專利名稱：特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白ⅰ的dna適體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體，以及含有所述DNA適體的用于診斷急性心血管疾病的組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
肌鈣蛋白是由三種調(diào)節(jié)蛋白(肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T)組成的一種復(fù)合物，所述復(fù)合物連接于原肌球蛋白并位于肌肉組織中的肌動蛋白纖維之間的溝槽內(nèi)，從而調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞的收縮和舒張。Ca2+的細(xì)胞內(nèi)水平提高時，Ca2+結(jié)合于肌鈣蛋白C上的特異性位點，從而在肌鈣蛋白I中產(chǎn)生構(gòu)象變化，以使肌球蛋白可結(jié)合于肌動蛋白纖維的活性位點，產(chǎn)生肌肉的收縮。在骨骼肌和心肌中均觀察到該機(jī)能。對心肌發(fā)揮作用的肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的氨基酸序列的長度與在骨骼肌中表達(dá)的相應(yīng)的氨基酸序列長度不同。

已知心肌肌鈣蛋白I的表達(dá)水平在急性心血管疾病發(fā)作后迅速上升。因此，就急性心血管疾病的初步診斷而言，對該蛋白的檢測是非常重要的。適體為一種結(jié)合于特異性標(biāo)靶的單鏈DNA (ssDNA)或單鏈RNA (ssRNA)。得益于適體對特異性標(biāo)靶的高親和性和高穩(wěn)定性，最近它們被廣泛地研制并活躍地應(yīng)用于疾病的治療以及診斷疾病的傳感器中。適體的合成可相對容易，并且可使用細(xì)胞、蛋白甚至小的有機(jī)物質(zhì)來作為它們的標(biāo)靶，這使新的檢測方法得以發(fā)展。此外，因為適體與先前研制的抗體相比具有更良好的特異性和穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)適體可在各種領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，包括治療方法、藥物遞送系統(tǒng)、用于診斷的生物傳感器的研制等等。為診斷用途而研制的抗體使用免疫系統(tǒng)來制備，因此它們具有制備時間相對長、成本相對高的缺點。此外，與適體、DNA或RNA相比，上述為診斷用途而研制的抗體是具有較低穩(wěn)定性的蛋白，這可阻礙高度敏感的傳感器的研制。如上所提及的，盡管基于肌鈣蛋白I的抗體已研制出多種用于肌鈣蛋白I的檢測系統(tǒng)，但它們具有許多限制。因此，需要一種更為穩(wěn)定的、可以低成本操作且可有效診斷初期急性心血管疾病的檢測系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體、包含所述DNA適體的用于診斷急性心血管疾病的組合物以及包含所述DNA適體的用于診斷急性心血管疾病的試劑盒。然而，本發(fā)明將要實現(xiàn)的技術(shù)目的并非僅僅限于上面提及的目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從下列給出的描述中清楚地理解其他目的。本發(fā)明一方面提供特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的適體，所述特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的適體的堿基序列選自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO :6。本發(fā)明另一方面提供用于診斷急性心血管疾病的組合物，所述組合物包含特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體。
本發(fā)明又一方面提供用于急性心血管疾病的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒使用特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體。由于在特異性和穩(wěn)定性上比常規(guī)用于診斷急性心血管疾病的抗體更加優(yōu)越，本發(fā)明的特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體可制成生物傳感器，所述生物傳感器敏感且準(zhǔn)確地測定人心肌肌鈣蛋白I水平，這大大有助于急性心血管疾病的早期診斷。預(yù)期對診斷準(zhǔn)確性的提聞大有幫助。


本發(fā)明的上述內(nèi)容及其他目的、特征及其他優(yōu)勢將從下列結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中得到更清晰的理解，其中圖I顯示由SDS PAGE所測得的肌鈣蛋白I蛋白的表達(dá)。

