用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，水解和發(fā)酵；涉及用于將含木素纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化為包含單糖和寡糖的水解物的方法，其包括將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，和水解；涉及用于處理含木素纖維素材料的方法，其包括將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法制備的發(fā)酵產(chǎn)物。
【專利說明】用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]公開了用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
發(fā)明背景
[0002]含木素纖維素材料，或生物質(zhì)，可用于產(chǎn)生可發(fā)酵的糖，所述糖接著可用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如可再生的燃料和化學(xué)品。含木素纖維素材料是纖維素纖維包裹于木質(zhì)素和半纖維素鞘中的復(fù)合結(jié)構(gòu)。從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物包括預(yù)處理、水解和發(fā)酵含木素纖維素材料。
[0003]木素纖維素的結(jié)構(gòu)并不直接易受(accessible)酶水解。因此，預(yù)處理所述含木素纖維素材料以打斷木質(zhì)素封閉(seal)并破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，這可導(dǎo)致半纖維素級(jí)分的溶解和糖化。然后可通過酶法例如通過纖維素分解酶來水解纖維素級(jí)分，其中纖維素分解酶將糖聚合物降解為可發(fā)酵的糖。然后通過發(fā)酵生物將這些可發(fā)酵的糖轉(zhuǎn)化為所需的發(fā)酵產(chǎn)物，所述產(chǎn)物可任選地通過例如蒸餾來回收。
[0004]從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物目前非常昂貴。因此，存在對(duì)于提供其它的從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，水解(糖化)和發(fā)酵；涉及用于將含木素纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化為包含單糖和寡糖的水解物的方法，其包括將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，和水解；涉及用于處理含木素纖維素材料的方法，其包 括將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法制備的發(fā)酵產(chǎn)物。
[0006]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:
[0007](a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料；
[0008](b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合；
[0009](C)用酶組合物水解混合的含木素纖維素材料；和
[0010](d)添加發(fā)酵生物以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
[0011]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于將含木素纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化為包含單糖和寡糖的水解物的方法，其包括:
[0012](a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料；
[0013](b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合；和
[0014](c)對(duì)混合的含木素纖維素材料進(jìn)行至少部分水解以獲得包含單糖和/或寡糖的水解物。
[0015]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于處理含木素纖維素材料的方法，其包括:
[0016](a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料；和
[0017](b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合。
[0018]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法制備的發(fā)酵產(chǎn)物。
[0019]在用酸性預(yù)處理的常規(guī)方法中，在水解之前添加堿性試劑如氫氧化鈉以中和經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料；且在用堿性預(yù)處理的常規(guī)方法中，在水解之前添加酸如硫酸以中和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料。但是在本發(fā)明中，通過將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，在水解之前無需向經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和/或經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料添加其它化學(xué)品。
[0020]通過本發(fā)明的方法，改善了水解和/或發(fā)酵?；旌系慕?jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的葡萄糖轉(zhuǎn)化相當(dāng)于經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，并遠(yuǎn)好于經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料?；旌系慕?jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的木糖轉(zhuǎn)化在所有經(jīng)測(cè)試的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料中是最佳的?；旌系慕?jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的最終乙醇產(chǎn)率亦好于經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料?；旌系慕?jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的葡萄糖轉(zhuǎn)化甚至好于經(jīng)NREL預(yù)處理的含木素纖維素材料和在最佳條件下通過酸預(yù)處理的含木素纖維素材料。不拘于任何具體理論，但認(rèn)為在混合的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料中，與在經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料或經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料中相比，減少了通過預(yù)處理和中和產(chǎn)生的副產(chǎn)物例如硫酸 鹽的含量。
[0021]通過本發(fā)明的方法，可節(jié)省處理廢水的成本。在常規(guī)方法中，在所述酸預(yù)處理或堿預(yù)處理之后使用洗滌(例如通過水)調(diào)整pH或減少水解和/或發(fā)酵的抑制劑。因?yàn)楫a(chǎn)生了大量廢水，所以存在處理廢水的需要。但在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，通過將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，無需洗滌經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料。
[0022]定義
[0023]纖維素分解酶或纖維素酶
[0024]術(shù)語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β_葡糖苷酶或其組合。測(cè)量纖維素分解活性的兩種基本方法包括:(I)測(cè)量總纖維素分解活性，和(2)測(cè)量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlook forcellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006，BiotechnologyAdvances24:452-481所綜述的。總纖維素分解活性通常是使用不溶性底物來測(cè)定的，所述底物包括Whatman N0.1濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測(cè)定法是使用Whatman N0.1濾紙作為底物的濾紙測(cè)定法。該測(cè)定法是由 International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl.Chem.59:257-68)石角立的。
[0025]就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過測(cè)量在下述條件下由纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解的增加來確定:l_20mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素在50°C進(jìn)行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對(duì)照水解相比較。典型條件為:1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5，lmM MnSO4, 50 °C, 72小時(shí)，通過AM IN EX:? HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)進(jìn)行糖分析。
[0026]內(nèi)切葡聚糖酶
[0027]術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)切-1，4-(1, 3; 1，4)-P -D-葡聚糖4_葡聚糖水解酶(endo-1, 4- ^ -D-glucan4_glucanohydrolase) (E.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-P-D-糖苷鍵、混合的3-1，3葡聚糖例如谷類3-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的P-1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過測(cè)量底物粘度的減少或由還原糖測(cè)定法(Zhang等，2006，Biotechnology Advances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose, 1987, Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C，使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。
[0028]纖維二糖水解酶
[0029]術(shù)語“纖維二糖水解酶”意指1，4-3 -D-葡聚糖纖維二糖水解酶(I, 4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (E.C.N0.3.2.1.91),其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含￠-1, 4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-0-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri, 1997, Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trendsin Biotechno1gyI 5:1 60-1 67;Teeri 等,1998, Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù) Lever 等，1972，An al.Biochem.47:273-279; vanTilbeurgh 等，1982, FEBS Letters, 149:152-156; van Tilbeurgh和 Claeyssens, 1985, FEBSLetters, 187:283-288;以及 Tomme 等，1988, Eur.J.Biochem.170:575-581 描述的方法確定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，可采用Lever等的方法來評(píng)價(jià)玉米秸桿中的纖維素水解，而van Tilbeurgh等和To_e等的方法可用于確定對(duì)突光性二糖衍生物4-甲基傘形基-0 -D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-0 -D-lactoside)的纖維二糖水解酶活性。
[0030]g -葡糖苷酶
[0031]術(shù)語“ P -葡糖苷酶”意指P -D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase) (E.C.N0.3.2.1.21),其催化末端非還原P _D_葡萄糖殘基的水解,并釋放3 -D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，^ -葡糖苷酶活性是根據(jù)由Venturi等，2002, Extracellularbeta—D—glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production, purification and some biochemical properties, J.Basic Microbiol.42:55-66 所述的基本步驟確定的。一單位的￠-葡糖苷酶定義為在25°C，PH4.8從作為底物的ImM對(duì)硝基苯基-0 -D-葡糖吡喃糖苷在含有0.01% TWEEN? 20的50mM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生1.0
微摩爾的對(duì)硝基苯酚陰離子。
[0032]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽[0033]術(shù)語“具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽”意指催化具有纖維素分解活性的酶水解纖維素材料的增強(qiáng)的GH61多肽。就本發(fā)明而言，通過測(cè)量由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強(qiáng)活性:l_50mg總蛋白/g PCS中的纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的蛋白質(zhì)，在50°C歷時(shí)1_7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素分解蛋白/g PCS中的纖維素)所進(jìn)行的對(duì)照水解相比。在一個(gè)優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉(Aspergillus oryzae) β -葡糖苷酶(根據(jù)W002/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白重量的2-3%的煙曲霉(Aspergillus fumigatus) β -葡糖苷酶(如W02002/095014
所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST?
