專利名稱：細胞培養(yǎng)用一次性器具、細胞培養(yǎng)裝置及細胞制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于將有用細胞的分離工序、分離的有用細胞的培養(yǎng)工序及培養(yǎng)的細胞的清洗·濃縮工序全部連貫地進行的細胞培養(yǎng)用一次性器具(disposable set)、細胞培養(yǎng)裝置及細胞制備方法。
背景技術：
近年來，從患者本人或者提供者的體液、組織采集細胞并通過培養(yǎng)將其擴增、加工而向患部進行移植的治療的所謂再生醫(yī)療·細胞醫(yī)療正受到重視。對于再生醫(yī)療·細胞醫(yī)療而言，在許多情況下，在從由體液、組織采集的細胞群之中分離出被用于治療的有用細胞后，通過培養(yǎng)實施細胞擴增。培養(yǎng)得到的細胞可向皮膚、骨、軟骨、角膜等進行移植，在它們的部分疾病中顯示出其安全性和有效性，作為有益于患者的治療方法，期望得到普及(例 如，參照非專利文獻I)。近年來逐漸清楚在骨髓液、臍帶血等中，存在具有能夠分化成骨、軟骨、肌肉、月旨肪等多種細胞的性質(zhì)的附著性成體干細胞(例如，參照非專利文獻2 4)。由于成體干細胞具有能夠分化成多種多樣的細胞、臟器的能力，因此使成體干細胞效率良好地分離、擴增的方法從再生醫(yī)療發(fā)展的角度來看是極為重要的。現(xiàn)在，就成體干細胞的分離而言，F(xiàn)icollPaque分離法(例如，參照非專利文獻5)等密度梯度離心法是主流，但該方法為了將分離液與細胞分開而使用離心分離器，需要反復清洗細胞這樣煩雜的操作，進而，伴隨著由離心操作所致的對細胞的損害、由開放體系中的操作所致的污染的危險。另外，分離的成體干細胞被報道在骨髓液的有核細胞中存在頻率非常小，對于成人而言在IO4 IO6個中存在I個(例如，參照非專利文獻5)，需要通過培養(yǎng)而使之增殖到治療所必需的數(shù)量?，F(xiàn)在，成體干細胞的擴增一般是使用器皿、燒瓶、或者培養(yǎng)袋、培養(yǎng)用盒(cartridge)等，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37°C的溫度環(huán)境下進行培養(yǎng)。這種情況下，由于培養(yǎng)基更換、傳代操作是人實施，因而每次進行這些操作都要有污染的風險、操作時間。因此，近年來開發(fā)出自動地實施細胞播種、培養(yǎng)基更換等培養(yǎng)操作、幾乎不耗費人工的自動培養(yǎng)裝置(例如，參照專利文獻I 3)。然而，現(xiàn)在的自動培養(yǎng)裝置裝載的僅是自動地培養(yǎng)所需細胞的功能，而沒有裝載將所需細胞從體液或者組織分離這樣的功能。另外，使目標細胞增殖到規(guī)定數(shù)量后，進行胰蛋白酶等酶處理、2價陽離子螯合劑等處理，將細胞從培養(yǎng)容器中剝離，剝離的細胞與這些酶液一起被回收，因此，需要另行進行除去胰蛋白酶等酶、2價陽離子螯合劑的操作。現(xiàn)在，作為最一般的細胞清洗方法，有離心分離法。本方法是以下方法通過離心分離操作，使細胞沉淀，除去上清后，加入新的清洗液，將細胞再懸濁，再次進行離心分離操作，通過重復本操作，從而進行細胞的清洗。但是，被指出該操作煩雜、封閉體系中的分離操作不容易等細胞清洗工序中的污染風險。另外，有使用無紡布等分離材料捕捉培養(yǎng)的細胞并回收清洗后的細胞的方法(例如，參照專利文獻4)，但是與離心分離法同樣，這樣的技術是單獨使用的，并非能夠在I個裝置中實施特定細胞的分離、培養(yǎng)、回收。專利文獻專利文獻I :日本特開2004-344128號公報專利文獻2 :日本特開2004-089095號公報專利文獻3 :日本特開2001-275659號公報專利文獻4 :日本特開2008-086235號公報非專利文獻
非專利文獻I :Robert Paul Lanza等著，大野典也等監(jiān)譯再生醫(yī)學 從TissueEngineering的基礎到最前端技術 株式會社NTS, 2002年非專利文獻2 :Pliard A. et al.，"Controlled Conversion of anTmmorti I i zedMesodermal Progenitor Cell Towards Osteogenic,Chondrogenicj or AdipogenicPathways. "，J. Cell Biol. 130 (6) ,pp. 1461-72，1995非專利文獻3 :Mackay Α· Μ· et al. , ^Chondrogenic differentiationofcultured human mesenchymal Stem Cells from Marrow"，TissueEngineering4(4)，pp. 414-428，1998非專利文獻4Angele P. et al.，"Engineering of OsteochondoralTissue withBone Marrow Mesenchymal Progenitor Cells in aDerivatived Hyaluronan GerationComposite Sponge〃，TissueEngineering 5 (6)，pp.545-553，1999非專利文獻5 :Pittenger et al. ,iiMultiLineage Potential of AdultHumanMesenchymal Stem Cells"，Science Vol. 284no. 5411，pp. 143-147，1999

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，制備對細胞醫(yī)療或者再生醫(yī)療有用的細胞時，需要經(jīng)過(I)播種的有用細胞的分離工序、(2)分離的有用細胞的培養(yǎng)工序、(3)培養(yǎng)的細胞的清洗、濃縮工序，但是現(xiàn)狀是有僅進行(2)的培養(yǎng)工序的自動培養(yǎng)裝置，其它(I)和(3)的工序通過另外的工序處理，被指出操作的煩雜、污染的風險等。另外，在像專利文獻4這樣的使用無紡布等分離材料捕捉并回收清洗后的細胞的方法中，使細胞回收液從與使細胞懸濁液流動的方向相反的方向流動而回收細胞，此時，作為注入細胞回收液的手段，可考慮泵的利用、壓破儲存有液體的袋的方法、利用落差的流過、使用注射器等來通過手動注入的方法等。但是，為了回收被捕捉的細胞，從濃縮細胞的角度講，也有必要以少量細胞回收液一下子地回收，使用注射器、袋的方法依賴于手工操作，回收率的偏差也大。另外，利用落差的方法因流速不足而使細胞的回收率急劇減少。進而，利用泵的方法存在以下問題用注射器泵時，流速不足，細胞幾乎無法回收，用滾子泵(roller pump)時,在結構上豎起時(可動時)的流速緩慢，在達到細胞回收所需要的壓力之前規(guī)定量的細胞回收液會流走而使細胞的回收率降低。而且，如果作為注入細胞回收液下面的步驟而將回收的細胞以原樣的壓力輸送到培養(yǎng)容器中，則會以非常高的壓力撞擊培養(yǎng)面，導致對細胞的損害(分化能力降低、存活性降低等)大，關于這方面應該解決的課題也很多。
