表中的序列I。實施例2、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695的細胞培養(yǎng)麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695保存于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為麥芽提取物100g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水。用Yro液體培養(yǎng)基培養(yǎng)麥芽糖假絲酵母XU316CGMCC No. 5692，培養(yǎng)基組成為酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖50g/L，溶劑為水，pH為5. O。培養(yǎng)方法如下接一環(huán)斜面菌種于250ml三角搖瓶中，內(nèi)裝50ml液體培養(yǎng)基，置于旋轉(zhuǎn)搖床上，于30°C、250rpm培養(yǎng)過夜至飽和作為一級種子。按10% (體積比)接種量轉(zhuǎn)一級種子于500ml液體培養(yǎng)基中，分裝于5只500ml三角搖瓶中，每瓶IOOml培養(yǎng)基，于30°C、250rpm培養(yǎng)過夜至飽和作為二級種子。按10% (體積比)接種量轉(zhuǎn)二級種子于3000ml液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基置于6L NBS BI0FL0 III自控臺式發(fā)酵罐中，并加0. 3ml聚醚類消泡劑，培養(yǎng)條件如下攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm、溫度為30°C、通氣量為
0.5vvm、溶氧控制在30%以上，培養(yǎng)時間為9小時至溶氧回升，細胞干重為100g/L發(fā)酵液。細胞干重測定方法如下取IOml發(fā)酵液以13000rpm離心5分鐘，棄上清，IOml水洗一次，同樣離心，棄上清，90°C烘箱烘干至恒重，測定重量后折算為每L發(fā)酵液的干重。培養(yǎng)結(jié)束后用Backman J2-HS離心機收集細胞，離心條件為6管(每管500ml)，轉(zhuǎn)速5000rpm，時間30分鐘。離心后棄上清，細胞用于木糖轉(zhuǎn)化。實施例3、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695轉(zhuǎn)化木糖水溶
液生產(chǎn)木糖醇。I、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No. 5695細胞單次轉(zhuǎn)化木糖水溶液生產(chǎn)木糖醇稱取600g木糖(購自山東福田藥業(yè)有限公司，純度> 99% )溶解于水中，定溶于3L，配成木糖水溶液用于細胞轉(zhuǎn)化。將該3L木糖水溶液置于6L NBS BIOFLO III自控臺式發(fā)酵罐中，將實施例2中用I. 8L發(fā)酵液收集的麥芽糖假絲酵母XU316CGMCCNO. 5692細胞重懸于木糖水溶液中，使麥芽糖假絲酵母XU316CGMCC No. 5692細胞與木糖水溶液中木糖的配比為O. 3g干細胞/克木糖，進行木糖的細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。轉(zhuǎn)化條件如下溫度為30°C、攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm、通氣量為O. 05vvm,反應(yīng)于57小時結(jié)束,取樣,每管Iml于臺式離心機中以13000rpm離心5分鐘，上清液用于測定木糖和木糖醇濃度。上述實驗重復3次，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化反應(yīng)57小時的木糖醇濃度為170. 5g/L，木糖濃度為8. 2g/L，消耗的木糖為191. 8g/L，轉(zhuǎn)化率O. 89克(木糖醇)/克(木糖)，產(chǎn)率為3克(木糖醇)/升·小時。其中，上述上清液中木糖的保留時間是10. 630分鐘，木糖醇的保留時間是13. 295分鐘。2、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695細胞重復轉(zhuǎn)化木糖水溶液生產(chǎn)木糖醇稱取600g木糖(購自山東福田藥業(yè)有限公司，純度> 99% )溶解于水中，定溶于3L，配成木糖水溶液用于細胞轉(zhuǎn)化。將該3L木糖水溶液置于6L NBS BIOFLO III自控臺式發(fā)酵罐中，將實施例2中用I. 8L發(fā)酵液收集的麥芽糖假絲酵母XU316CGMCCNO. 