1.5L(Novozymes A/S, Bagsvajrd, Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。
[0034]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過降低達(dá)到相同水解程度所需的纖維素分解酶的量而增強(qiáng)由 具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少
1.01倍，更優(yōu)選至少1.05倍，更優(yōu)選至少1.10倍，更優(yōu)選至少1.25倍，更優(yōu)選至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。
[0035]家族61糖苷水解酶
[0036]術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根據(jù)HenrissatB.， 1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities，Biochem.J.280:309-316，及 Henrissat B.和 Bairoch A.，1996，Updatingthe sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。
[0037]半纖維素分解酶或半纖維素酶
[0038]術(shù)語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如 Shallom, D.和 Shoham, Y.Microbial hemicellulases.Current OpinionIn Microbiology, 2003，6 (3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關(guān)鍵成分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜集團(tuán)，這些多糖通過氫鍵鍵合于植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯(lián)為魯棒(robust)的網(wǎng)絡(luò)。半纖維素亦共價(jià)地附接于木質(zhì)素，與纖維素一同形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變的結(jié)構(gòu)和組織形式需要許多酶的協(xié)同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側(cè)基酯連接的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基于其一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性，可指定為以數(shù)字標(biāo)記的GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進(jìn)一步歸類為宗族(clan)，以字母標(biāo)記(例如，GH-A)。最具信息性和最新的這些和其他糖活性酶的分類可在Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù) Ghose 和 Bisaria, 1987，Pure&Appl.Chem.59:1739-1752測(cè)量。
[0039]木聚糖降解活性或木聚糖分解酶[0040]術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測(cè)定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括:(I)測(cè)定總木聚糖分解活性，和(2)測(cè)定單獨(dú)的木聚糖分解活性(例如，內(nèi)切木聚糖酶、￠-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、a-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和a-葡糖醛酸酯酶(a-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶測(cè)定法的進(jìn)展總結(jié)于幾個(gè)公開文獻(xiàn)中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006, Journalof the Science of Food and Agriculture86(I I): 1636-1647 ;Spanikova 和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced bySchizophyllum commune, FEBS Letters580 (19): 4597-4601 ；Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely,和Kubicek,，1997，The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei isa multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase, Biochemical Journal321:375-381。
[0041]總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測(cè)量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oat spelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價(jià)染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測(cè)量。最常見的總木聚糖分解活性測(cè)定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如 Bailey, Biely, Poutanen, 1992，Interlaboratory testing of methods for assay ofxylanase activity, Journal of Biotechnology23 (3): 257-270 中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C在0.01% TRITON'? X-100和200mM磷酸鈉緩沖液PH6中確定。一單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6從200mM磷酸鈉pH6緩沖液中作為底物的0.2%AZCL阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的天青精。
[0042]就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測(cè)量由木聚糖降解酶在下述典型條件下造成的樺木木聚糖(Sigma Chemical C0.，Inc.，St.Louis, MO, USA)水解的增加來確定的:1ml反應(yīng)，5mg/ml底物(總固形物),5mg 木聚糖分解蛋白/g底物，50mM乙酸鈉pH5,50 °C, 24 小時(shí)，如 Lever, 1972，A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates, Anal.Biochem47:273-279所述使用對(duì)輕基苯甲酸酸餅(PHBAH)測(cè)定法進(jìn)行糖分析。
[0043]木聚糖酶
[0044]術(shù)語“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4- ^ -D-木糖苷鍵的內(nèi)水解的1，4- ^ -D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是以0.01% TR丨TON?x-100和200mM磷酸鈉緩沖液pH6中0.2%AZCL_阿拉伯木聚糖作為底物在37°C確定的。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6從200mM磷酸鈉pH6緩沖液中作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的天青精(azurine)。
[0045]P -木糖苷酶
[0046]術(shù)語“ P -木糖苷酶”意指@ -D木糖苷木糖水解酶(P -D-xy1sidexylohydrolase) (E.C.3.2.1.37)，其催化短 3 (I — 4)木寡糖(xylooIigosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個(gè)單位的￠-木糖苷酶定義為在40°C，pH5從含有0.01% TWEEN? 20的IOOmM檸檬酸鈉中作為底物的ImM對(duì)硝基苯基-D-木糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子。[0047]乙酰木聚糖酯酶
[0048]術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶?、乙?；咎?、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸對(duì)硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸對(duì)硝基苯酯作為底物，在含有0.01%TWEEN?20的50mM乙酸鈉pH5.0中確定的。一個(gè)單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
[0049]阿魏酸酯酶
[0050]術(shù)語“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase) ”意指4_輕基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、輕基肉桂酸酯酶(hydroxycinnamoylesterase)、FAE-1I1、肉桂酸酯水解酶、FAEA, cinnAE、FAE-1或FAE-1I。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶是使用0.5mM阿魏酸對(duì)硝基苯酯作為底物在50mM乙酸鈉pH5.0中確定的。一個(gè)單位的阿魏酸酯酶等于能夠在pH5，25°C每分鐘釋放出I微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子的酶量。
[0051]α-葡糖醛酸糖苷酶
[0052]術(shù)語“ α -葡糖醛酸糖苷酶”意指a -D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase) (EC3.2.1.139)，其催化 a -D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries, 1998, J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個(gè)單位的α _葡糖醒酸糖苷酶等于能夠在pH5，40°C每分鐘釋放出I微摩爾葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。
[0053]a -L-阿拉伯呋喃糖苷 酶
[0054]術(shù)語“ a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指a _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化對(duì)a -L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a -L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對(duì)a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200 μ I中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中 5mg 的中等粘度小麥阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, C0.Wicklow, Ireland)在 40°C進(jìn)行 30 分鐘，接著通過 AMINEX? HPX-87H 柱層析(Bio-RadLaboratories, Inc., Hercules, CA, USA)的阿拉伯糖分析來確定的。
[0055]發(fā)明詳述
[0056]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:
[0057](a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料；
[0058](b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合；
[0059](C)用酶組合物水解混合的含木素纖維素材料；和[0060](d)添加發(fā)酵生物以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
[0061]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于將含木素纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化為包含單糖和寡糖的水解物的方法，其包括:
[0062](a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料；
[0063](b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合；和
[0064](C)對(duì)混合的含木素纖維素材料進(jìn)行至少部分水解以獲得包含單糖和/或寡糖的水解物。
[0065]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于處理含木素纖維素材料的方法，其包括:
[0066](a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料；和
[0067](b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合。
[0068]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法制備的發(fā)酵產(chǎn)物。_9] 含木素纖維素材料
[0070]術(shù)語“木素纖維素”或“含木素纖維素材料”或“木素纖維素材料”或“纖維素材料”意指包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細(xì)胞壁(secondary cell wall)在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn)生，同樣含有`多糖并通過共價(jià)交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈3-(l_4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，見于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵鍵合，其幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。
[0071]纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可為，但不限于，農(nóng)業(yè)殘余物、草本材料(包括能源作物)、城市固體廢物、紙漿和造紙廠殘余物、廢紙和木材(包括林業(yè)殘余物)(參見，例如，Wiselogel等，1995，于Handbook on Bioethanol (Charles E.Wyman編)，pp.105-118, Taylor&Francis, Washington D.C.;Wyman, 1994, Bioresource Technology50:3-16;Lynd, 1990, Applied Biochemistryand Biotechnology24/25:695_719;Mosier等，1999，Recent Progress in Bioconversionof LignoceIlulosics,于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T.Scheper 主編，Volume65, pp.23-40，Springer-Verlag, New York)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是任何生物質(zhì)材料。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。
[0072]在一個(gè)方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是廢紙。在另一個(gè)方面，纖維素材料是木材(包括林業(yè)殘余物)。[0073]在另一個(gè)方面，纖維素材料是蘆竹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個(gè)方面，纖維素材料是竹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是芒草屬(miscanthus)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是橙皮。在另一個(gè)方面，纖維素材料是稻桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是麥桿。
[0074]在另一個(gè)方面，纖維素材料是白楊。在另一個(gè)方面，纖維素材料是桉樹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是揪樹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是松樹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是楊樹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是云杉。在另一個(gè)方面，纖維素材料是柳樹。
[0075]在另一個(gè)方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是棉線頭(cotton linter)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是濾紙。在另一個(gè)方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是磷酸處理的纖維素。
[0076]在另一個(gè)方面，纖維素材料是水生生物質(zhì)。如用于本文中，“水生生物質(zhì)”意指在水生環(huán)境中由光合作用過程產(chǎn)生的生物質(zhì)。水生生物質(zhì)可為藻類、挺水植物(emergentplant)、浮葉植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
[0077]纖維素材料可以按原樣(as is)使用或進(jìn)行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，如本文所述。在一個(gè)優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。