因此，本發(fā)明鑒于上述狀況而要解決的課題在于如下方面提供細胞培養(yǎng)用一次性器具、細胞培養(yǎng)裝置及細胞制備方法，其能夠將有用細胞的分離工序、分離的有用細胞的培養(yǎng)工序及培養(yǎng)的細胞的清洗、濃縮工序全部連貫地進行，能夠實現(xiàn)不依賴大型設備的簡單構成的封閉體系系統(tǒng)而提高操作性，并且能夠制備安全性和品質(zhì)高的有用細胞。為了解決上述課題，本發(fā)明所涉及的細胞培養(yǎng)用一次性器具的特征在于包含細胞培養(yǎng)容器，具有液體流入口和液體排出口 ；細胞分離套件，與上述液體流入口連接、用于分離在細胞培養(yǎng)中使用的細胞；以及細胞回收套件，與上述液體排出口連接，用于清洗濃縮在上述細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)的細胞。在此，上述細胞分離套件優(yōu)選包含從含有細胞的被處理液選擇性地捕捉細胞的細胞分離材料，上述細胞回收套件優(yōu)選包含捕捉培養(yǎng)的細胞并使夾雜物通過的細胞回收材料。另外，上述細胞分離套件優(yōu)選由細胞分離過濾器、被處理液槽、廢液槽、第I細胞 回收液導入部、以及第3管路構成；上述細胞分離過濾器容納有從含有細胞的被處理液選擇性地捕捉細胞的細胞分離材料；上述被處理液槽通過第I管路與上述細胞分離過濾器的上游側連接，容納有含有細胞的被處理液；上述廢液槽通過第2管路與上述細胞分離過濾器的下游側連接；上述第I細胞回收液導入部利用從上述第2管路的中途分支的管路進行連接，用于導入細胞回收液；上述第3管路從上述第I管路的中途分支，與上述細胞培養(yǎng)容器的液體流入口連接。進而，優(yōu)選是將細胞儲存袋與從上述第I管路的與上述第3管路相比上游側的位置分支的管路連接而成的，所述細胞儲存袋用于將由從上述第I細胞回收液導入部導入到上述細胞分離過濾器的上述細胞回收液回收的細胞暫時儲存。進而，優(yōu)選上述被處理液槽兼作細胞儲存袋，所述細胞儲存袋將由從上述第I細胞回收液導入部導入到上述細胞分離過濾器的上述細胞回收液回收的細胞暫時儲存。另外，上述細胞分離過濾器優(yōu)選使含有對細胞醫(yī)療或者再生醫(yī)療有用的細胞和夾雜細胞的被處理液流過而實質(zhì)上使夾雜細胞通過，從而實質(zhì)上捕捉對細胞醫(yī)療或者再生醫(yī)療有用的細胞，并且使上述細胞回收液向與上述被處理液流過的方向相反的方向流過，從而回收捕捉到的細胞。進而，優(yōu)選上述第I細胞回收液導入部是容納有上述細胞回收液的注射器，上述注射器的柱塞被以氣體壓力驅動的外部按壓單元按壓，對上述細胞分離過濾器進行上述細胞回收液的供給。進而，優(yōu)選是通過管路將容納有清洗液的清洗液槽與上述細胞分離過濾器的上游側連接而成的。另外，優(yōu)選是由從上述第3管路的中途分支的管路連接容納有培養(yǎng)基的培養(yǎng)基槽和容納有包含細胞剝離劑的細胞剝離液的細胞剝離液槽中的至少任一個而成的。進而，上述細胞回收套件優(yōu)選由細胞回收過濾器、第4管路、廢液槽、第2細胞回收液導入部、以及細胞回收槽構成，上述細胞回收過濾器容納有捕捉培養(yǎng)的細胞并使夾雜物通過的細胞回收材料；上述第4管路與上述細胞培養(yǎng)容器的液體排出口和上述細胞回收過濾器的上游側連接；上述廢液槽通過第5管路與上述細胞回收過濾器的下游側連接；上述第2細胞回收液導入部利用從上述第5管路的中途分支的管路連接，用于導入細胞回收液；上述細胞回收槽利用從上述第4管路的中途分支的管路進行連接，用于將由上述第2細胞回收液導入部導入到上述細胞回收過濾器的細胞回收液回收的細胞進行回收。進而，優(yōu)選是使用于除去細胞凝集塊的細胞濾過過濾器設在上述第4管路的中途而成的，優(yōu)選是通過管路將容納有清洗液的清洗液槽與上述細胞回收過濾器的上游側連接而成的。另外，上述細胞回收過濾器優(yōu)選使含有在上述細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)而得的細胞的細胞懸濁液流過而捕捉被培養(yǎng)的細胞，使上述細胞回收液向與使上述細胞懸濁液流過的方向相反的方向流過，從而回收被捕捉的細胞。進而，優(yōu)選上述第2細胞回收液導入部是容納有上述細胞回收液的注射器，上述注射器的柱塞被以氣體壓力驅動的外部按壓單元按壓，對上述細胞回收過濾器進行上述細胞回收液的供給。為了解決上述課題，本發(fā)明所涉及的細胞培養(yǎng)裝置的特征在于，使用上述細胞培 養(yǎng)用一次性器具并具備配設于該細胞培養(yǎng)用一次性器具的管路的適當部位的泵和控制裝置，所述泵將壓夾上述管路而開關其流路的流路開關閥和上述管路進行依次按壓，所述控制裝置進行上述流路開關閥的開關控制和上述泵的驅動控制。另外，為了解決上述課題，本發(fā)明所涉及的細胞培養(yǎng)裝置的特征在于，使用上述第I細胞回收液導入部或者上述第2細胞回收液導入部是容納有上述細胞回收液的注射器的上述細胞培養(yǎng)用一次性器具并具備配設于該細胞培養(yǎng)用一次性器具的管路的適當部位的泵、外部按壓單元和控制裝置，所述泵將壓夾上述管路而開關其流路的流路開關閥和上述管路進行依次按壓，所述外部按壓單元以按壓上述注射器柱塞的壓力氣體作為驅動源，所述控制裝置進行上述流路開關閥的開關控制和上述泵的驅動控制以及上述外部按壓單元的驅動控制。在此，上述壓力氣體的供給源優(yōu)選是容納有壓力氣體的儲氣瓶，進一步優(yōu)選上述壓力氣體是二氧化碳。為了解決上述課題，本發(fā)明所涉及的細胞制備方法的特征在于，使用上述細胞培養(yǎng)裝置，在封閉體系中連貫地進行如下工序播種的有用細胞的分離工序，在上述分離工序中被分離的有用細胞的培養(yǎng)工序，以及在上述培養(yǎng)工序中被培養(yǎng)的細胞的清洗、濃縮工序。