5692細胞重懸于木糖水溶液中，使麥芽糖假絲酵母XU316CGMCC No. 5692細胞與木糖水溶液中木糖的配比為O. 3g干細胞/克木糖，進行木糖的細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。轉(zhuǎn)化條件如下溫度為30°C、攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm、通氣量為O. 05vvm，反應(yīng)于57小時結(jié)束。轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，用Backman J2-HS離心機離心分離反應(yīng)液的清液和細胞，離心條件為6管(每管500ml)，轉(zhuǎn)速5000rpm，時間30分鐘。上清液用于分離純化木糖醇，細胞再按照步驟I的方法用于木糖水溶液的生物轉(zhuǎn)化，除轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間不同外，其它條件均與步驟I的轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件相同。細胞共重復轉(zhuǎn)化9次，重復使用9次，其中第6、8次轉(zhuǎn)化分別補加150g木糖，作為反應(yīng)底物的木糖共計5700克，累計消耗木糖5409克，生成木糖醇4599克，共用時480小時，細胞仍具有轉(zhuǎn)化能力。9次的平均轉(zhuǎn)化率為O. 85 (木糖醇)/克(木糖)，平均產(chǎn)率為3. 2克(木糖醇)/升·小時，平均木糖醇濃度170g/L。其中，第2-9次的轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間分別為50、48、50、53、54、55、56和57小時。3、上清液中木糖醇的提取。將步驟2中得到的含有木糖醇的上清液(共含木糖醇610g)，用氫型732強酸型陽離子交換樹脂除去上清液中的陽離子，再用氫氧根型D-301R弱堿型陰離子交換樹脂除去上清液中的陰離子，使上清液PH為5. 5-6. 5。用中空纖維超濾器對除離子后的上清液進行超濾除去大分子，超濾膜平均截留分子量為5000。用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器濃縮去除離子和大分、子的反應(yīng)液，溫度為55°C，濃縮至木糖醇濃度為753g/L。把濃縮液置于燒杯中，用程序降溫儀緩慢降溫并緩慢攪動液體，降溫速度為2V /小時，至出現(xiàn)晶體，繼續(xù)緩慢攪拌至降溫到18°C，再攪拌I小時，使結(jié)晶充分。用布氏漏斗真空抽濾分離晶體和母液，勁量抽干，于40°C干燥后得到木糖醇晶體385g。母液與另一次上清液合并濃縮后再結(jié)晶。實施例4、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695轉(zhuǎn)化玉米芯水解液生產(chǎn)木糖醇。將玉米芯與1% (質(zhì)量百分含量)稀硫酸按I : 5的質(zhì)量比混合，在120_130°C保溫2-3小時水解后，通過中和脫酸、活性炭脫色、減壓蒸發(fā)濃縮、經(jīng)離子交換脫離子后得到玉米芯水解液。該水解液含木糖160g/L、葡萄糖16g/L、阿拉伯糖15g/L，不含木糖醇。將該3L玉米芯水解液置于6L NBS BIOFLO III自控臺式發(fā)酵罐中，將實施例2中用I. 8L發(fā)酵液收集的麥芽糖假絲酵母XU316CGMCC No. 5692細胞重懸于3L玉米芯水解液中，使麥芽糖假絲酵母XU316CGMCC No. 5692細胞與玉米芯水解液中木糖的配比為O. 375g干細胞/克木糖，進行木糖的細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。轉(zhuǎn)化條件如下:溫度為25°C、攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm、通氣量為
O.05vvm,反應(yīng)于52小時結(jié)束,取樣，每管Iml于臺式離心機中以13000rpm離心5分鐘,上清液用于測定木糖、木糖醇、葡萄糖和阿拉伯糖濃度。實驗重復3次，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化反應(yīng)52小時，木糖醇濃度為135. 3g/L，木糖濃度為9. 2g/L，消耗的木糖為150. 8g/L，葡萄糖濃度為