[0078]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述含木素纖維素材料選自玉米秸桿、玉米穗軸、玉米纖維、柳枝稷、麥桿、稻桿、甘蔗渣和藻類，及其組合。
[0079]玉米秸桿對(duì)于高級(jí)生物乙醇產(chǎn)生是主要的木素纖維素材料之一。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將玉米秸桿用作生物質(zhì)。
[0080]不同級(jí)分的玉米秸桿包含細(xì)胞類型的不同排列。其化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)暗示所需的預(yù)處理方法對(duì)于不同級(jí)分可 具有顯著差異。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用酸性試劑預(yù)處理直立至地面上超過三英尺的玉米秸桿；和/或用堿性試劑預(yù)處理直立至地面上1-3英尺的玉米稻桿。
[0081]預(yù)處理。與本發(fā)明的方法組合，可使用本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理過程破壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料組分(Chandra 等，2007，Substrate pretreatment: The keyto effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe 和 Zacchi, 2007，Pretreatment of lignocellulosicmaterials for efficient bioethanol production, Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks 和 Zeeman, 2009，Pretreatments to enhance thedigestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol.100:10_18;Mosier等，2005，F(xiàn)eatures of promising technologies for pretreatment of lignocellulosicbiomass, Bioresource Technol.96:673-686;Taherzadeh 和 Karimi, 2008，Pretreatmentof lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas product ion: Areview, Int.J.0f Mo 1.Sc1.9:1621-1651;Yang 和 Wyman, 2008，Pretreatment: thekey to unlocking low-cost cellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts andBiorefining-Biofpr.2:26-40)。
[0082]纖維素材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行粒度減小、篩分、預(yù)浸泡、潤(rùn)濕、洗漆和/或調(diào)節(jié)/調(diào)理(conditioning)。
[0083]常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界1120、臭氧、離子性液體和Y輻射預(yù)處理。
[0084]可以在水解和/或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行?；蛘?，預(yù)處理可以與酶水解同時(shí)進(jìn)行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。
[0085]蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細(xì)胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可接觸纖維素和其它級(jí)分，例如，半纖維素。將纖維素材料經(jīng)過或通過反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu) 選在140-250°C，例如160-200°C，或170-190°C進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間優(yōu)選1-60分鐘，例如1-30分鐘，1-20分鐘，3-12分鐘，或4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時(shí)間依賴于溫度范圍和化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理允許相對(duì)較高的固體加載量，使纖維素材料在預(yù)處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的物質(zhì)的爆炸放料(explosive discharge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff 和 Murray, 1996, Bioresource Technology855:1-33; Galbe 和 Zacchi, 2002, Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國(guó)專利申請(qǐng)N0.20020164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，切割半纖維素乙?；鶊F(tuán)，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成為單糖和寡糖。去除木質(zhì)素僅至有限的程度。
[0086]化學(xué)預(yù)處理:術(shù)語“化學(xué)處理”指能促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)處理。此種預(yù)處理可將晶體纖維素轉(zhuǎn)化為無定形纖維素。合適的化學(xué)預(yù)處理工藝的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)、離子性液體和有機(jī)溶劑預(yù)處理。
[0087]經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如H2S04或S02(通常0.3至5%w/w)，其可減少時(shí)間，降低溫度，增加回收率，并改進(jìn)酶水解(Ballesteros等，2006, Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga 等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523; Sassner 等.，2006, Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是H2S04)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時(shí)間后閃變至大氣壓?？梢杂煤芏喾磻?yīng)器設(shè)計(jì)進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(DufT和Murray，1996，見上文；Schell 等，2004,Bioresource Technol.91:179-188;Lee 等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
[0088]還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于，氫氧化鈉、石灰、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。
[0089]用氧化鈣或氫氧化鈣，在85_150°C的溫度進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時(shí)間從I小時(shí)到幾天(Wyman 等，2005, Bioresource Technol.96:1959-1966;Mosier 等，2005, BioresourceTechnol.96:673-686)。W02006/11089UW02006/110899,W02006/110900 和 W02006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。
[0090]濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180-20(TC進(jìn)行5-15分鐘，加入氧化劑如過氧化氧或過壓氧(Schmidt 和 Thomsen, 1998，Bioresource Technol.64:139-151;Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga 等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin 等,2006, J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預(yù)處理優(yōu)選以1-40%干物質(zhì)，例如2-30%干物質(zhì)，或5-20%干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始pH經(jīng)常會(huì)增加。
[0091]濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時(shí)間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W02006/032282)。
[0092]氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-150 °C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨將纖維素材料處理5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat 等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh 等,2005, Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri 等,2005, Bioresource Technol.96:2014-2018)。在 AFEX 預(yù)處理過程中，纖維素和半纖維素保持相對(duì)完整。木質(zhì)素-糖復(fù)合物受切割。
[0093]機(jī)械預(yù)處理或物理預(yù)處理:術(shù)語“機(jī)械預(yù)處理”或“物理預(yù)處理”指任何促進(jìn)顆粒大小減少的預(yù)處理。舉例而言，此種預(yù)處理可涉及各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如,干磨、濕磨或振動(dòng)球磨)。
[0094]纖維素材料可經(jīng)物理(機(jī)械)和化學(xué)預(yù)處理。機(jī)械或物理預(yù)處理可與下述結(jié)合:汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸處理、高溫、高壓處理、福射(例如微波福射)，或其組合。在一個(gè)方面，高 壓指優(yōu)選約100至400psi,例如約150至約250psi的范圍的壓力。在另一個(gè)方面，高溫指約100至300°C，例如約140至約200°C范圍的溫度。在一個(gè)優(yōu)選的方面，機(jī)械或物理預(yù)處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、使用蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自Sunds Defibrator AB, Sweden的Sunds Hydrolyzer中進(jìn)行。所述物理和化學(xué)預(yù)處理可視需要順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。
[0095]因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)纖維素材料進(jìn)行物理(機(jī)械)或化學(xué)預(yù)處理，或者它們的任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。
[0096]生物預(yù)處理:術(shù)語“生物預(yù)處理”指可以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物和 / 或酶(參見，例如，Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass,于 Handbookon Bioethanol:Production and Utilization, Wyman, C.E 編，Taylor&Francis, Washington, DC, 179-212;Ghosh 和 Singh, 1993，Physicochemical and biological treatmentsfor enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMiIlan, J.D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass:areview,于 Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M.E., Baker, J.0.,和 Overend, R.P.，編,ACS Symposium Series566, American ChemicalSociety, Washington, DC,第 15 章；Gong, C.S.，Cao, N.J.，Du, J.，和 Tsao，G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology, Scheper, T.,編，Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65:207-241;Olsson 和 Hahn-Hagerdal, 1996，F(xiàn)ermentation of lignocellulosichydrolysates for ethanol production, Enz.Microb.Tech.18:312-331;和 Vallander 和Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of theart, Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
[0097]依照本發(fā)明，預(yù)處理所述含木素纖維素材料，即用酸性試劑預(yù)處理所述含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理所述含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿處理的含木素纖維素材料。
[0098]本發(fā)明中使用的用酸性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理可為任何本領(lǐng)域中已知的酸預(yù)處理。
[0099]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用酸性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理包括用酸性試劑浸泡所述含木素纖維素材料。
[0100]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用酸性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理包括用酸性試劑浸泡所述含木素纖維素材料和對(duì)所述含木素纖維素材料進(jìn)行蒸汽爆炸。
·[0101]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酸預(yù)處理使用氫氯酸、磷酸、硫酸、亞硫酸、碳酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、琥珀酸和/或可轉(zhuǎn)化為酸的化學(xué)品如氯化氫、磷酸酐、二氧化硫、二氧化碳；或其混合物進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酸為硫酸。
[0102]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水溶液中酸性試劑的濃度為0.05-10%(W/W)，優(yōu)選 0.1-5% (w/w)，更優(yōu)選 0.3-2.5% (w/w)。
[0103]可將酸與生物質(zhì)和混合物接觸數(shù)分鐘至數(shù)秒范圍的時(shí)間。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酸預(yù)處理進(jìn)行I分鐘至300分鐘，優(yōu)選30分鐘至250分鐘，更優(yōu)選60分鐘至150分鐘的時(shí)間。
[0104]可將酸與生物質(zhì)和化合物在本領(lǐng)域中已知的溫度相接觸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酸預(yù)處理在130°C至270°C，優(yōu)選150°C至230°C，更優(yōu)選160°C至200 V的溫度進(jìn)行。
[0105]優(yōu)選地，所述酸預(yù)處理是用有機(jī)和/或無機(jī)酸進(jìn)行的連續(xù)的稀酸或弱酸處理。弱酸處理意指處理PH處于約pHl至5，優(yōu)選約pHl至3的范圍。盡管如此，甚至這種弱酸預(yù)處理仍在對(duì)于水解和/或發(fā)酵不具吸引力的相對(duì)較低PH進(jìn)行。通常的纖維素分解和半纖維素分解酶和/或通常發(fā)酵生物的活性在該P(yáng)H范圍較低。因此，為了取得有效的酶水解和/或發(fā)酵，升高PH是必需的。一種升高pH的方法是通過在酶水解和/或發(fā)酵之前洗滌經(jīng)酸預(yù)處理的生物質(zhì)。然而，這導(dǎo)致大量水的使用。作為昂貴的額外工藝步驟，洗滌在產(chǎn)業(yè)規(guī)模是不合算且不可持續(xù)的。另一種升高經(jīng)預(yù)處理的材料的PH的方式是通過用堿如氫氧化鈉(NaOH)中和酸。但這導(dǎo)致低價(jià)值的鹽作為副產(chǎn)物形成。本發(fā)明的方法完善地解決了在用酸性試劑進(jìn)行預(yù)處理之后木素纖維素的低PH值的問題。
[0106]在本發(fā)明中使用的用堿性試劑對(duì)含木素纖維素材料進(jìn)行的預(yù)處理可為任何本領(lǐng)域中已知的堿性預(yù)處理。
[0107]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用堿性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理包括用堿性試劑浸泡所述含木素纖維素材料。[0108]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述堿性試劑選自下組:氫氧化鈣(Ca(OH)2),氧化鈣(CaO)，氨(NH3)，氫氧化鈉(NaOH)，碳酸鈉(NaCO3)，氫氧化鉀(KOH)，尿素,和/或其組合。