如上所述，根據(jù)本發(fā)明所涉及的細胞培養(yǎng)用一次性器具、細胞培養(yǎng)裝置及細胞制備方法，起到以下顯著的效果將有用細胞的分離工序、在分離工序中被分離的有用細胞的培養(yǎng)工序及在培養(yǎng)工序中培養(yǎng)的細胞的清洗、濃縮工序全部連貫地進行，實現(xiàn)不依賴大型設備的簡單構成的封閉體系系統(tǒng)而提高操作性，并且能夠制備安全性和品質(zhì)高的有用細胞。而且，使細胞回收液流過細胞分離過濾器而將回收的細胞暫時儲存于被處理液槽或者細胞儲存袋后移送到細胞培養(yǎng)容器，從而回收的細胞不會以原樣的壓力被輸送到細胞培養(yǎng)容器，因此能夠減少由細胞回收時的高壓力所致的對細胞的損害。進而，第I細胞回收液導入部或者第2細胞回收液導入部是容納有細胞回收液的注射器，利用以壓力氣體作為驅動源的外部按壓單元來按壓注射器的柱塞，從而與一般的滾子泵相比，可以短時間地達到細胞回收所需要的壓力，因而能夠一下子地回收比較少量的細胞回收液，因此細胞的回收率增高，并且回收率的偏差變小。


圖I是表示本發(fā)明的實施方式I所涉及的細胞培養(yǎng)用一次性器具及細胞培養(yǎng)裝置的概略構成圖。圖2是表示利用以壓力氣體作為驅動源的外部按壓單元進行細胞回收液導入部的驅動的例子的縱向截面圖，Ca)表示驅動前的狀態(tài)，Ca)表示驅動結束的狀態(tài)。圖3是表示本發(fā)明的實施方式2所涉及的細胞培養(yǎng)用一次性器具及細胞培養(yǎng)裝置的概略構成圖。圖4是示出回收細胞的軟骨形成評價結果(阿爾新藍染色)的圖，Ca)表示實施例1，(b)表示參考例I。
具體實施方式
·對于本發(fā)明，以下具體地進行說明。對于本發(fā)明中所述的含有細胞的被處理液而言，只要是含有細胞的液體，就不對其物理、化學性狀進行限定。具體地可以舉出骨髓液、外周血(包括外周血、G-CSF動員外周血等)、血漿析離法產(chǎn)物(濃縮白血球溶液等)、淋巴液、臍帶血、經(jīng)血、精液等體液；從臟器或者組織等中利用膠原酶等分解酶處理以生物化學方式分離細胞或者通過超聲波處理、均質(zhì)器、鋒利的刀具等以物理方式分離細胞而得到的處理液；對體細胞進行基因重組等而賦予多分化能力的細胞、例如iPS細胞等；由受精卵建立的ES細胞等；懸浮系細胞、細胞彼此凝集而得的球體狀細胞等，但不限定于此。另外，上述體液、處理液可以在由細胞分離過濾器處理前用生理食鹽水、磷酸緩沖液等適當?shù)囊后w進行稀釋，或者也可以通過離心分離等適當?shù)姆椒ㄟM行濃縮。作為濃縮方法的具體例，可以舉出使用Ficoll、Percoll> Lymphoprep、輕乙基淀粉(HES)、真空采血管等的密度梯度離心法等，但不限定于此。所謂本發(fā)明中的成體干細胞是指若在生物體外在任意條件下培養(yǎng)，則形成集落(細胞集團)并增殖而具有與各種分化誘導刺激相應的多分化能力的細胞。作為例子，可以舉出造血干細胞、血管內(nèi)皮前體細胞、間葉系干細胞等，但不限定于此。所謂本發(fā)明中的封閉體系是指本發(fā)明的細胞培養(yǎng)容器內(nèi)的環(huán)境被與該容器外的環(huán)境隔斷而不被外部環(huán)境的雜菌等污染的狀態(tài)。應予說明，在細胞培養(yǎng)容器內(nèi)外交換空氣、CO2等氣體時，優(yōu)選設置具有阻止雜菌進入的孔徑的過濾器，作為該過濾器的孔徑，優(yōu)選例如O. 45 μ m、0. 22 μ m。為了維持封閉體系，可以預先將袋、線路、各種過濾器等各部件以形成封閉體系的方式進行連接，也可以是各部件分開并能夠在即將使用之前以保持封閉體系的方式連接各部件的結構。另外，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)容器優(yōu)選滅菌后使用。作為滅菌方法，可以舉出高壓蒸氣滅菌、環(huán)氧乙烷氣體滅菌、Y射線滅菌、電子束滅菌等，但本發(fā)明不限定于此。以下說明中的“管路”是例如聚氯乙烯、聚氨酯、硅酮等的管，在這些分支或者合流部可使用適當?shù)倪B接器(接頭)。另外，以下說明中的“流路開關閥”壓夾上述管來開關其流路，例如使用夾管閥或者滾子閥等。
進而，以下說明中的“泵”利用滾子等依次按壓上述管來輸送，例如可使用滾子泵
坐寸O進而，流路開關閥的開關控制和泵的驅動控制可利用沒有圖示的可編程控制器等控制裝置進行。另外，在以下說明中，將被處理液相對于細胞分離過濾器SF的入口側和細胞懸濁液相對于細胞回收過濾器CF的入口側分別稱為“上游側”，將不被細胞分離過濾器SF、細胞回收過濾器CF捕捉的廢液的出口側分別稱為“下游側”。實施方式I.以下，對于本發(fā)明的實施方式I所涉及的細胞培養(yǎng)用一次性器具和細胞培養(yǎng)裝 置，用圖I的概略構成圖進行說明。細胞培養(yǎng)用一次性器具由以下構成具有液體流入口 Lin和液體排出口 Lout的細胞培養(yǎng)容器Ce、與液體流入口 Lin連接并用于使在細胞培養(yǎng)中使用的細胞分離的細胞分離套件A、以及與液體排出口 Lout連接并用于將在細胞培養(yǎng)容器CC中被培養(yǎng)的細胞清洗濃縮的細胞回收套件B，其在封閉體系中連接，以使得(I)播種的有用細胞的分離工序、(2)分離的有用細胞的培養(yǎng)工序、(3)培養(yǎng)的細胞的清洗、濃縮工序中的全部工序能夠無菌地處理，并且使用后為了提高安全性而廢棄。[細胞分離套件]細胞分離套件A用于分離在細胞培養(yǎng)中使用的細胞，本實施方式中，由細胞分離過濾器SF、被處理液槽Tl及細胞儲存袋T2以及廢液槽Wl和第I細胞回收液導入部Cl等構成。S卩，在細胞分離過濾器SF的上游側通過管路LI與被處理液槽Tl連接，通過從管路LI的中途分支的管路Lll與細胞儲存袋T2連接。另外，在細胞分離過濾器SF的下游側通過管路L2與廢液槽Wl連接，通過從管路L2的中途分支的管路L21與第I細胞回收液導入部Cl連接。進而，在管路Lll的下游側從管路LI的中途分支的管路L3與細胞培養(yǎng)容器CC的液體流入口 Lin連接。在此，被處理液槽Tl容納有包含利用任意方法制備得到的細胞的被處理液，為了在封閉體系的環(huán)境下移送上述被處理液，優(yōu)選在被處理液槽Tl設有能夠與被處理液的制備機構以無菌方式連接的注入口?！