圖2顯示由SDS PAGE所測得的肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白的表達(dá)。圖3顯示由凝膠過濾純化的肌鈣蛋白I蛋白的分離。圖4顯示由凝膠過濾純化的肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白的分離。圖5為顯示ssDNA適體與肌鈣蛋白I的結(jié)合強(qiáng)度的圖，所述結(jié)合強(qiáng)度根據(jù)肌鈣蛋白I的特異性適體的選擇，通過UV分光儀測得。圖6顯示SEQ ID NO :I的適體和SEQ ID NO :2的適體的二級結(jié)構(gòu)，所述SEQ IDNO 1的適體和SEQ ID NO 2的適體特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I。圖7顯示SEQ ID NO :3的適體和SEQ ID NO :4的適體的二級結(jié)構(gòu)，所述SEQ IDNO 3的適體和SEQ ID NO 4的適體特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I。圖8顯示SEQ ID NO :5的適體和SEQ ID NO :6的適體的二級結(jié)構(gòu)，所述SEQ IDNO 5的適體和SEQ ID NO 6的適體特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I。圖9為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白I蛋白與SEQ IDNO 1的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖10為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白I蛋白與SEQID NO 2的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖11為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白I蛋白與SEQID NO 3的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖12為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白I蛋白與SEQID NO 4的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖13為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白I蛋白與SEQID NO 5的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖14為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白I蛋白與SEQID NO 6的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖15為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白I蛋白與抗體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖16為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白與SEQ ID NO:I的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖17為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白與SEQ IDNO 2的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。 圖18為SPR (表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白與
SEQ IDNO : 3的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖19為SPR (表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白與SEQ IDNO :4的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖20為SPR(表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白與SEQ IDNO : 5的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。圖21為SPR (表面等離子共振)譜圖，所述SPR譜圖顯示肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白與SEQ IDNO :6的適體之間的結(jié)合強(qiáng)度。
具體實施方式