[0109]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，水溶液特別是硫酸中堿性試劑的濃度是0.1-50% (w/w),優(yōu)選 0.5-40% (w/w),更優(yōu)選 5-25% (w/w)。
[0110]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)于用堿性試劑的預(yù)處理，含木素纖維素材料的總固體為 l_80%(w/w),優(yōu)選 5_50%(w/w),更優(yōu)選 8_30%(w/w)。
[0111]可將堿性試劑與生物質(zhì)和混合物接觸數(shù)分鐘至數(shù)秒范圍的時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用堿性試劑對(duì)含木素纖維素材料進(jìn)行的預(yù)處理進(jìn)行I分鐘至300分鐘，優(yōu)選30分鐘至250分鐘，更優(yōu)選60分鐘至150分鐘的時(shí)間。
[0112]優(yōu)選地，所述堿性預(yù)處理是在溫和溫度進(jìn)行的堿性預(yù)處理，例如，在50°C至120°C，優(yōu)選約 70°C至約 100°C。
[0113]優(yōu)選地，所述堿預(yù)處理的pH處于約pH8.0至14.0，優(yōu)選約pH10.0至12.0的范圍。盡管如此，在相對(duì)較高PH進(jìn)行的堿預(yù)處理對(duì)于水解和/或發(fā)酵不具吸引力。通常的纖維素分解和半纖維素分解酶和/或通常發(fā)酵生物的活性在該P(yáng)H范圍較低。因此，為了取得有效的酶水解和/或發(fā)酵，降低PH是必需的。一種降低pH的方法是通過在酶水解之前洗滌經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)。然而，這導(dǎo)致大量水的使用。作為昂貴的額外工藝步驟，洗滌在產(chǎn)業(yè)規(guī)模是不合算且不可持續(xù)的。另一種降低經(jīng)預(yù)處理的材料的PH的方式是通過用酸如硫酸和乙酸，或用CO2中和堿。但這導(dǎo)致低價(jià)值的鹽作為副產(chǎn)物形成。本發(fā)明的方法完善地解決了在用堿性試劑進(jìn)行預(yù)處理之后木素纖維素的高PH值的問題。
[0114]或者，或與本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案組合，在進(jìn)一步的一些實(shí)施方案中，將酸預(yù)處理和/或堿預(yù)處理在其它化學(xué)預(yù)處理 、機(jī)械預(yù)處理和/或生物預(yù)處理之前進(jìn)行，之后進(jìn)行，與其它化學(xué)預(yù)處理、機(jī)械預(yù)處理和/或生物預(yù)處理組合，和/或整合。
[0115]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理兩者。所述化學(xué)和機(jī)械預(yù)處理可視需要順序或同時(shí)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用酸性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理包括用酸性試劑浸泡所述含木素纖維素材料和對(duì)所述含木素纖維素材料進(jìn)行蒸汽爆炸。
[0116]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用堿性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理包括用酸性或堿性試劑在約50°C至約150°C，優(yōu)選約70°C至約120°C的范圍的溫度下浸泡所述含木素纖維素材料。
[0117]根據(jù)本發(fā)明，所述纖維素材料可在水解之前或過程中預(yù)處理。優(yōu)選地，預(yù)處理在水解之前進(jìn)行。在此情況下，預(yù)處理有時(shí)稱為預(yù)水解?；蛘?，預(yù)處理可與水解同時(shí)進(jìn)行，如添加一種或多種纖維素分解酶或其它酶活性同時(shí)進(jìn)行，以釋放例如可發(fā)酵的糖如葡萄糖或麥芽糖。
[0118]濕僉
[0119]在本發(fā)明的方法中，在酸預(yù)處理和堿預(yù)處理之后，將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將混合的含木素纖維素材料調(diào)整至PH3-8，優(yōu)選pH4-6，特別是pH5左右。
[0120]預(yù)料不到的是通過將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，水解和/或發(fā)酵與對(duì)于經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料或經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料相比得到改善。混合的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的葡萄糖轉(zhuǎn)化相當(dāng)于經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，并遠(yuǎn)好于經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料。混合的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的木糖轉(zhuǎn)化在所有經(jīng)測(cè)試的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料中是最佳的?；旌系慕?jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的最終乙醇產(chǎn)率亦好于經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料?；旌系慕?jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料的葡萄糖轉(zhuǎn)化甚至好于經(jīng)NREL預(yù)處理的含木素纖維素材料和在最佳條件下用酸預(yù)處理的含木素纖維素材料。不拘于任何具體理論，但認(rèn)為在混合的經(jīng)預(yù)處理的含木素纖維素材料中，與在經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料或經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料中相比，減少了通過預(yù)處理和中和產(chǎn)生的副產(chǎn)物的含量，從而改善了水解和/或發(fā)酵。
[0121]通過將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，無需添加大量化學(xué)品 包括堿和酸，以供在水解之前進(jìn)行PH中和，并因此可節(jié)省所述化學(xué)品。在用酸預(yù)處理的常規(guī)方法中，添加堿如氫氧化鈉以中和經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料；而在用堿預(yù)處理的常規(guī)方法中，添加酸如硫酸以中和經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料。
[0122]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可洗滌經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)。然而，洗滌并不是必需要求的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，不洗滌經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)。通過將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合，無需處理廢水，并因此節(jié)省了處理廢水的成本。在常規(guī)方法中，洗滌，如通過水的洗滌，在酸預(yù)處理或堿預(yù)處理之后用于調(diào)整PH和/或減少對(duì)于水解和/或發(fā)酵的抑制劑。洗滌在產(chǎn)業(yè)規(guī)模是不合算且不可持續(xù)的。
[0123]水解(糖化)。
[0124]在水解(也稱作糖化)步驟中，將(例如經(jīng)預(yù)處理的)纖維素材料水解以將纖維素和半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物以酶法在本發(fā)明具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下進(jìn)行。組合物的酶可以同時(shí)或順序加入。
[0125]酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的水性環(huán)境中進(jìn)行。在一個(gè)方面，水解在適于酶組分的活性，即對(duì)于酶組分最佳的條件下進(jìn)行。水解可以以補(bǔ)料批式或連續(xù)的過程進(jìn)行，其中將纖維素材料逐漸補(bǔ)入，例如，含酶的水解溶液中。
[0126]糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的處理時(shí)間、溫度和PH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)200小時(shí)，但是通常優(yōu)選進(jìn)行約12至約120小時(shí)，例如約16至約72小時(shí)，或約24至約48小時(shí)。溫度優(yōu)選約25°C至約70°C，例如約30°C至約65°C，約40°C至約60°C，或約50°C至55°C的范圍。pH優(yōu)選約3至約8，例如約3.5至約7，約4至約6，或約pH5.0至約pH5.5的范圍。干燥固體含量?jī)?yōu)選約5至約50wt%,例如約10至約40wt%,或20至約30wt%。
[0127]酶組合物可包含任何可用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的蛋白。
[0128]在一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(例如幾種)選自下組的蛋白/多肽:纖維素酶、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，半纖維素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。在另一個(gè)方面，所述纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(例如幾種)選自下組的酶:內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和￠-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述半纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(例如幾種)選自下組的酶:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
[0129]在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含一種或多種(例如幾種)纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(例如幾種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含一種或多種(例如幾種)纖維素分解酶和一種或多種(例如幾種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含一種或多種(例如幾種)選自下組的酶:纖維素分解酶和半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含β_葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含纖維二糖水解酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含β_葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含纖維二糖水解酶、β -葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。
[0130]在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一個(gè)方面,所述酶組合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含香豆酸酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含阿魏酸酯酶。在另一個(gè)方面， 所述酶組合物包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和或半乳糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如a-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含甘露聚糖酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含甘露糖苷酶(例如β_甘露糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含木聚糖酶。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一個(gè)方面,所述酶組合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
[0131]在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含酯酶。在另一個(gè)方面,所述酶組合物包含棒曲霉素。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含漆酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含木質(zhì)素分解酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是錳過氧化物酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是木質(zhì)素過氧化物酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是產(chǎn)生H2O2的酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含果膠酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含蛋白酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含膨脹素。
[0132]在本發(fā)明的工藝中，酶可在糖化、糖化和發(fā)酵、或發(fā)酵之前或過程中添加。
[0133]所述酶組合物的一種或多種(例如幾種)組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。舉例而言，一種或多種(例如幾種)組分可為細(xì)胞的天然蛋白，其用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá)酶組合物的一種或多種(例如幾種)其他組分。酶組合物的一種或多種(例如幾種)組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。
[0134]用于本發(fā)明工藝中的酶可為任何適用于如例如發(fā)酵液配制物或細(xì)胞組合物，含或不含細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解液，半純化或純化的酶制備物，或宿主細(xì)胞，作為酶的來源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護(hù)的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機(jī)酸來穩(wěn)定化。
[0135]具有纖維二糖水解酶活性的酶和多肽的最適量取決于幾個(gè)因素，其包括但不限于，組分纖維素分解酶和/或半纖維素分解酶的混合物、纖維素材料、纖維素材料的濃度、纖維素材料的預(yù)處理、溫度、時(shí)間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。
[0136]在一個(gè)方面，纖維素分解或半纖維素分解酶對(duì)于纖維素材料的有效量是約0.1至約50mg,例如約0.1至約40mg,約0.5至約25mg,約0.75至約20mg,約0.75至約15mg,約0.5至約IOmg,或約2.5至約IOmg每g纖維素材料。
[0137]在另一個(gè)方面，具有纖維二糖水解酶活性的多肽對(duì)于纖維素材料的有效量是約0.01至約50.0mg,例如約0.01至約40mg,約0.01至約30mg,約0.01至約20mg,約0.01至約 IOmg,約 0.01 至約 5mg,約 0.025 至約 1.5mg,約 0.05 至約 1.25mg,約 0.075 至約 1.25mg,約0.1至約1.25mg,約0.15至約1.25mg,或約0.25至約1.0mg每g纖維素材料。
[0138]在另一個(gè)方面，具有纖維二糖水解酶活性的多肽對(duì)于纖維素分解或半纖維素分解酶的有效量是約0.005至約1.0g,例如約0.01至約1.0g,約0.15至約0.75g，約0.15至約
0.5g,約0.1至約0.5g,約0.1至約0.25g,或約0.05至約0.2g每g纖維素分解或半纖維素分解酶。
[0139]具有纖維素分解酶活性或半纖維素分解酶活性的多肽，以及任何可用于纖維素材料的降解的蛋白/多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽(在本文中統(tǒng)稱為具有酶活性的多肽)酶可源自或獲得自任何合適的來源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動(dòng)物來源。術(shù)語“獲得的”在本文中還意指該酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重組產(chǎn)生，其中經(jīng)重組產(chǎn)生的酶對(duì)于宿主生物是天然的或異源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶，其為天然氨基酸序列的片段和/或突變體或通過本領(lǐng)域已知的氨基酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的含義中涵蓋的是天然變體，而外來酶的含義中涵蓋的是重組(如通過定位誘變或重排)獲得的變體。
[0140]具有酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)、熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)、熱酸菌屬(Acidothermus)、Thermobifidia 或海洋芽抱桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。
[0141]在一個(gè)方面，所述多肽是具有酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)多月太。
[0142]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多妝。