布毎蛛x過濾器〕細胞分離過濾器SF具有從含有細胞的被處理液選擇性地捕捉細胞的功能，被收納于細胞分離過濾器SF中的細胞分離材料的特征在于，可以實質(zhì)上使含有細胞的被處理液中的白血球和紅血球通過。在此所述的“實質(zhì)上使含有細胞的被處理液中的白血球和紅血球通過”是指在使含有細胞的被處理液流過細胞分離材料時，被處理液中的白血球的30%以上以及紅血球的80%以上在不被細胞分離材料捕捉的情況下通過。從作為目標細胞的成體干細胞的分離能力方面考慮，更優(yōu)選的細胞分離材料是使被處理液中的白血球的45%以上以及紅血球的85%以上通過的材料，進一步優(yōu)選使被處理液中的白血球的60%以上以及紅血球的90%以上通過，最優(yōu)選使被處理液中的白血球的70%以上以及紅血球的95%以上通過。只要達到如上所述的白血球和紅血球的通過率、進而能夠選擇性地捕捉成體干細胞，就對細胞分離材料的物理、化學、生物化學性狀等沒有特別限定，關于其形態(tài)、孔徑、密度、材質(zhì)，具體地可以舉出以下內(nèi)容。就細胞分離材料的形態(tài)而言，沒有特別限定，但從使之易于接觸含有細胞的被處理液、接觸的面積大的方面考慮，優(yōu)選為連通孔結構的多孔體、纖維聚集體、織物等。更優(yōu)選為由纖維構成的材料，進一步優(yōu)選為作為纖維聚集體的無紡布。細胞分離材料由纖維或者纖維聚集體構成時，從成體干細胞的捕捉·回收率的觀點考慮，其纖維徑優(yōu)選3 40 μ m的范圍。如果構成細胞分離材料的纖維的纖維徑比3 μ m細，則白血球等夾雜的有核細胞、紅血球及血小板等的通過率降低,它們的除去效率降低。如果纖維徑比40μπι粗，則變得易于引起有效接觸面積降低、短路徑(short path)，導致成體干細胞的捕捉·回收率降低。為了提高成體干細胞與細胞分離材料的相互作用、提高收 率，纖維徑更優(yōu)選5 35 μ m的范圍，進一步優(yōu)選5 30 μ m的范圍。就細胞分離材料的孔徑而言，從成體干細胞的捕捉 回收率的觀點考慮，優(yōu)選短徑為3 μ m以上、長徑為120 μ m以下。如果細胞分離材料的孔徑的短徑小于3 μ m,則白血球等夾雜的有核細胞、紅血球和血小板的除去效率顯著降低。如果細胞分離材料的孔徑的長徑大于120 μ m，則成體干細胞的捕捉變得困難。從白血球等夾雜的有核細胞、紅血球和血小板的除去效率等觀點考慮，優(yōu)選孔徑的短徑為5 μ m以上，長徑為80 μ m以下，從白血球等夾雜的有核細胞、紅血球和血小板的除去效率以及成體干細胞的捕捉·回收率等觀點考慮，進一步優(yōu)選孔徑的短徑為5μπι以上，長徑為70 μ m以下。在此所述的孔徑是利用掃描型電子顯微鏡對細胞分離材料拍攝照片并將通過不同的2根以上的纖維交叉而形成的實質(zhì)上的孔的長徑和短徑用圖像解析裝置測定50點以上而得到的值的平均值。就細胞分離材料的密度而言，從白血球等夾雜的有核細胞、紅血球和血小板的除去效率以及成體干細胞的捕捉·回收率的觀點考慮，優(yōu)選為I. OX IO4 1.0X106g/m3的范圍。從白血球等夾雜的有核細胞、紅血球和血小板的除去效率的觀點考慮，更優(yōu)選為
2.5 X IO4 7. 5 X 105g/m3，進一步優(yōu)選為5. O X IO4 5. O X 105g/m3的范圍。在此所述的密度是細胞分離材料的重量(g)除以其體積(m3)而得到的值。細胞分離材料的材質(zhì)優(yōu)選為選自聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯等聚烯烴，聚酯，聚對苯二甲酸丁二醇酯，聚氯乙烯，聚乙烯醇，聚偏二氯乙烯、人造絲、維尼綸、聚苯乙烯、丙烯酸類聚合物(聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羥基乙酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯等)、尼龍、聚氨酯、聚酰亞胺、芳綸、聚酰胺、銅氨纖維(Cupra)、芳綸纖維(Kevlar)、石墨、聚丙烯酸酯、酹、聚酯纖維(Tetron)、紙楽；、麻、纖維素、洋麻、殼多糖、殼聚糖、玻璃、棉等中的至少I種材質(zhì)，更優(yōu)選為選自聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸聚合物、人造絲、聚烯烴、維尼綸、聚乙烯、尼龍、聚氨酯等中的至少I種合成或者半合成的高分子。在組合2種以上的高分子作為細胞分離材料時，對其組合沒有特別限定，可以舉出由聚酯和聚烯烴、或者人造絲和聚烯烴、或者聚酯、人造絲及維尼綸等構成的組合。作為組合2種以上高分子時的纖維的形態(tài)，I根纖維可以是由成分彼此不同的高分子形成的纖維、或者不同成分彼此剝離分割而得到的分割纖維。
另外，也可以是將由成分不同的高分子單獨形成的纖維分別復合化而得到的形態(tài)。在此所述的復合化，沒有特別限定，可以舉出將由2種以上纖維混雜的狀態(tài)構成的形態(tài)、或者由高分子單獨形成的形態(tài)分別貼合而成的復合化等，但本發(fā)明不限定于此。為了使細胞分離材料的性能更加提高，也可以進行材料的親水化處理。通過親水化處理，可以賦予以下效果抑制所需細胞以外的細胞的非特異性捕捉、提高使體液不失衡地在細胞分離材料中通過等的性能、提高所需細胞的回收效率等。作為親水化處理方法，可以舉出使水溶性多元醇，或者具有羥基、陽離子基團、陰離子基團的聚合物，或其共聚物(例如甲基丙烯酸羥基乙酯、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、或其共聚物等)吸附的方法，使聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等水溶性高分子物質(zhì)吸附的方法，將親水性高分子固定于疏水性膜的方法(例如，使親水性單體以化學方式結合于表面的方法等)，對細胞分離材料進行電子束照射的方法，通過在含水狀態(tài)下對細胞分離材料照射放射線而使親水性高分子交聯(lián)不溶的方法，通過在干燥狀態(tài)下對細胞分離材料進行熱處理而使親水性高分子不溶并固定的方法，用與親水性高分子形成水不溶性復合物的成分對細胞分離材料進行處理的方法，對疏水性膜的表面進行磺化的方法，由聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等親水性高分子物質(zhì)和疏水性聚合物原液(polymer dope)的混合物成膜的方法，通過堿性水溶液(NaOH、KOH等)處理而對膜表面賦予親水基團的方法,將疏水性多孔膜在醇中浸潰后用水溶性聚合物水溶·液處理、干燥、然后通過熱處理、放射線等進行不溶處理的方法，使具有表面活性作用的物質(zhì)吸附的方法等。