為了研制作為心肌肌鈣蛋白I的抗體的替代物的適體，在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)人心肌肌鈣蛋白I，將其純化，并用SELEX (配體指數(shù)富集法系統(tǒng)演化)技術(shù)來選擇DNA適體，隨后分析所述DNA適體的序列和結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到本發(fā)明的目的。更詳細(xì)地，本發(fā)明提供特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體，所述DNA適體的堿基序列為SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 6中的一種。另外，本發(fā)明提供用于診斷急性心血管疾病的組合物和用于診斷急性心血管疾病的試劑盒，所述組合物和試劑盒包含特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體。除了所述DNA適體之外，本發(fā)明的組合物還可包含藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。所述載體、賦形劑和稀釋劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、無定形纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、對羥基苯甲酸甲酯、羥苯丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。當(dāng)配制成劑型時，所述組合物還可包含典型的過濾器、增稠劑、粘合劑、崩解劑、表面活性劑、抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、芳香劑、乳化劑和/或防腐劑。通過以下實施例可更好地理解本發(fā)明，以下實施例是為了舉例說明，并無意限制本發(fā)明。實施例實施例I :肌鈣蛋白I基因克隆合成用于擴(kuò)增人心肌肌鈣蛋白I基因的具有BamHl的限制性位點的5’引物(GGATCC ATG GCGGAT GGG AGC AG)和具有 Hind3 的限制性位點的 3’引物(AAGCTT TCAAAACTT TTT CTT GCG G)。合成用于擴(kuò)增人心肌肌鈣蛋白T基因的具有EcoRI的限制性位點的 5’ 引物(GAATTC ATG TCT GAC ATA GAA GAG GTG GTG)和具有 XhoI 的限制性位點的 3，引物(CTCGAG CTA TTT CCA GCG CCC GGT)。合成用于擴(kuò)增人心肌肌鈣蛋白C基因的具有EcoRI 的限制性位點的 5，引物(GAATTC ATG GAT GAC ATC TAC AAG GCT GC)和具有 XhoI的限制性位點的 3’ 引物(CTCGAG CTA CTC CAC ACC CTT CAT GAA CTC)。在存在 i-pfu M合酶的條件下，使用這些引物擴(kuò)增從HEK293細(xì)胞獲取的cDNA。就這點而言，PCR按照下列步驟進(jìn)行30個循環(huán)I) 95°C使模板的雙鏈變性，持續(xù)lmin，2) 58°C使模板與所述引物退火，持續(xù)30sec,以及3) 72°C延伸新鏈,持續(xù)lmin。
用限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的人心肌肌鈣蛋白I基因和人心肌肌鈣蛋白C基因，將其連接到包含(His) 6-標(biāo)簽的pET28a載體上。用限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的人心肌肌鈣蛋白T基因，并將其連接到pET21a載體上。將肌鈣蛋白I基因和肌鈣蛋白C基因轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)E.coli內(nèi)。為了與肌鈣蛋白I共表達(dá)，將肌鈣蛋白T基因轉(zhuǎn)化至BL21-CodonPlus (DE3) -RIG E. coli 內(nèi)。實施例2 :肌鈣蛋白I蛋白的表達(dá)37°C下，在LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用所述人心肌肌鈣蛋白I基因轉(zhuǎn)化的BL21 (DE3)細(xì)胞，直到0D_(光密度)達(dá)到O. 6。然后，通過在存在O. 2mM IPTG(異丙基-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)的條件下，18°C孵育所述細(xì)胞持續(xù)16小時來誘導(dǎo)所述蛋白表達(dá)。由SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)來確定所述蛋白的表達(dá)。通過離心進(jìn)行收集之后，用PBS(IOmM磷酸鈉、150mM NaCl,pH 7.4)洗滌所述細(xì)胞一次。SDS-PAGE結(jié)果在圖I中顯7K。圖I中，指示蛋白尺寸的標(biāo)記(M)在泳道I上進(jìn)行電泳分離，IPTG誘導(dǎo)前獲取的 蛋白(bf)在泳道2上進(jìn)行電泳分離，IPTG誘導(dǎo)后獲取的蛋白(af)在泳道3上和泳道4上進(jìn)行電泳分離。如圖I的SDS PAGE所示，在IPTG誘導(dǎo)之后，在28KD處檢測到肌鈣蛋白I。