[0143]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)或淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)多妝。
[0144]具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬(Yarrowia)多肽，其具有酶活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格抱屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(C`eriporiopsis)、毛 _ 殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、奉巴齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有酶活性。
[0145]在一個(gè)方面，所述多肽是具有酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多妝。
[0146]在另一個(gè)方面，所述多肽是具有酶活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium Iucknowense^ 熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、 租金 抱子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、禾谷鐮孢(Fusarium cerealis)、庫(kù)威鐮孢(Fusarium crookwellense)、大刀德抱(Fusarium cuImorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱(Fusarium negundi)、尖德抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusarium roseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圓德抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、白把齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、無色梭抱殼(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭抱殼(Thielavia australeinsis)、T hielavia fimet1、小抱梭抱殼(Thielavia microspora)、卵抱梭抱殼(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭抱霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、綠色木霉(Trichoderma viride)或褐抱長(zhǎng)毛盤菌(Trichophaea saccata)多妝。
[0147]還可以使用具有酶活性的多肽經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。
[0148]酶組合物的一種或多種(例如幾種)組分可以是重組組分，亦即，通過克隆編碼所述單獨(dú)組分的DNA序列并隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)(參見，例如，W091/17243和W091/17244)產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對(duì)宿主是外源的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對(duì)宿主是天然的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵液中提純這樣的蛋白質(zhì)來制備。
[0149]在一個(gè)方面，所述一種或多種(例如幾種)纖維素分解酶包含商業(yè)性纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)的纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如，CELLIC?Ctec (Novozymes A/S) CCLLIC? CTec2 (Novozymes A/S)、CELLUCLAST? (Novozymes A/S)、N0V0ZYM?188 (Novozymes A/S)、CELLUZYME? (Novozymes A/S)、CEREFLO? (NovozymesA/S)和 ULTRAFLO? (Novozymes A/S)，ACCELERASE? (Genencor Int.), LAMINEX?(GenencorInt.)、SPEZYME?CP(Genencor Int.) , FILTRASE? NL (DSM)、METHAPLUS?S/L100 (DSM), R0HAMENT?7069ff (Rohm GmbH),和 FiBREZYME? LDI (DyadicInternational, Inc.) > T IRRFZYMFCfc1 LBR (Dyadic International, Inc.)或VISCOSTAR⑧ 150L (Dyadic International, Inc.)。所述纖維素酶以固體的約 0.001 至約5.0wt%，例如固體的0.025至約4.0wt%，或固體的約0.005至約2.0wt%的有效量添加。
[0150]可以用于本發(fā)明的工藝的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(W091/05039 ；W093/15186;美國(guó)專利 5, 275, 944 ；W096/02551 ;美國(guó)專利 5,536,655，W000/70031, W005/093050)；Thermobifida fusca 內(nèi)切葡聚糖酶 III (W005/093050) jPThermobifida fusca 內(nèi)切葡聚糖酶 V(W005/093050)。
[0151]可以用于本發(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶 KPenttila 等，1986，Gene45:253_263，里氏木霉 Cel7B 內(nèi)切葡聚糖酶 I ；GENBANK?登錄號(hào)M15665);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IKSaloheimo等，1988，Gene63:11-22，里氏木霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II ;GENBANK?登錄號(hào)M19373);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III (Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563 ;GENBANK? 登錄號(hào) AB003694);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶 V (Saloheimo 等,1994, Molecular Microbiology 13:219-228 ；GENBANK? 登錄號(hào) Z33381);棘抱曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi 等，1990，Nucleic Acids Researchl8:5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto 等,1995, CurrentGenetics27:435-439);胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti 等，1990，Gene90:9-14);尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK? 登錄號(hào) L29381)；灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號(hào)AB003107) ；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號(hào)MAL515703);粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號(hào)XM_324477);特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V ;嗜熱毀絲霉CBSl 17.65內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱(basidi0myCete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株N0.VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK? 登錄號(hào) Ml5665)。
[0152]可用于本發(fā)明的纖維二糖水解酶的實(shí)例包括但不限于，棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)纖維二糖水解酶 II (W02011/059740),嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I，嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II，特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)纖維二糖水解酶I，嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)纖維二糖水解酶 II (W02009/042871)，Thielavia hyrcanie 纖維二糖水解酶 II (W02010/141325)，土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纖維二糖水解酶 II (CEL6A，W02006/074435)，里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維二糖水解酶I，里氏木霉纖維二糖水解酶II，和褐孢長(zhǎng)毛盤菌(Trichophaea saccata)纖維二糖水解酶 II (W02010/057086)。[0153]可用于本發(fā)明的￠-葡糖苷酶的實(shí)例包括但不限于，來自棘孢曲霉(Kawaguchi等，1996，Genel73:287-288)，煙曲霉(W02005/047499),黑曲霉(Dan 等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980),米曲霉(W02002/095014),巴西青霉(Penicillium brasiIianum)IBT20888 (W02007/019442 和 W02010/088387)，土生梭孢霉(W02011/035029)，以及褐孢長(zhǎng)毛盤菌(W02007/019442)的P -葡糖苷酶。
[0154]所述￠-葡糖苷酶可為融合蛋白。在一個(gè)方面，所述￠-葡糖苷酶是米曲霉￠-葡糖苷酶變體BG融合蛋白(W02008/057637)或米曲霉P -葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)。
[0155]其它可用的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和￠-葡糖苷酶公開于使用根據(jù) Henrissat B.， 1991，A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities, Biochem.J.280:309-316 和 Henrissat B.和Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases, Biochem.J.316:695-696的分類的許多糖基水解酶家族中。
[0156]其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于W098/13465、W098/015619、W098/015633、W099/06574、W099/10481、W099/025847、W099/031255、W02002/101078,W02003/027306, W02003/052054, W02003/052055, W02003/052056, W02003/052057,W02003/052118, W02004/016760, W02004/043980, W02004/048592, W02005/001065,W02005/028636, W02005/093050, W02005/093073, W02006/074005, W02006/117432,TO2007/071818、TO2007/071820、TO2008/008070、TO2008/008793、美國(guó)專利 N0.5，457，046、美國(guó)專利N0.5，648，263以及美國(guó)專利N0.5，686，593。
[0157]在本發(fā)明的方法中，可使用任何具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽。
[0158]在一個(gè)方面，所述 具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽包含下述基序:
[0159][ILMV]-P-X (4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X (4) - [HNQ]和[Fff]-[TF] -K-[AIV],
[0160]其中X為任意氨基酸，X(4，5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而X(4)是在4個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。
[0161]包含上述所示的基序的分離的多肽可進(jìn)一步包含:
[0162]H-X (1，2) -G-P-X (3) - [Yff] - [AILMV],
[0163][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或
[0164]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],
[0165]其中X為任意氨基酸，X(l, 2)為在I個(gè)位置或2個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，X(3)為3個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而X (2)為2個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。
[0166]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的GH61多肽進(jìn)一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的GH61多肽進(jìn)一步包含[EQ] -X-Y-X⑵-C-X- [EHQN] - [FILV] -X-[ILV]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的GH61多肽進(jìn)一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。[0167]在第二個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽包含下述基序:
[0168][ILMV]-P-X(4，5)—G—X—Y—[ILMV]—X—R—X—[EQ]-X (3)-A-[HNQ]，
[0169]其中X為任意氨基酸，X (4，5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而X (3)為3個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。
[0170]可用于本發(fā)明的方法的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的實(shí)例包括但不限于:來自土生梭孢霉(W02005/074647, W02008/148131,和 W02011/035027)，橙橘嗜熱子囊菌(W02005/074656 和 W02010/065830)，里氏木霉(W02007/089290)，嗜熱毀絲霉(W02009/085935，W02009/085859，W02009/085864，W02009/085868)，煙曲霉(W02010/138754)的GH61多肽，來自嗜松青霉(W02011/005867)，嗜熱子囊菌屬菌種(W02011/039319),青霉屬菌種(W02011/041397),和 Thermoascuscrustaceous(W02011/041504)的 GH61 多肽。
[0171]在另一個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽在根據(jù)W02008/151043所述的可溶性活化二價(jià)金屬陽(yáng)離子，例如硫酸錳的存在下使用。
[0172]在另一個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽在二氧化合物、二環(huán)化合物、雜環(huán)化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或從經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料(如經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS))獲得的液劑的存在下使用。
[0173]所述二氧化合物可包括任何含有兩個(gè)或更多氧原子的合適化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模塊(moiety)。所述二氧化合物可包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))羥基和/或羥基衍生物，但亦包括缺乏羥基和羥基衍生物的取代的芳基模塊。二氧化合物的非限定性實(shí)例包括鄰苯二酚或兒茶酚；咖啡酸；3，4-二羥基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯二酚；聯(lián)苯三酚；沒食子酸；甲基_3，4，5-三羥基苯甲酸；2，3，4-三羥基二苯甲酮； 2，6- 二甲氧基苯酚；芥子酸；3，5- 二羥基苯甲酸；4_氯-1，2-苯二酚；4_硝基-1，2-苯二酚；鞣酸；沒食子酸乙酯；羥乙酸甲酯；二羥基延胡索酸；2_ 丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2，4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2，4，4’ -三羥基二苯甲酮；順-2- 丁烯-1，4- 二醇；3，4- 二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2- 二酮；二羥基丙酮；乙酰丙烯醛(acrolein acetal);甲基_4_羥基苯甲酸；4-羥基苯甲酸；和甲基-3，5- 二甲氧基-4-輕基苯甲酸；或它們的鹽或溶劑合物(solvate)。