作為具有表面活性作用的物質(zhì)，可以舉出非離子性表面活性劑、卵磷脂、聚氧乙烯氫化蓖麻油、乙二胺四乙酸鈉、失水山梨糖醇倍半油酸酯、D-山梨糖醇、脫氫膽酸、甘油、D-甘露醇、酒石酸、丙二醇、聚乙二醇(Microgol)、羊毛脂醇、甲基纖維素等。作為非離子性表面活性劑，大致分為多元醇脂肪酸酯系和聚氧乙烯系。作為多元醇脂肪酸酯系表面活性齊U，可以舉出硬脂酸甘油酯系、山梨糖醇脂肪酸酯、山梨糖醇?；サ?。另外，作為聚氧乙烯系表面活性劑，可以舉出聚氧乙烯醇醚、聚氧乙烯?；ァ⒕垩跻蚁┥嚼嫣谴减；ァ⒕垩跻蚁┥嚼嫣谴紗卧鹿鹚狨?、聚氧乙烯山梨糖醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯等。這些物質(zhì)可以各自單獨使用，或者組合使用。另外，為了使成體干細胞對細胞分離材料的附著性提高，也可以將細胞附著性蛋白質(zhì)、針對在成體干細胞上所表達的抗原的抗體固定在細胞分離材料上。作為細胞附著性蛋白質(zhì)，可以舉出纖維連接蛋白(Fibronectin)、層粘連蛋白(laminin)、玻璃粘連蛋白(vitronectin)、骨膠原等。作為抗體,在目標細胞是間葉系干細胞時，可以舉出針對⑶73、⑶90、⑶105等的抗體，在目標細胞是造血干細胞時，可以舉出針對⑶34、c-Kit、Sca-I等的抗體,在目標細胞是成肌細胞時,可以舉出針對Myf5等的抗體等，但不限定于此。另外，也可以例如進行以細胞粘合難以發(fā)生的方式對表面進行親水性處理、使細胞彼此凝集而促進球狀體形成等的表面修飾。進而，也可以使作為細胞支撐體的支架(scaffold)在細胞培養(yǎng)容器內(nèi)共存而促進細胞與支架的復合化、或者預先將細胞與支架的復合物等供給培養(yǎng)。細胞分離過濾器SF是收納上述說明的細胞分離材料而成的，但是對于其形態(tài)、大小、結構材料等沒有特別限定。細胞分離過濾器SF的形態(tài)可以采取球、容器、盒體、袋、管、柱等任意的形態(tài)，作為優(yōu)選的具體例，例如可以舉出容量為O. 5 1000ml、直徑為O. 3 IOcm的透明或者半透明的圓柱狀容器、或者一邊長度為I 20cm的正方形或者長方形、厚度為O. I 5cm的四角柱狀形態(tài)等，但本發(fā)明不限定于此。細胞分離過濾器SF可以使用任意的結構材料來制作。具體地可以舉出非反應性聚合物、生物親和性金屬、合金、玻璃等。作為非反應性聚合物，可以舉出丙烯腈-丁二烯-苯乙烯三元共聚物等丙烯腈聚合物；聚四氟乙烯、聚氯三氟乙烯、四氟乙烯與六氟丙烯的共聚物、聚氯乙烯等鹵化聚合物；聚酰胺、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯-丙烯酸類共聚物、聚碳酸酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基戊烯等。作為容器材料有用的金屬材料可以舉出不銹鋼、鈦、鉬、鉭、金、及它們的合金、以及鍍金合金鐵、鍍鉬合金鐵、鈷鉻合金、氮化鈦被覆不銹鋼等。作為容器材料，特別優(yōu)選具有耐滅菌性的原材料，具體地可以舉出聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰亞胺、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基戊烯等。
〔使用細胞分離過濾器的細胞分離方法〕接著，對于使用細胞分離過濾器SF的細胞分離方法進行說明。在使管路LI I上的流路開關閥￥11、管路1^3上的流路開關閥V3及管路L21上的流路開關閥V21關閉，使管路LI上的流路開關閥VI、V13及管路L2上的流路開關閥V2開啟的狀態(tài)下，驅動泵P1，由此通過管路LI使被容納于被處理液槽Tl中的含有細胞的被處理液流過細胞分離過濾器SF。利用泵Pl流過時的流速可以舉出O. I 100ml/min,但本發(fā)明并不限定于此。使含有細胞的被處理液流過細胞分離過濾器SF后，為了清洗夾雜的紅血球等，優(yōu)選進行細胞分離過濾器SF的清洗。這種情況下，細胞清洗液可以舉出生理食鹽液、林格液、在細胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基、磷酸緩沖液等一般的緩沖液，但從安全方面考慮，優(yōu)選生理食鹽液。清洗可以利用輸送含有細胞的被處理液的泵來流過。這種情況下的流速可以舉出O. I IOOml/min0清洗量根據(jù)細胞分離過濾器SF的容量不同而異，但優(yōu)選以該過濾器容積的約I 100倍的體積進行清洗?！脖患毎蛛x過濾器捕捉的細胞的回收方法〕在細胞分離過濾器SF中細胞主要存在于上游側的可能性高，因此，優(yōu)選使第I細胞回收液導入部Cl位于細胞分離過濾器SF的下游側。然后，使細胞回收液向與使含有細胞的被處理液流動的方向相反的方向從第I細胞回收液導入部Cr流過細胞分離過濾器SF，從而回收細胞。S卩，通過使流路開關閥VI、V2、V3關閉并使流路開關閥VII、V13、V21開啟而從第I細胞回收液導入部Cl導入細胞回收液，從而從細胞分離過濾器SF回收細胞，該回收到的細胞經(jīng)由管路LI和Lll而被儲存在細胞儲存袋T2內(nèi)?；蛘?，作為不具備圖I中的細胞儲存袋T2的構成，可以將細胞回收至被處理液槽Tl中。這樣，將回收的細胞回收到細胞儲存袋T2或者被處理液槽Tl中，而不會將回收到的細胞在原樣的壓力下輸送到細胞培養(yǎng)容器Ce，從而能夠減少由細胞回收時的高壓力導致的對細胞的損害。細胞回收液的量和流速根據(jù)過濾器容量不同而異，優(yōu)選以O. 5 20ml/sec注入過濾器容積的I 100倍量的細胞回收液，但不限定于此。作為對細胞分離過濾器SF導入細胞回收液的方法，也有利用滾子泵等輸送的方法，但更優(yōu)選使用如圖2所示的以壓力氣體作為驅動源的外部按壓單元D。即，利用容納有細胞回收液的注射器構成第I細胞回收液導入部Cl，將注射器的外筒固定于固定用具E，利用作為外部按壓單元D的例如氣筒Dl的活塞桿推壓注射器的柱塞，從而如圖2 Ca) 圖2(b)所示，注射器內(nèi)的細胞回收液被擠出到管路L21內(nèi)。氣筒Dl的驅動可以通過利用流路切換閥D2切換從管路LO供給加壓氣體(是空氣、氧、氮、二氧化碳等氣體，沒有特別限定，但從在CO2培養(yǎng)箱等中使用二氧化碳方面考慮，優(yōu)選二氧化碳)的端口 P1、P2來進行，這樣的驅動控制可利用沒有圖示的可編程控制器等控制裝置進行。S卩，通過將加壓氣體供給到端口 P1，從而如圖2 (b)所示，活塞桿突出，通過將加壓氣體供給到端口 P2，從而活塞桿回歸到圖2 Ca)的狀態(tài)。