實施例3 :肌鈣蛋白復(fù)合物的表達(dá)對于肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的表達(dá)而言，在37°C下，在LB (Luria Bertani)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用人心肌肌鈣蛋白I基因和肌鈣蛋白T基因轉(zhuǎn)化的BL21-CodonPluS(DE3)-RIGΕ· coli，直到OD6tltl (光密度)達(dá)到0.6 ;在37°C下，在LB (Luria Bertani)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用所述人心肌肌鈣蛋白C基因轉(zhuǎn)化的BL21 (DE3)，直到OD6c (光密度)達(dá)到O. 6。然后，通過在存在O. 2mM IPTG (異丙基-硫代-β -D-吡喃半乳糖苷)的條件下，18°C孵育細(xì)胞16小時來誘導(dǎo)所述蛋白表達(dá)。由SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)來確定所述蛋白的表達(dá)。通過離心進(jìn)行收集之后，用PBS (IOmM磷酸鈉、150mM NaCl,pH 7.4)洗滌所述細(xì)胞一次。所述SDS-PAGE結(jié)果在圖2中顯示。圖2中，指示蛋白尺寸的標(biāo)記(M)在泳道I上進(jìn)行電泳分離，在IPTG誘導(dǎo)前獲取的蛋白(bf)在泳道2上進(jìn)行電泳分離。如圖2的SDS PAGE所示，在IPTG誘導(dǎo)之后檢測到肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C。 實施例4 :肌鈣蛋白I蛋白的純化為了將在細(xì)菌細(xì)胞BL21(DE3)中表達(dá)的人心肌肌鈣蛋白I蛋白分離至高純度，在裂解緩沖液(20mM Tris、500mM NaCl、0. 5mM β -巰基こ醇、3%丙三醇、0. 01 %吐溫20，pH8. O)中裂解所述細(xì)胞，并由超聲波分解法破碎10分鐘。以15，OOOrpm的速度離心30min，從細(xì)胞碎片中分離上清液蛋白。Ni-NTA(鎳-氮川三こ酸)對(His) 6-標(biāo)簽氨基酸殘基的親和性用于將蛋白分離至高純度。就這點而言，F(xiàn)PLC(快速蛋白液相色譜)與Ni-NTA柱聯(lián)合使用，隨后將包含心肌肌鈣蛋白I的上清液上樣至所述Ni-NTA柱。因為蛋白的(His)6-標(biāo)簽與咪唑競爭，所以用洗脫緩沖液(20mM Tris、500mM NaCl,O. 5mM β -巰基こ醇、3%丙三醇、O. 01%吐溫20、300mM咪唑，pH 8.0)來洗脫結(jié)合于柱的靶蛋白。對于進(jìn)ー步純化而言,通過使用Superdex75柱的凝膠過濾,對包含心肌肌I丐蛋白的部分來進(jìn)行體積排阻色譜分析，從而獲得更純的蛋白。所使用的咪唑用最終緩沖液(20mMTris、300mM NaCl、0. 5mM β -巰基こ醇、3%丙三醇、0. 01%吐溫20，pH 8.0)除去。結(jié)果在圖3中顯示。圖3中，指示蛋白尺寸的標(biāo)記是泳道I上進(jìn)行電泳分離，從上述純化過程中所獲取的部分在泳道2上進(jìn)行電泳分離。如圖3的SDS-PAGE所示，在25kD處檢測到高純度的肌 丐蛋白I。實施例5 :肌鈣蛋白復(fù)合物(肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I)的純化為了將肌鈣蛋白復(fù)合物蛋白分離至高純度，在裂解緩沖液(20mM Tris、500mMNaCl,O. 5mM β-巰基こ醇、5%丙三醇，pH 8. O)中裂解表達(dá)肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的細(xì)胞并由超聲波分解法破碎。通過離心分離可溶蛋白。純化肌鈣蛋白T蛋白和肌鈣蛋白I蛋白時，Ni-NTA(鎳-氮川三こ酸)對(His)6-標(biāo)簽氨基酸殘基的親和性用于將蛋白分離至高純度。就這點而言，將FPLC(快速蛋 白液相色譜)與Ni-NTA柱聯(lián)合使用，隨后將包含肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I的上清液上樣于所述Ni-NTA柱。結(jié)合于柱的靶蛋白用洗脫緩沖液(20mM Tris、500mM NaCl,O. 5mM β-巰基こ醇、5%丙三醇、300mM咪唑，pH 8.0)洗脫。對于肌鈣蛋白復(fù)合物的確定和SPR的測量而言，制備了含有(His)6_標(biāo)簽的肌鈣蛋白C。肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的(His) 6-標(biāo)簽通過TEV (煙草蝕刻病毒)蛋白酶消除。具體地，為了使TEV蛋白酶在(His) 6-標(biāo)簽之后識別并消除所述標(biāo)簽，將TEV蛋白酶和蛋白在20°C下反應(yīng)6hr。肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T通過使用G-25柱除去洗脫緩沖液中的咪唑而洗脫。然后上樣于Ni-NTA柱，通過從(His)6-標(biāo)簽中分離來得到純化的肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T。