[0174]所述二環(huán)化合物可包括任何如本文中所述的合適的取代稠環(huán)系統(tǒng)。所述化合物可包含一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))另外的環(huán)，且除非另行說明，不限于具體的環(huán)數(shù)。在一個(gè)方面，所述二環(huán)化合物是類黃酮。在另一個(gè)方面，所述二環(huán)化合物是任選取代的異類黃酮(isoflavonoid)。在另一個(gè)方面，所述二環(huán)化合物是任選取代的花色鮮離子(f IavyIium ion)，如任選取代的花色素或任選取代的花色苷，或其衍生物。二環(huán)化合物的非限定性實(shí)例包括表兒茶素(epicatechin);槲皮素(quercetin);楊梅黃酮(myricetin)；黃杉素(taxifolin);山奈酌.(kaempferol);桑素(morin);金合歡素(acacetin);柚皮素(naringenin);異鼠李黃素(isorhamnetin);療菜苷配基(apigenin);花青素(cyanidin);花色素苷(cyanin) ;kuromanin ;花青素鼠李葡糖苷(keracyanin);或它們的鹽或溶劑合物。
[0175]所述雜環(huán)化合物可為任何合適的化合物，如本文中所述的任選取代的包含雜原子的芳環(huán)或非芳環(huán)。在一個(gè)方面，所述雜環(huán)是包含任選取代的雜環(huán)烷基模塊或任選取代的雜芳基模塊的化合物。在另一個(gè)方面，所述任選取代的雜環(huán)烷基模塊或任選取代的雜芳基模塊是任選取代的五元雜環(huán)烷基或任選取代的五元雜芳基模塊。在另一個(gè)方面，任選取代的雜環(huán)烷基或任選取代的雜芳基模塊是選自如下的任選取代的模塊:吡唑基、呋喃基、咪唑基、異噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氫噻吩-批唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫卻基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并卩惡唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、異喹啉基、異1?丨哚基、B丫唳基、苯并異惡唑基(benzoisazoIyI)、二甲基乙內(nèi)酰脲、吡嗪基、四氫呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、嗎啉基、卩引哚基、二氮雜環(huán)庚三烯基(diazepinyl)、氮雜環(huán)庚三烯基(azepinyl)、硫雜環(huán)庚三烯基(thiepinyl)、哌唳基和氧雜環(huán)庚三烯基(oxepinyl)。在另一個(gè)方面,所述任選取代的雜環(huán)烷基模塊或任選取代的雜芳基模塊是任選取代的呋喃基。雜環(huán)化合物的非限定性實(shí)例包括(1，2-二羥乙基)-3，4-二氫呋喃-2(5H)_酮；4_羥基-5-甲基_3_呋喃酮；5-羥基-2 (5H)-呋喃酮；[1，2-二羥乙基]呋喃-2，3，4 (5H)-三酮；a-羥基-Y-丁內(nèi)酯；核糖酸 Y-內(nèi)酯；己醒糖酸 Y-內(nèi)酯(aldohexuronicaldohexuronic acid y -lactone);葡糖酸S-內(nèi)酯；4-羥基香豆素；二氫苯并呋喃；5-(羥甲基)糠醛；糠偶姻(furoin) ;2(5H)_呋喃酮；5，6- 二氫-2H-吡喃-2-酮；和5，6- 二氫-4-羥基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它們的鹽或溶劑合物。
[0176]所述含氮化合物可為任何具有一個(gè)或多個(gè)氮原子的合適化合物。在一個(gè)方面，所述含氮化合物包含胺、亞胺、羥胺或氧化亞氮(nitroxide)模塊。含氮化合物的非限定性實(shí)例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2_氨基苯酚；1，2_苯二胺；2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy) ;5，6，7，8_四氫生物蝶呤；6，7- 二甲基-5，6，7，8-四氫蝶呤；和馬來酰胺酸；或它們的鹽或溶劑合物。
[0177]所述醌化合物可為任何本文中所述的包含醌模塊的合適的化合物。醌化合物的非限定性實(shí)例包括1，4-苯醌；1，4-萘醌；2_羥基-1，4-萘醌；2，3- 二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌或輔酶Qtl ;2，3，5，6-四甲基-1，4-苯醌或四甲基對(duì)苯醌；1，4- 二羥基蒽醌；3-羥基-1-甲基-5，6- 二氫吲哚二酮或腎上腺色素；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯醌；批咯并喹啉醌(pyrroloquinolin e quinone);或它們的鹽或溶劑合物。
[0178]所述含硫化合物可為任何包含一個(gè)或多個(gè)硫原子的合適的化合物。在一個(gè)方面，所述含硫化合物包含選自亞硫酰，硫醚，亞磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide),磺酸和磺酸酯的模塊。含硫化合物的非限定性實(shí)例包括乙硫醇；2_丙硫醇；2_丙烯-1-硫醇；2_巰基乙磺酸；苯硫醇；苯-1，2- 二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它們的鹽或溶劑合物。
[0179]在一個(gè)方面此種如上所述的化合物對(duì)纖維素材料的有效量，作為對(duì)纖維素的糖單元的摩爾比例為約KT6至約10，例如約1(T6至約7.5，約1(T6至約5，約1(T6至約2.5，約1(T6至約1，約1(T5至約1，約KT5至約10'約KT4至約10'約KT3至約10'或約KT3至約10'在另一個(gè)方面，此種如上所述的化合物的有效量為約0.1 u M至約1M，例如約0.5 ii M至約 0.75M,約 0.75 ii M 至約 0.5M,約 I y M 至約 0.25M,約 I y M 至約 0.1M,約 5 y M 至約 50mM，約10 ii M至約25mM，約50 y M至約25mM，約10 y M至約10mM，約5 y M至約5mM，或約0.1mM至約ImM。[0180]術(shù)語“液劑(liquor) ”意指在本文中所述的條件下，通過處理漿料中的木素纖維素和/或半纖維素材料，或其單糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所產(chǎn)生的溶液相，即水相、有機(jī)相或其組合，及其可溶性內(nèi)含物。用于GH61多肽的纖維素分解增強(qiáng)的液劑可通過，任選在催化劑例如酸的存在下，任選在有機(jī)溶劑的存在下，且任選與所述材料的物理破壞相組合來藉由施加熱和/或壓力來處理木素纖維素材料或半纖維素材料(或原料)，然后將溶液從剩余固體分離來產(chǎn)生。此類條件確定在通過纖維素酶制備物水解纖維素底物過程中，通過液劑和GH61多肽的組合可獲得的纖維素分解增強(qiáng)的程度。所述液劑可使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法如過濾、沉積或離心從經(jīng)處理的材料分離。
[0181]在一個(gè)方面，所述液劑對(duì)纖維素的有效量為約10_6至約IOg每g纖維素，例如約1(Γ6至約7.5g,約1(Γ6至約5,約1(Γ6至約2.5g,約1(Γ6至約Ig,約1(Γ5至約Ig,約1(Γ5至約10、，約I(T4至約10、，約I(T3至約10、，或約I(T3至約10、每g纖維素。
[0182]在一個(gè)方面，所述一種或多種(例如幾種)半纖維素分解酶包含商業(yè)性半纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)性半纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如 SHEARZYME? (Novozymes A/S)、CELLIC? HTec (Novozymes A/S)、CELLIC?
Htec2 (Novozymes A/S)、 VISCOZYME? (Novozymes A/S)、 ULTRAFLO?(Novozymes A/S)、 PULPZYME? HC(Novozymes A/S)、 MULTIFECT?Xylanase (Genencor) > ACC ELLERA S Ε0?) XY (Genencor) > AC C ELLE RA SE?XC(Genencor)、 ECOPULP? TX_200A(AB Enzymes)、HSP6000Xylanase (DSM)、DEP0L?333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK)、DEP0L?740L (Biocatalysts Limit, Wales,UK)和 DEP0L?762P(BiocatalystsLimit, Wales, UK)。
[0183]可用于本發(fā)明工藝的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于來自棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790;W094/21785)、煙曲霉(TO2006/078256)、嗜松青霉(W02011/041405)、青霉屬菌種(W02010/126772)、土生梭孢霉NRRL8126(W02009/079210)和褐孢長(zhǎng)毛盤菌GHlO (W02011/057083)的木聚糖酶`。
[0184]可用于本發(fā)明工藝的木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于來自粗糙脈孢菌(Neurospora crassa) (SwissProt 登錄號(hào) Q7S0W4)、里氏木霉 β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL 登錄號(hào) Q92458)和埃默森踩節(jié)菌(Talaromyces emersonii) (SwissProt 登錄號(hào)Q8X212)的β-木糖苷酶。
[0185]可用于本發(fā)明工藝的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于來自棘孢曲霉(W02010/108918)、球毛殼菌(Chaetomium globosum) (Uniprot 登錄號(hào) Q2GWX4)、細(xì) _毛殼菌(Chaetomium gracile) (GeneSeqP 登錄號(hào) AAB82124)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)DSM1800(TO2009/073709)、紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina) (TO2005/001036)、嗜熱毀絲霉(Wo2010/014880)、粗糙脈孢菌(UniProt 登錄號(hào) q7s259)、穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum) (Uniprot 登錄號(hào) Q0UHJ1)和土生梭孢霉 NRRL8126 (W02009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。
[0186]可用于本發(fā)明工藝的阿魏酸酯酶的實(shí)例包括但不限于來自特異腐質(zhì)霉DSM1800 (W02009/076122)、費(fèi)希新薩托菌(Neosartorya fischer) (UniProt 登錄號(hào)A1D9T4)、粗糙脈孢菌(UniProt登錄號(hào)Q9HGR3)、橘灰青霉(W02009/127729)和土生梭孢霉(W02010/053838 和 W02010/065448)的阿魏酸酯酶。
[0187]可用于本發(fā)明工藝的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于來自黑曲霉(Aspergillus niger) (GeneSeqP 登錄號(hào) AAR94170)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)DSM1800(W02006/114094 和 W02009/073383)和巨多孔菌(M.giganteus) (W02006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0188]可用于本發(fā)明工藝的a-葡糖醛酸糖苷酶的實(shí)例包括但不限于來自棒曲霉(Aspergillus clavatus) (UniProt 登錄號(hào) alccl2)、煙曲霉(SwissProt 登錄號(hào) Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot 登錄號(hào) Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus) (SwissProt 登錄號(hào)Q0CJP9)、特異腐質(zhì)霉(W02010/014706)、橘灰青霉(W02009/068565)、埃默森踝節(jié)菌(UniProt登錄號(hào)Q8X211)和里氏木霉a _葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號(hào)Q99024)的a-葡糖醛酸糖苷酶。
[0189]用于本發(fā)明工藝的·具有酶活性的多肽可通過在含有合適碳源和氮源和無機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，使用本領(lǐng)域已知方法(參見，例如Bennett, J.W.和LaSure, L?(編)，MoreGene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA, 1991)發(fā)酵上述指出的微生物菌株來產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得，或可根據(jù)已公開組合物制備(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長(zhǎng)和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如 Bailey, J.E.和 Ollis, D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hi11Book Company, NY,1986)。
[0190]所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為酶或蛋白表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
[0191]因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。
[0192]遞
[0193]可通過一種或多種(例如幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖。“發(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳產(chǎn)品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。
[0194]在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨(dú)或同時(shí)的。
[0195]在實(shí)施本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇所述材料，如本領(lǐng)域中所公知的。
[0196]術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基。
[0197]“發(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是己糖和/或戊糖發(fā)酵生物體，或它們的組合。己糖和戊糖發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品?？僧a(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實(shí)例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642 所述。
[0198]能發(fā)酵己糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括假絲酵母屬、克魯維酵母屬和酵母屬，例如Candida sonorensis、馬克斯克魯維酵母和釀酒酵母的菌株。
[0199]以其天然狀態(tài)能發(fā)酵戊糖的發(fā)酵生物體的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如一些酵母。優(yōu)選的木糖發(fā)酵酵母包括假絲酵母屬，優(yōu)選休哈塔假絲酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis ;和畢赤酵母屬,優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773的菌株。優(yōu)選的戍糖發(fā)酵酵母包括管囊酵母屬(Pachysolen),優(yōu)選嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能夠發(fā)酵戍糖如木糖和阿拉伯糖的生物通過本領(lǐng)域已知方法可經(jīng)遺傳修飾而發(fā)酵戊糖。
[0200]能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌的實(shí)例包括，例如，凝結(jié)芽孢桿菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽抱桿菌屬菌種、解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter saccharoIyticum)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Philippidis, 1996,見上文)。
[0201]其它發(fā)酵生物包括芽孢桿菌屬，如凝結(jié)芽孢桿菌；假絲酵母屬，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假絲酵母(Candida diddensii)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blanki1、C.entomophilia、蕓薹假絲酵母(C.brassicae)、假熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、產(chǎn)I元假絲酵母(Candida utilis)和休哈塔假絲酵母(C.scehatae)；梭菌屬，如丙酮丁醇梭菌、熱纖維 梭菌和C.phytofermentans ;大腸桿菌，特別是經(jīng)遺傳修飾促進(jìn)乙醇產(chǎn)率(yield)的大腸桿菌菌株；地芽孢桿菌屬菌種；漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenula anomala);克雷伯氏菌屬(Klebsiella),如產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca);克魯維酵母屬，如馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母(K.1atic)、K.thermotoIerans和脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe);熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter),如解糖熱厭氧桿菌,和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas),如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株。