應予說明，通過使用容納有加壓氣體的儲氣瓶作為加壓氣體的供給源，加壓氣體對管路LO的供給變得容易。尤其是，通過使加壓氣體的供給源為二氧化碳儲氣瓶，二氧化碳儲氣瓶從被用于CO2培養(yǎng)箱等方面出發(fā)易于利用，因此是更優(yōu)選的實施方式。另外，按壓注射器的柱塞時的壓力優(yōu)選O. 05MPa IMpa，從提高細胞的回收率且減少對細胞的損害的觀點考慮，更優(yōu)選O. IMPa O. 75MPa，從穩(wěn)定的高細胞回收率及細胞的高功能表達的觀點考慮，進一步優(yōu)選O. 2MPa O. 5MPa。與一般的滾子泵相比，通過使用以壓力氣體作為驅動源的外部按壓單元D，可以短時間地達到細胞回收所需要的壓力，因而能夠以比較少量的細胞回收液一下子地回收，因此，細胞的回收率提高，并且回收率的偏差減小。細胞回收液只要是等滲液，就沒有特別限定，但是由細胞分離過濾器SF回收到的細胞緊接著在細胞培養(yǎng)容器CC中培養(yǎng)，因此優(yōu)選具有使成體干細胞增殖的功能的液體、即成體干細胞的培養(yǎng)基作為細胞回收液。作為這種情況下的成體干細胞的培養(yǎng)基的具體例，可以舉出 D-MEM(Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基)、IMDMC Iscove 改良 Eagle 培養(yǎng)基)、RPMI1640培養(yǎng)基、MCDB133培養(yǎng)基、ASF培養(yǎng)基等培養(yǎng)基，但不限定于此。另外，為了提高回收的干細胞的增殖能力、分化能力，可以在上述培養(yǎng)基中加入血清、血漿等生物體成分、bFGF(堿性成纖維細胞增殖因子)、TGF-i3 (轉化增殖因子-β )、胰島素、轉鐵蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白(Fibronectin)等蛋白性因子、維甲酸、抗壞血酸、各種氨基酸、各種糖類、5-氮雜胞苷、2-巰基乙醇、亞硒酸鈉、氫化可的松、地塞米松等低分子物質(zhì)。進而，為了避免干細胞培養(yǎng)過程中的雜菌污染，可以在上述液體中加入卡那霉素、慶大霉素、青霉素、鏈霉素、多粘菌素B、萬古霉素、兩性霉素B等抗生素、抗真菌劑。另外，在這些培養(yǎng)基中也可以根據(jù)需要而添加5 20%左右的血清。〔細胞培養(yǎng)容器、及回收的細胞的培養(yǎng)方法〕就被儲存在細胞儲存袋T2或者被處理液槽Tl中的細胞懸濁液而言，通過使流路開關閥V13關閉、使流路開關閥Vll或Vl和V3開啟并驅動泵P2，從而經(jīng)由管路LlULl及L3或管路LI和L3移送至細胞培養(yǎng)容器CC。作為細胞培養(yǎng)容器CC，只要能夠培養(yǎng)在被回收的細胞中所含有的成體干細胞并將該細胞數(shù)擴增，就可以使用任何器具、裝置，但從操作簡便方面，雜菌污染、交叉污染等危險性低方面考慮，優(yōu)選使用細胞培養(yǎng)袋、細胞培養(yǎng)盒、或者細胞培養(yǎng)皿。另外，這些結構體的材質(zhì)可以舉出聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、氯乙烯、聚乙烯、聚烯烴、苯乙烯丁二烯熱塑性樹脂等彈性體、聚碳酸酯、聚丙烯等，但不限定于此。細胞培養(yǎng)容器CC的形狀在平面視圖中為圓形或者多角形等未特別限定的形狀，但為了能夠培養(yǎng)許多的細胞并且實現(xiàn)節(jié)省空間化，優(yōu)選底面積大的扁平形狀。另外，細胞培養(yǎng)袋、細胞培養(yǎng)盒或者細胞培養(yǎng)皿可以以堆疊在一起的多級形式使用，以使得能夠一次培養(yǎng)大量細胞，也可以采取容器內(nèi)部被分離成多級而能夠一次培養(yǎng)許多細胞的形式。進而，細胞在細胞培養(yǎng)容器CC中的播種數(shù)也根據(jù)細胞的種類不同而異，但優(yōu)選每單位培養(yǎng)面積為5X IO2 3X 104(個/cm2)，從細胞的增殖性和回收率的觀點考慮，更優(yōu)選為I X IO3 I X IO4(個 /cm2)?！布毎厥仗准細胞回收套件B用于清洗濃縮被培養(yǎng)的細胞，本實施方式中，由細胞回收過濾器·CF、細胞濾過過濾器RF、廢液槽W2及第2細胞回收液導入部C2以及細胞回收槽T3等構成。S卩，與細胞培養(yǎng)容器CC的液體排出口 Lout連接的管路L4介由細胞濾過過濾器RF與細胞回收過濾器CF的上游側連接。另外，在細胞回收過濾器CF的下游側利用管路L5連接廢液槽W2，利用從管路L5的中途分支的管路L51連接第2細胞回收液導入部C2。進而，在細胞回收過濾器CF的上游側利用從管理L4分支的管路L6連接細胞回收槽T3?！才囵B(yǎng)細胞從細胞培養(yǎng)容器中的剝離方法〕接著，對于培養(yǎng)細胞從細胞培養(yǎng)容器CC剝離的方法進行說明。將在細胞培養(yǎng)容器CC中培養(yǎng)規(guī)定期間的細胞利用胰蛋白酶等酶處理、螯合劑處理等剝離，介由管路L4導入到細胞回收過濾器CF。此時，被剝離的細胞一部分形成凝集塊，如果以原樣的狀態(tài)輸送至細胞回收過濾器，則有可能堵塞過濾器。因此，在從細胞培養(yǎng)容器CC到細胞回收過濾器CF之間，設置孔徑為30 μ m 500 μ m、更優(yōu)選為50 μ m 400 μ m的細胞濾過過濾器RF，在除去細胞的凝集塊后流過到細胞回收過濾器CF。就利用細胞剝離劑對細胞的處理的時間而言，作為目標，優(yōu)選I 15分鐘，可以搖動細胞培養(yǎng)容器Ce，以使得細胞剝離劑在容器整體范圍內(nèi)均勻地擴展。對于像間葉系干細胞這樣細胞外基質(zhì)的分泌量多的細胞而言，如果持續(xù)培養(yǎng)，直至細胞擴展到例如培養(yǎng)皿的一面而不再增加的鋪滿(confluent)狀態(tài)，則在利用細胞剝離劑進行處理時，難以作為單細胞回收，存在回收率降低的可能性。另外，如果在增殖初期回收，則細胞數(shù)量少的可能性高。因此，在回收細胞時，細胞占有的面積相對于培養(yǎng)面積的比例優(yōu)選為50%以上。另夕卜，出于上述理由，更優(yōu)選70% 90%的范圍，但本發(fā)明不限定于此。就用細胞剝離劑剝離的細胞而言，可以將全部細胞供給接下來的細胞回收工序，也可以將一部分細胞殘留在細胞培養(yǎng)容器內(nèi)，而繼續(xù)再次培養(yǎng)。還可以通過重復數(shù)次本操作而進行細胞數(shù)量的擴增?！布毎厥者^濾器〕