含有(His)6-標(biāo)簽的肌鈣蛋白C通過Ni-NTA柱純化并由G_25柱從咪唑中洗脫。為了得到肌鈣蛋白復(fù)合物，將包含純化的(His)6_標(biāo)簽的肌鈣蛋白C與Ni-NTA偶聯(lián)，用包含肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I的上清液上樣，然后誘導(dǎo)肌鈣蛋白復(fù)合物的形成。不與肌鈣蛋白C偶聯(lián)的肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T流經(jīng)Ni-NTA，通過洗脫緩沖液獲得肌鈣蛋白復(fù)合物。就進(jìn)ー步純化而言，通過使用Superdex200柱的凝膠過濾，對包含肌鈣蛋白復(fù)合物的部分進(jìn)行體積排阻色譜分析，從而獲得更純的蛋白。所使用的咪唑用最終緩沖液(20mMTris、300mM NaCl, O. 5mM β -巰基こ醇、5%丙三醇，pH 8.0)除去。結(jié)果在圖4中顯示。圖4中，指示蛋白尺寸的標(biāo)記在泳道I上進(jìn)行電泳分離，從上述純化過程中獲取的部分在泳道2上進(jìn)行電泳分離。實施例6 :用SELEX尋找肌鈣蛋白I的適體<6-l>ssDNA (單鏈DNA)文庫的構(gòu)建構(gòu)建含有90條序列的文庫，每條序列兩端具有用于PCR擴(kuò)增和克隆的引物序列，并在所述引物序列之間具有40個堿基的隨機(jī)DNA序列(5’-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3’ )。此夕卜，5，弓丨物(5' -CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3 ' )、3’ 弓丨物(5’ -GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3’)和生物素-結(jié)合的3’引物(5’ -生物素-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3’ )也用于PCR擴(kuò)增及ssDNA的制備。本發(fā)明所使用的所有寡核苷酸均由Bionics (韓國)合成并進(jìn)行PAGE純化。
<6-2>將人心肌肌鈣蛋白I固定至Ni-NTA磁珠將純化的人心肌肌I丐蛋白I固定于磁珠Dynabead (Invitrogen公司，挪威)上,使His-標(biāo)簽結(jié)合于其鈷包被的表面。就這點而言，通過如下方式將所述蛋白固定于所述磁珠上憑借外部磁體用結(jié)合緩沖液(20mM Tris、300mM NaCl、3%丙三醇、O. 01 % 吐溫 20、5mM MgCl，pH 8. O)洗滌 20 μ L的磁珠，并用150 μ L的包含150pmol所述蛋白的結(jié)合緩沖液孵育該磁珠?！?_3>選擇人心肌肌鈣蛋白I的特異性適體為了選擇人心肌肌鈣蛋白I的特異性適體，實施了ー種使用磁體的特異性分離方法。首先，將所述ssDNA文庫(Inmol)溶解于100 μ L的結(jié)合緩沖液中，90°C下孵育 3min后,在4°C下孵育ー小時,使ssDNA形成最穩(wěn)定的構(gòu)象。然后，使該文庫與固定于磁珠的肌鈣蛋白I蛋白反應(yīng)ー小時，伴隨輕柔攪拌。然后，用結(jié)合緩沖液洗滌磁珠兩次，從而除去仍然未與固定至所述磁珠的肌鈣蛋白I結(jié)合的ssDNA。然后，從與ssDNA結(jié)合的蛋白中分離所述ssDNA。在此情況下，用洗脫緩沖液(20mMTris、300mM NaCl、3%丙三醇、(λ 01 %吐溫 20、5mM MgCl2、300mM 咪唑，ρΗ8· O)洗脫 ssDNA和與其結(jié)合的蛋白。ssDNA洗脫液在こ醇中沉淀，將得到的沉淀物溶解于100μ L的蒸餾水中，并用作PCR擴(kuò)增的模板,所述PCR擴(kuò)增在存在i-pfu聚合酶(Intron Biotechnology公司，韓國)的條件下，使用5’引物和生物素-結(jié)合的3’引物進(jìn)行。為了分離用于選擇的ssDNA，在偶聯(lián)緩沖液(5mM Tris-HCl、5mM EDTAUM NaCl,0. 01%)中，用鏈霉親和素包被的磁珠孵育生物素結(jié)合的PCR產(chǎn)物持續(xù)ー小時，然后用100 μ L的IOOmM NaOH孵育5分鐘，從而僅僅分離出ssDNA。使用外部磁體來獲得所述ssDNA。在后續(xù)的重復(fù)選擇中使用第一次選擇的ssDNA。就嚴(yán)格選擇而言，ssDNA的量和肌鈣蛋白I的濃度在后續(xù)的重復(fù)選擇中逐漸下降。在選擇的過程中，ssDNA與肌鈣蛋白I的結(jié)合通過測量重復(fù)選擇中洗脫的ssDNA的濃度來監(jiān)測,所述監(jiān)測使用UV分光儀(BiochromLibra S22分光儀)。結(jié)果在圖5中顯示。圖5顯示在適體的選擇中適體與固定于磁珠的蛋白的結(jié)合程度。所述結(jié)合程度表示為結(jié)合的適體的濃度對所使用的適體的濃度的百分比(％)。如圖5所示，結(jié)合于所述蛋白的適體DNA的數(shù)量隨著選擇次數(shù)的增加而增加。<6-4>適體的序列分析和結(jié)構(gòu)分析使用未修飾的5’引物和3’引物通過PCR對第12次重復(fù)選擇中所選的ssDNA進(jìn)行擴(kuò)增并克隆至pENTR/T0P0(T0P0 TA克隆試劑盒，Invitrogen公司，美國)，隨后轉(zhuǎn)化至E. coli T0P10 (Invitrogen公司，美國)中。