[0202]在一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,酵母是假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是Candida blankii。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是Candida entomophiIiia0在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是休哈塔假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora Iusitaniae)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus) □在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
[0203]在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是芽孢桿菌屬。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是凝結(jié)芽孢桿菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是梭菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是丙酮丁醇梭菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是Clostridium phytofermentans在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是熱纖維梭菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是地芽孢桿菌屬菌種。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是熱厭氧桿菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是解糖熱厭氧桿菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是 發(fā)酵單胞菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
[0204]商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如B10FERM?AFT和XR(NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation, GA, USA), ETHANOL RED? 酵母(Red Star/Lesaffre,USA)、FALI?(Fleischmann’ s Yeast, Burns Philp Food Inc.，USA)，F(xiàn)ERMIOL?(DSMSpecialties)，GERT STRAND?(Gert Strand ABiSweden)以及SUPERSTART?和THERMOSACC?新鮮酵母(Ethanol Technology，WI，USA)。
[0205]在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，以提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0206]通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression of Pichiastipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho 等，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter 和 Ciriacy，1993，Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae, Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson 等，1995， Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKLland TALlgenes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolaseand transaldolase, Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper 等，2004，Minimalmetabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobicxylose fermentation:a proof of principle， FEMS Yeast Research4:655-664;BealI等，1991， Parametric studies of ethanol production from xylose and othersugars by recombinant Escherichia coli， Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram 等，1998， Metabolic engineering of bacteria for ethanol production， Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang 等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolismpathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science267:240-243;Deanda 等，1996，Development of an arabinose—fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolicpathway engineering, Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;W02003/062430, XyloseIsomerase)。
[0207]在一個(gè)優(yōu)選的方面,經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是Candida sonorensis。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面,所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是馬克斯克魯維酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
[0208]本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。
[0209]通常向降解的纖維素材料或水解物加入發(fā)酵微生物，并進(jìn)行約8至約96小時(shí)，例如約24至約60小時(shí)發(fā)酵。溫度通常為約26°C至約60°C，例如約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，例如約pH4-5、6或7。
[0210]在一個(gè)方面，對(duì)降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進(jìn)行約12至約96小時(shí)，如通常為24-60小時(shí)發(fā)酵。在另一個(gè)方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，例如約25°C至約50°C，并且約32°C至約50°C，約32°C至約50°C，并且pH通常為約pH3至約PH7，例如約pH4至約pH7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-1O12,優(yōu)選約IO7-1Oltl,特別是約2xl08活細(xì)胞計(jì)數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可以在例如“The AlcoholTextbook，，(K.Jacques, T.P.Lyons 和 D.R.Kelsall 編，Nottingham University Press,United Kingdoml999)中找到,其通過提述并入本文。
[0211]對(duì)于乙醇產(chǎn)生，在發(fā)酵 之后，蒸餾發(fā)酵的漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的工藝獲得的乙醇可用作，例如燃料乙醇，飲用乙醇即可飲用的中性酒精飲料，或工業(yè)乙醇。
[0212]發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何工藝組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵方法，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長(zhǎng)的刺激劑。優(yōu)選的用于生長(zhǎng)的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、卩比唆醇(pyridoxine)、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D^PE。參見，例如，Alfenore 等,Improving ethanol production and viabilityof Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed—batchprocess, Springer-Verlag (2002),其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營(yíng)養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營(yíng)養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
[0213]發(fā)酵產(chǎn)物
[0214]發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、異丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1，3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；燒烴(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；環(huán)烷烴(例如環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷、和環(huán)辛烷)；烯烴(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO));異戊二烯；酮(例如，丙酮)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5- 二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價(jià)值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。
[0215]在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇。可理解的是，術(shù)語“醇”包括包含一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是正丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是異丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是丁二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是乙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,所述醇是甘油(glycerol)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong, C.S., Cao, N.J., Du, J.,和Tsao, G.T.,1999, Ethanol production from renewable resources,于 Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology, Scheper, T.編，Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany，65:207-241;Silveira， M.M.，和 Jonas, R.,2002, The biotechnologicalproduction of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam,P.,和Singh,D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute,Process Biochemistry30(2):117-124;Ezeji, T.C., Qureshi, N.和 Blaschek, H.P.,2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckiiBAlOland in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology andBiotechnologyl9(6):595-603。
[0216]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是烷烴。所述烷烴是未支化或支化的烷烴。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烷烴是戊烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烷烴是己烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烷烴是庚烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烷烴是辛烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烷烴是壬烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烷烴是癸烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烷烴是十一烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烷烴是十二烷。
[0217]在另一個(gè)優(yōu) 選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是環(huán)烷烴。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)戊烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)己烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)庚烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)辛烷。
[0218]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是烯烴。所述烯烴可為未支化或支化的烯烴。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烯烴是戊烯。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烯烴是己烯。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烯烴是庚烯。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述烯烴是辛烯。
[0219]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard, A., ^PMargaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentationkinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering87 (4):501-515。
[0220]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miyaj 和 K.Kiriyama，1997， Studies on hydrogen production by continuousculture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria， Water Science andTechnology36 (6-7):41-47 JBGunaseelan V.N.于 Biomass and Bioenergy, Vol.13(1-2)，pp.83—114，1997，Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review。
[0221]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是異戊二烯。
[0222]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物似乎酮。應(yīng)理解的是，術(shù)語“酮”涵蓋了含有一個(gè)或多個(gè)酮模塊的酮。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如Qureshi和Blaschek, 2003,見上文。
[0223]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是朽1檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是2，5- 二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見，例如，Chen, R.,和 Lee, Y.Y.,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lacticacid production from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435—448。
[0224]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是聚酮化合物。