O.15g/L，阿拉伯糖濃度14. 5g/L，轉(zhuǎn)化率O. 90克(木糖醇)/克(木糖)，產(chǎn)率為2. 6克(木糖醇)/升 小時。其中，上述上清液中木糖的保留時間是10. 629分鐘，木糖醇的保留時間是13. 296分鐘，葡萄糖的保留時間是9. 901分鐘，阿拉伯糖的保留時間是11. 690分鐘。實施例5、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa) XU316CGMCC No. 5695轉(zhuǎn)化木糖母液生產(chǎn)木糖醇。木糖母液是木糖生產(chǎn)中將木糖結(jié)晶液通過固液分離分出晶體木糖后的廢棄液體，顏色為深褐色，總糖為660g/L，其中含木糖340g/L、葡萄糖150g/L、阿拉伯糖170g/L，不含木糖醇。用水將母液稀釋一倍，加3% (W/V)的活性碳60°C脫色2小時，過濾除去活性炭，得到處理后木糖母液。處理后木糖母液中含木糖165gL、葡萄糖70g/L、阿拉伯糖82g/L。將實施例2中用I. 8L發(fā)酵液收集的麥芽糖假絲酵母XU316CGMCCNO. 5692細胞重懸于3L處理后木糖母液(含木糖165g/L)中，使麥芽糖假絲酵母XU316CGMCC No. 5692細胞與處理后木糖母液中木糖的配比為O. 364干細胞/克木糖，進行木糖的細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。轉(zhuǎn)化條件如下溫度為35°C、攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm、通氣量為O. 05vvm，反應(yīng)于65小時結(jié)束，取樣，每管Iml于臺式離心機中以13000rpm離心5分鐘，上清液用于測定木糖、木糖醇、葡萄糖和阿拉伯糖濃度。實驗重復3次，結(jié)果表明木糖醇濃度為136. 7g/L，木糖濃度為10. lg/L，消耗的木糖為154. 9g/L，葡萄糖濃度為O. 21g/L，阿拉伯糖濃度81. lg/L,轉(zhuǎn)化率為O. 88克(木糖醇)/ 克(木糖)，產(chǎn)率為2. I克(木糖醇)/升·小時。其中，上述上清液中木糖的保留時間是10. 631分鐘，木糖醇的保留時間是13. 298分鐘，葡萄糖的保留時間是9. 897分鐘，阿拉伯糖的保留時間是11.691分鐘。
權(quán)利要求
1.麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa),其特征在于所述麥芽糖假絲酵母的菌株號為 XU316，保藏編號為 CGMCC No. 5695。
2.固定化酵母細胞，其特征在于所述固定化酵母細胞為固定化權(quán)利要求I所述的麥芽糖假絲酵母細胞。
3.權(quán)利要求I所述的麥芽糖假絲酵母或權(quán)利要求2所述的固定化酵母細胞在將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇中的應(yīng)用。
4.一種制備木糖醇的方法，其特征在于所述方法以含木糖的物質(zhì)作為反應(yīng)底物，利用權(quán)利要求I所述的麥芽糖假絲酵母或權(quán)利要求2所述的固定化酵母細胞將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇；所述含木糖的物質(zhì)選自下述I)-3)中的至少一種1)木糖溶液；2)木糖母液；3)含半纖維素物質(zhì)的水解物，所述含半纖維素物質(zhì)的水解物中含有木糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述含半纖維素物質(zhì)的水解物選自以下至少一種物質(zhì)玉米芯水解物、甘蔗渣水解物、木屑水解物和秸桿水解物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的反應(yīng)溫度為 25°C -40°C，如 30°C -35°C、30°C或 35°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的反應(yīng)時間為12-500小時，如52-480小時、52-66小時、52小時、66小時、65小時或480小時。
8.權(quán)利要求I所述的麥芽糖假絲酵母或權(quán)利要求2所述的固定化酵母細胞在制備木糖醇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)木糖醇的酵母菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695不僅能用純木糖為原料生產(chǎn)木糖醇，還能利用木糖生產(chǎn)過程中的水解液作為主要原料生產(chǎn)木糖醇。轉(zhuǎn)化率可接近理論值，達0.90克(木糖醇)/克(木糖)，產(chǎn)率最高可達3克(木糖醇)/升·小時以上，木糖醇濃度最高可達200克/升以上，可使生產(chǎn)成本大幅度降低，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P19/02GK102634463SQ20121007978
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者盧大軍, 江寧, 沈安, 賀鵬, 郭長纓 申請人:中國科學院微生物研究所