然后使用小量提取試劑盒(GeneAll公司，韓國)來純化包含所述ssDNA的克隆并對其進(jìn)行堿基測序(C0SM0 Genetech公司，韓國)。由此，確定所述ssDNA的序列為SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :6，并在下表I中列出。為了分析所選擇的ssDNA的結(jié)構(gòu)相似性，使用Mfold程序(http://mfold.bioinfo. rpi. edu/cgi-bin/dna-forml. cgi)對所選出的ssDNA序列的ニ級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。 如圖6至圖8所示，發(fā)現(xiàn)它們具有共同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述共同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可歸因于連續(xù)的T-C序列。表I
SEQ ID NO 減基序列
1TCACACCCTCCCTCCCACATACCGCATACACTTTCTGATT
2CCCGACCACGTCCCTGCCCTTTCCTAACCTGTTTGTTGAT
3ATGCGTTGAACCCTCCTGACCGTTTATCACATACTCCAGA
4CAACTGTAATGTACCCTCCTCGATCACGCACCACTTGCAT
5CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA
6CGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC
實施例7 :肌鈣蛋白I與適體之間的結(jié)合強(qiáng)度的SPR(表面等離子共振)分析SPR(表面等離子共振)是發(fā)生于光與諸如金之類的金屬上的電子之間的ー種現(xiàn)象，其中，當(dāng)具有特定波長的光入射到金屬表面上吋，大部分光能量轉(zhuǎn)移到金屬的自由電子上，伴隨著倏逝波的產(chǎn)生引起共振。結(jié)合強(qiáng)度可通過測量共振波長的改變來確定，所述共振波長隨結(jié)合于金屬樣本表面的成分的改變而改變。為了測定肌鈣蛋白I與所述適體的結(jié)合強(qiáng)度，使用Ni-NTA(鎳-氮川三こ酸)包被的表面芯片(Biacore AB，瑞典)進(jìn)行SPR測量。將肌鈣蛋白I蛋白(200nM)固定至上述Ni-NTA芯片，然后與所述適體DNA偶聯(lián)。使用的適體DNA的濃度為25nM、50nM、100nM和200nM。為了對比，還測量了一種商售抗體(Abeam，英國)與心肌肌鈣蛋白I的結(jié)合強(qiáng)度。觀察到其Kd為20. InM,比本發(fā)明的適體的Kd值聞。在圖9至圖15中及表2中分別顯示了 SPR吸收數(shù)據(jù)和Kd值。表 2
適體]Kd
SEQ ID NO 1 3. 41nMSEQ ID NO 2 I.13nMSEQ ID NO 3 I.14nMSEQ ID NO 4 3.25nMSEQ ID NO 5 270pMSEQ ID NO 6 317pM抗體(對照)_ 20. InM
適體與肌鈣蛋白復(fù)合物的結(jié)合強(qiáng)度以上述相同的方式測量。所使用的適體DNA的濃度為50nM、100nM、200nM和400nM。由此，觀察到肌鈣蛋白復(fù)合物有效地結(jié)合于適體。觀察到其Kd比結(jié)合肌鈣蛋白I的Kd或類似物的Kd更高。SPR吸收數(shù)據(jù)及Kd值分別在圖16至圖21及表3中顯示。表 權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體，其中，所述DNA適體的堿基序列選自SEQ ID NO 1 至 SEQ ID NO :6。
2.一種用于診斷急性心血管疾病的組合物，所述組合物包含權(quán)利要求I所述的DNA適體。
3.一種急性心血管疾病的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒使用權(quán)利要求I所述的DNA適體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體、含有所述DNA適體的用于診斷急性心血管疾病的組合物以及含有所述DNA適體的用于診斷急性心血管疾病的診斷試劑盒。由于在特異性和穩(wěn)定性上比常規(guī)用于診斷急性心血管疾病的抗體更為優(yōu)越，所述特異性結(jié)合于人心肌肌鈣蛋白I的DNA適體可制成以高敏感度和高準(zhǔn)確度測定人心肌肌鈣蛋白I水平的生物傳感器，這大大有助于急性心血管疾病的早期診斷。預(yù)期對診斷準(zhǔn)確性的提高大有幫助。
文檔編號C12Q1/68GK102816764SQ20121001520
公開日2012年12月12日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者潘滄一, 宋炅美, 全偉政 申請人:浦項工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)