[0225]SHF，SSF，SSCF，HHF ，SHCF，HHCF,DMCdPCBP:水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時(shí)，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC),有時(shí)也稱為合并的生物加工(consolidated bioprocessing,CBP)。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖和戊糖單體，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵在一個(gè)步驟中組合(Philippidis, G.P., 1996, Cellulose bioconversiontechnology,于 Handbook on Bioethanol:Production and Utilization, Wyman, C.E 編,Taylor&Francis, Washington, DC, 179-212)。SSCF 包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan, J.,和 Himmel, M.，1999，Enzymes, energy and the environment: A strategic perspectiveon the U.S.Department of Energy’ s research and development activities forbioethanol, Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF 在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨(dú)的水解步驟，所述步驟可以在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度，即，高溫酶法糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行SSF。DMC在一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))步驟中組合了所有三個(gè)過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd, L.R.，Weimer, P.J.，van Zyl, W.H.,和 Pretorius, 1.S.，2002，Microbialcellulose utilization!Fundamentals and biotechnology, Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本領(lǐng)域中已知的任何方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實(shí)施本發(fā)明的工藝。
[0226]常規(guī)設(shè)備包括補(bǔ)料批式攪拌反應(yīng)器、批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(Fernanda de Castilhos Corazza, FlavioFaria de Moraes, Gisella Maria Zanin 和 Ivo Neitzel, 2003, Optimal controlin fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum.Techno1gy25:33-38;Gusakov, A.V.,和 Sinitsyn,A.P.，1985，Kinetics of theenzymatic hydrolysis of cellulose: 1.A mathematical model for a batchreactor process, Enz.Microb.Technol.7:346-352)> 研磨反應(yīng)器(Ryu, S.Κ.，和Lee, J.M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attritionbioreactor, Biotechnol.Bioeng.25:53-65),或者具有由電`磁場(chǎng)引起的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Davydkin, 1.Y., Davydkin, V.Y., Protas, 0.V.,1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type ofbioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應(yīng)器類型包括:流化床、升流層(upf lowblanket)、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機(jī)型的反應(yīng)器。
[0227]
[0228]可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇。可以獲得純度高達(dá)約96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇，即，中性飲料酒,或工業(yè)乙醇。
[0229]本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開的具體方面的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0230]本文中引用了多個(gè)參考文獻(xiàn)，其通過全文提述并入本文。本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)一步描述，其不應(yīng)視作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例
[0231]實(shí)施例1:混合的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(混合的PCS)與用酸預(yù)處理的玉米秸桿(酸性PCS)和用堿預(yù)處理的玉米秸桿(堿性PCS)相比性能更佳。
[0232]未經(jīng)洗滌的酸性PCS:將玉米秸桿磨制至約1cm，并在50°C，10%總固體(TS)浸泡于1.0%(w/w)的硫酸溶液2小時(shí)。然后將原料脫水至約40%TS并使用蒸汽爆炸在170°C處理5.5分鐘。
[0233]未經(jīng)洗滌的堿性PCS:將玉米秸桿磨制至約1cm，并在90°C，15%TS，浸泡于1.5%(w/w)的氫氧化鈉溶液2小時(shí)。[0234]混合的PCS:將具有39.10%的TS的未經(jīng)洗滌的酸性預(yù)處理玉米秸桿(PCS) 44.95g與具有15.28%的TS的未經(jīng)洗滌的堿性PCSlOOg混合使得混合PCS的pH為pH5.0?；旌螾CS的最終TS為22.67%。
[0235]酸性PCS:將未經(jīng)洗滌的酸性PCS用50%氫氧化鈉調(diào)整至pH5.0。
[0236]堿性PCS:將未經(jīng)洗滌的堿性PCS用10摩爾硫酸調(diào)整至pH5.0。
[0237]將混合的PCS，酸性PCS和堿性PCS分別以12.6%的起始TS和20g的總重量進(jìn)行水解。使用里氏木霉纖維素酶組合物(可從Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark獲得的CELLIC?CTec2)以5.3%(w/w)的里氏木霉纖 維素酶組合物對(duì)纖維素的比例進(jìn)行酶水解。水解工藝在50°C和pH5.0進(jìn)行。除非另行指明，總水解時(shí)間為72小時(shí)。在水解終止后，通過高效液相色譜(HPLC)分析糖。
[0238]發(fā)酵以1.5g/l的酵母加載在32°C，pH6.5，150rpm在8ml水解物中進(jìn)行。在接種之后立即(Ohr)和3日時(shí)取樣以通過HPLC測(cè)量乙醇和剩余糖水平。
[0239]對(duì)于HPLC測(cè)量，將收集的樣品使用0.22iim注射器式濾器(MiIlipore, Bedford, MA, USA)過濾,并如下所述就糖含量分析濾過物。稀釋于0.005M H2SO4的樣品的糖濃度使用 7.8 X 300mm AMINEX? HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories, Inc.,Hercules, CA, USA)測(cè)量，即用0.005M H2S04在65°C以0.7ml每分鐘的流速洗脫，并通過來自由純糖樣品校正的折射率檢測(cè)(CHEMSTAT丨ON_?，AG丨LENT? 1100HPLC，AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA)的葡萄糖(或者木糖)信號(hào)的積分(integration)來進(jìn)行定量。使用所得的葡萄糖(或者木糖)計(jì)算對(duì)于每個(gè)反應(yīng)來自葡聚糖(或者木聚糖)的葡萄糖(或者木糖)產(chǎn)率的百分比。將測(cè)得的糖濃度針對(duì)合適的稀釋因子進(jìn)行調(diào)整。酶產(chǎn)生的糖的凈濃度通過針對(duì)在零時(shí)點(diǎn)未洗滌的生物質(zhì)中相應(yīng)的背景糖濃度調(diào)整測(cè)得的糖濃度來確定。所有 HPLC數(shù)據(jù)處理使用 MICROSOFT EXCEL?軟件(Microsoft, Richland, WA, USA)進(jìn)行。
[0240]纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的程度(或者木聚糖轉(zhuǎn)化為木糖的程度)根據(jù)下述文獻(xiàn)計(jì)算:Zhu, Y.等 Calculating sugar yields in high solids hydrolysis of biomass.Bioresource Technology (2010), 102(3):2897-2903。
[0241]對(duì)乙醇濃度類似糖含量地進(jìn)行分析，且乙醇產(chǎn)率根據(jù)下述方程計(jì)算:
[0242]%乙醇產(chǎn)率=乙醇濃度/ (糖(葡萄糖+木糖)濃度X0.5114)。
[0243]結(jié)果示于表I?？梢娀旌系腜CS的葡萄糖轉(zhuǎn)化與酸性PCS相當(dāng)，且遠(yuǎn)好于堿性PCS?；旌系腜CS的木糖轉(zhuǎn)化在所有經(jīng)測(cè)試的PCS中是最好的。混合的PCS的最終乙醇產(chǎn)率亦略好于酸性PCS。
[0244]表1:未經(jīng)洗滌的PCS的葡萄糖，木糖轉(zhuǎn)化和乙醇產(chǎn)率(%)
[0245]

I葡萄糖轉(zhuǎn)化(%) j木糖轉(zhuǎn)化(%) j乙醇產(chǎn)率(%)
堿性 PCS53.9840.6945.86
酸性 PCS88.0675.1664.92
【權(quán)利要求】
1.一種用于從含木素纖維素材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括: (a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料； (b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合； (C)用酶組合物水解混合的含木素纖維素材料；和 (d)添加發(fā)酵生物以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
2.一種用于將含木素纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化為包含單糖和寡糖的水解物的方法，其包括: (a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料； (b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合；和 (C)對(duì)混合的含木素纖維素材料進(jìn)行至少部分水解以獲得包含單糖和/或寡糖的水解物。
3.一種用于處理含木素纖維素材料的方法，其包括: (a)用酸性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維素材料，和用堿性試劑預(yù)處理含木素纖維素材料以獲得經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料；和 (b)將經(jīng)酸預(yù)處理的含木素纖維`素材料與經(jīng)堿預(yù)處理的含木素纖維素材料混合。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中用酸性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理包括用酸性試劑浸泡所述含木素纖維素材料。
5.權(quán)利要求4的方法，其中用酸性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理包括用酸性試劑浸泡所述含木素纖維素材料和對(duì)所述含木素纖維素材料進(jìn)行蒸汽爆炸。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述酸性試劑選自下組:氫氯酸、磷酸、硫酸、亞硫酸、碳酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、琥珀酸、氯化氫、磷酸酐、二氧化硫、二氧化碳和/或其組合。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中水溶液特別是硫酸中酸性試劑的濃度為0.05-10% (w/w)，優(yōu)選 0.1-5% (w/w)，更優(yōu)選 0.3-2.5%(w/w)。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中對(duì)于用酸性試劑的預(yù)處理，含木素纖維素材料的總固體為 1-80% (w/w),優(yōu)選 5-50% (w/w),且更優(yōu)選 8-30% (w/w)。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中用酸性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理進(jìn)行I分鐘至300分鐘，優(yōu)選30分鐘至250分鐘，和更優(yōu)選60分鐘至150分鐘的時(shí)間；和/或在130°C至270°C，優(yōu)選150°C至230°C，和更優(yōu)選160°C至200°C的溫度進(jìn)行。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中用堿性試劑對(duì)含木素纖維素材料的預(yù)處理包括用堿性試劑浸泡所述含木素纖維素材料。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述堿性試劑選自下組:氫氧化鈣(Ca(OH)2)，氧化鈣(CaO)，氨(NH3)，氫氧化鈉(NaOH)，碳酸鈉(NaCO3)，氫氧化鉀(KOH)，尿素,和/或其組合。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中水溶液特別是硫酸中堿性試劑的濃度是0.1-50% (w/w),優(yōu)選 0.5-40% (w/w),更優(yōu)選 5-25% (w/w)。
13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中對(duì)于用堿性試劑的預(yù)處理，含木素纖維素材料的總固體為 1-80% (w/w),優(yōu)選 5-50% (w/w),更優(yōu)選 8-30% (w/w)。
14.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中堿性試劑對(duì)含木素纖維素材料進(jìn)行的預(yù)處理進(jìn)行I分鐘至300分鐘，優(yōu)選30分鐘至250分鐘，更優(yōu)選60分鐘至150分鐘的時(shí)間；和/或在50°C至150°C，優(yōu)選約70°C至約120°C范圍的溫度進(jìn)行。
15.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述含木素纖維素材料選自下組:玉米秸桿、玉米穗軸、玉米纖維、柳枝稷、麥桿、稻桿、甘蔗渣和藻類，及其組合。
16.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中用酸性試劑預(yù)處理直立至地面上方超過三英尺的玉米秸桿；和/或用堿性試劑預(yù)處理直立至地面上方1-3英尺的玉米秸桿。
17.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中將所述混合的含木素纖維素材料調(diào)整至PH3-8，優(yōu)選PH4-6，特別是pH5左右。
18.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中水解使用一種或多種(幾種)選自下組的酶進(jìn)行:纖維素酶、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素，或其混合物；優(yōu)選地，所述纖維素酶為一種或多種(幾種)選自下組的酶:內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶；和優(yōu)選地，所述半纖維素酶為一種或多種(幾種)選自下組的酶:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
19.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中水解在25°C至70°C，優(yōu)選40°C至60°C，特別是50°C左右的溫度進(jìn)行。
20.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中水解在3-8范圍的pH，優(yōu)選pH4至6，特別是pH5左右進(jìn)行。
21.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中發(fā)酵在20°C至60°C，優(yōu)選約25°C至約50°C，最優(yōu)選約32°C至約50°C的溫度進(jìn)行。
22.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中發(fā)酵在3-7范圍的pH，優(yōu)選pH4至6，特別是pH4至pH5進(jìn)行。
23.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述發(fā)酵生物是酵母。
24.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇(優(yōu)選乙醇)，有機(jī)酸，酮，氨基酸，烷烴，環(huán)烷烴，烯烴，或氣體。
25.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中水解和發(fā)酵同時(shí)或順序進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求1、4-25任一項(xiàng)制備的發(fā)酵產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】C12P5/00GK103429749SQ201180067303
【公開日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月10日
【發(fā)明者】黃鴻志, 王云, 陳曄, 徐豐, 任海彧 申請(qǐng)人:諾維信公司, 中糧集團(tuán)有限公司, 中國(guó)石油化工股份有限公司