細胞回收過濾器CF具有利用被收納在其中的細胞回收材料來捕捉培養(yǎng)的細胞并使夾雜物通過的功能。在此所述的夾雜物可以舉出作為細胞培養(yǎng)基所含有的目標細胞的成體干細胞以外的細胞、細胞膜片段等固體物、來自細胞的分泌物、細胞培養(yǎng)基、在細胞剝離時使用的胰蛋白酶等酶、螯合劑等。細胞回收材料的材質(zhì)優(yōu)選選自以下材質(zhì)中的至少一種聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯等聚烯烴、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚對苯二甲酸丁二醇酯等聚酯，聚氯乙烯，聚乙烯醇，聚偏二氯乙烯，人造絲，維尼綸，聚苯乙烯，丙烯酸類(聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羥基乙酯、丙烯腈、丙烯酸、丙烯酸酯等)，尼龍，聚氨酯，聚酰亞胺，芳綸，聚酰胺，銅氨纖維(Cupra),芳纟侖纖維(Kevlar),石墨,聚丙烯酸酯,酹,聚酯纖維(Tetron),紙漿，麻，纖維素，洋麻，殼多糖，殼聚糖，玻璃，棉等，更優(yōu)選選自聚酯、聚苯乙烯、丙烯酸類、人造絲、聚烯烴、維尼綸、聚乙烯、尼龍、聚氨酯等中的至少I種合成高分子。在組合2種以上的合成高分子作為細胞回收材料時，對其組合沒有特別限定，可以舉出由聚酯和聚烯烴、或者人造絲和聚烯烴、或者聚酯、人造絲及維尼綸等構成的組合。作為組合2種以上合成高分子時纖維的形態(tài)，I根纖維可以是由成分彼此不同的合成高分 子形成的纖維、或者可以是不同成分彼此剝離分割的分割纖維。另外，可以是將由成分不同的合成高分子單獨形成的纖維復合化的形態(tài)。在此所述的復合化沒有特別限定，可以舉出將由2種以上的纖維混雜的狀態(tài)構成的形態(tài)、或者由合成高分子單獨形成的形態(tài)分別貼合而成的復合化等，但本發(fā)明不限定于此。另外，細胞回收材料的形狀可以是連通孔結構的多孔體形狀，也可以是纖維聚集體、織物等，但更優(yōu)選為無紡布。從成體干細胞的回收率方面考慮，細胞回收材料的纖維徑優(yōu)選3 40 μ m。如果比3 μ m細，則與白血球的相互作用增高，不需要的細胞的除去效率降低。另外，如果比40 μ m粗，則變得易引起有效接觸面積降低、短路徑，從而導致成體干細胞的回收率降低。為了提高成體干細胞與過濾器的相互作用、提高收率，更優(yōu)選5 35 μ m。進一步優(yōu)選為5 μ m 30 μ m0就細胞回收材料的孔徑而言，從成體干細胞的捕捉性方面考慮，優(yōu)選短徑為3 μ m以上且長徑為120 μ m以下。如果細胞回收材料孔徑的短徑小于3 μ m，則存在夾雜物的除去效率降低的可能性。如果細胞回收材料孔徑的長徑大于120 μ m，則成體干細胞的捕捉變得困難。從紅血球等比較大的夾雜物的除去效率考慮，細胞回收材料的孔徑更優(yōu)選為5 80 μ m,從成體干細胞的捕捉性考慮，進一步優(yōu)選為5 30 μ m。在此所述的孔徑是利用掃描型電子顯微鏡對細胞回收材料拍攝照片，利用圖像解析裝置將由不同的2根以上的纖維交叉而形成的實質(zhì)上的孔的長徑和短徑測定50點以上而得的值的平均值。細胞回收過濾器CF的形態(tài)可以采取球、容器、盒體、袋、管、柱等任意形態(tài)，作為優(yōu)選的具體例，例如可以舉出容量為O. I 1000ml、直徑為O. 3 15cm的透明或者半透明的圓柱狀容器，或者一邊長度O. I 20cm的正方形或者長方形、厚度為O. I 5cm的四角柱狀形態(tài)等。另外，細胞回收過濾器CF可以以切斷成合適的大小的平板狀來處理體液，還可以以卷成輥狀的形狀來進行體液的處理。以輥狀使用時,通過從該輥的內(nèi)側向外側處理體液，也可以進行所需細胞的捕捉，或者與此相反地，也可以使體液從輥的外側流入到內(nèi)側而進行成體干細胞的捕捉。以上，舉出了具體例，但本發(fā)明不限定于此?！彩褂眉毎厥者^濾器的培養(yǎng)細胞的清洗濃縮方法〕接著，對于使用細胞回收過濾器CF的培養(yǎng)細胞的清洗濃縮方法進行說明。對于含有用于剝離培養(yǎng)規(guī)定期間后的細胞的胰蛋白酶等酶、螯合劑等的細胞懸濁液，在使管路L6上的流路開關閥V6和管路L51上的流路開關閥V51關閉并使管路L4上的流路開關閥V4和管路L5上的流路開關閥V5開啟的狀態(tài)下，驅動泵P3，從而從細胞培養(yǎng)容器CC通過管路L4輸送到細胞回收過濾器CF。將含有胰蛋白酶等酶、螯合劑等的細胞懸濁液流過到細胞回收過濾器CF后，為了清洗殘留在過濾器內(nèi)的胰蛋白酶等酶、螯合劑等，優(yōu)選進行細胞回收過濾器的清洗。
這種情況下，細胞清洗液可以舉出生理食鹽液、林格液、在細胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基、磷酸緩沖液等一般的緩沖液。清洗可以利用輸送含有胰蛋白酶等酶、螯合劑等的細胞懸濁液的泵而使之流過。這種情況下的流速可以舉出O. I 100ml/min。清洗量根據(jù)細胞回收過濾器CF的容量不同而異，但優(yōu)選以該過濾器容積的約I 100倍的體積進行清洗。在細胞回收過濾器CF中，細胞主要存在于上游側的可能性高，因此，優(yōu)選使第2細胞回收液導入部C2位于細胞回收過濾器CF的下游側置。然后，使細胞回收液向與使上述細胞懸濁液流動的方向相反的方向從第2細胞回收液導入部C2流過到細胞回收過濾器CF，從而回收細胞。即，使流路開關閥V4、V5關閉，使流路開關閥V6、V51開啟，從第2細胞回收液導入部C2導入細胞回收液，從而從細胞回收過濾器CF回收的細胞可以經(jīng)由管路L4、L6而被儲存在細胞回收槽T3內(nèi)來獲得最終產(chǎn)物的細胞。作為細胞回收槽T3，可以使用任意器具，但從雜菌污染、交叉污染等危險性低方面、搬運簡便方面等考慮，優(yōu)選使用袋、試管、管等。另外，這些結構體的材質(zhì)可以舉出聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、氯乙烯、聚乙烯、聚烯烴、苯乙烯-丁二烯熱塑性樹脂等彈性體、聚碳酸酯、聚丙烯等，但不限定于此。 細胞回收液的量和流速根據(jù)過濾器容量不同而異，優(yōu)選以O. 5 20ml/sec注入過濾器容積的I 50倍量的細胞回收液，但不限定于此。細胞回收液只要是等滲液，就沒有特別限定，但為了將從細胞回收過濾器CF回收的細胞用于移植等，優(yōu)選生理食鹽液、林格液等在實踐中被用于醫(yī)療用途的溶液，血漿，血清，或者在生理食鹽液、林格液等中添加白蛋白、血漿、血清而得的溶液等。作為對細胞回收過濾器CF導入細胞回收液的方法，也有利用滾子泵等輸送的方法，但更優(yōu)選使用如圖2所示的以壓力氣體作為驅動源的外部按壓單元D。即，利用容納有細胞回收液的注射器構成第2細胞回收液導入部C2，將注射器的外筒固定于固定用具E，通過作為外部按壓單元D的例如氣筒Dl的活塞桿推壓注射器的柱塞，從而如圖2 Ca) 圖2(b)所示，注射器內(nèi)的細胞回收液被擠出到管路L51內(nèi)。氣筒Dl的驅動可以通過利用流路切換閥D2切換從管路LO供給加壓氣體(是空氣、氧、氮、二氧化碳等氣體，沒有特別限定，但從在CO2培養(yǎng)箱等中使用二氧化碳方面考慮，優(yōu)選二氧化碳)的端口 P1、P2來進行，這樣的驅動控制可利用沒有圖示的可編程控制器等控制裝置進行。即，通過將加壓氣體供給到端口 P1，從而如圖2 (b)所示，活塞桿突出，通過將加壓氣體供給到端口 P2，從而活塞桿回歸到圖2 Ca)的狀態(tài)。另外，按壓注 射器的柱塞時的壓力優(yōu)選O. 05MPa IMPa，從提高細胞的回收率且減少對細胞的損害的觀點考慮，更優(yōu)選O. IMPa O. 75Mpa，從穩(wěn)定的高細胞回收率和細胞的高功能表達的觀點考慮，進一步優(yōu)選O. 2MPa O. 5MPa。與一般的滾子泵相比，通過使用以壓力氣體作為驅動源的外部按壓單元D，可以短時間地達到細胞回收所需要的壓力，因而能夠以比較少量的細胞回收液一下子地回收，因此，細胞的回收率提高并且回收率的偏差減小。實施方式2.接著，用圖3的概略構成圖，對于本發(fā)明的實施方式2所涉及的細胞培養(yǎng)用一次性器具和細胞培養(yǎng)裝置進行說明。圖3中的與圖I相同符號表示相同或者相當?shù)牟糠?，因此以下對于與圖I相同符號的內(nèi)容，有時省略詳細說明。本實施方式示出如下更優(yōu)選的方法用細胞分離過濾器SF從含有成體干細胞的被處理液分離成體干細胞，將分離的細胞在細胞培養(yǎng)容器CC中培養(yǎng)后，利用細胞回收過濾器CF，由酶、螯合劑等清洗細胞，在濃縮的狀態(tài)下回收。[細胞分離套件]就實施方式2的細胞分離套件A而言，沒有實施方式I的細胞回收袋T2，在細胞回收中并用被處理液槽Tl，在實施方式I的細胞分離套件A的基礎上，利用從管路LI的中途分支的管路L12連接清洗液槽WA1，利用從管路L3的中途分支的管路L31連接培養(yǎng)基槽T4，利用從管路L31的中途分支的管路L32連接細胞剝離液槽T5。〔細胞回收套件]就實施方式2的細胞回收套件B而言，在實施方式I的細胞回收套件B的基礎上，廢液槽W3通過管路L7與細胞培養(yǎng)容器CC的液體排出口 Lout連接，利用從管路L6的中途分支的管路L8連接清洗液槽WA2。就被收納在被處理液層Tl中的含有成體干細胞的被處理液而言，與實施方式I同樣地驅動泵Pl，從而通過管路LI流過到細胞分離過濾器SF。被處理液在細胞分離過濾器SF中的流過速度沒有特別限定，但以被處理液相對于細胞分離材料的厚度的通過速度(線速度)表示時，優(yōu)選處于O. I 1000mm/min的范圍。如果線速度低于O. lmm/min,則處理時間長期化,如果高于1000mm/min,則因被處理液的流水壓而導致成體干細胞變得難以被分離材料捕捉。更優(yōu)選的線速度為O. 5 500mm/min，進一步更優(yōu)選為I 250mm/min。在使含有成體干細胞的被處理液流過到細胞分離過濾器SF之前，用生理食鹽液等等滲液進行細胞分離過濾器SF的清洗時，使流路開關閥V1、V3和V21關閉并使流路開關閥V2和管路L12上的流路開關閥V12開啟，驅動泵Pl，從而容納在清洗液槽WAl中的生理食鹽液等清洗液介由管路L12和管路LI而流過到細胞分離過濾器SF，廢液介由管路L2而被容納在廢液槽Wl中。此時的線速度沒有特別限定，但優(yōu)選處于O. I 1000mm/min的范圍。通過使含有成體干細胞的被處理液流過到細胞分離過濾器SF，被處理液中的成體干細胞被細胞分離材料捕捉，沒有捕捉到的紅血球、成體干細胞以外的有核細胞、血漿成分、酶、用于稀釋的緩沖液等不需要的成分通過管路L2被移送到廢液槽W1。
通過使含有成體干細胞的被處理液流過到細胞分離過濾器SF，成體干細胞被細胞分離材料捕捉，但同時存在一部分紅血球、有核細胞殘留在細胞分離材料中的可能性。為了除去這些不需要的細胞，可以介由管路L12和管路LI使清洗液從清洗液槽WAl流過到細胞分離過濾器SF。這種情況下的清洗液流入口優(yōu)選處于與流過到細胞分離過濾器SF的被處理液流入口相同的位置、或其上游側。在此使用的清洗液只要是對成體干細胞不造成負面影響的液體，就沒有特別限定，作為具體例，可以舉出生理食鹽液、林格液、血清、血漿、在細胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基、磷酸緩沖液等一般的緩沖液等。從對成體干細胞的負面影響小、在實踐中在醫(yī)療用途中使用的方面考慮，優(yōu)選使用生理食鹽液。在任何情況下，清洗液的流過條件均優(yōu)選以使被處理液流過到細胞分離過濾器SF的情況為基準的條件。通過將清洗液流過到細胞分離過濾器SF中，殘留在細胞分離過濾器SF內(nèi)的除了成體干細胞以外的不需要的細胞通過管路L2與清洗液一起從細胞分離過濾器SF內(nèi)被移送到廢液槽Wl中。就被細胞分離過濾器SF捕捉的成體干細胞而言，由第I細胞回收液導入部Cl介·由管路L21將細胞回收液流過到細胞分離過濾器SF，從而介由管路LI而暫時儲存在被處理液槽Tl中，介由其后的管路L1、L3被移送到細胞培養(yǎng)容器CC，直接培養(yǎng)。此時，如果使用干細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基等具有使干細胞增殖的功能的液體作為細胞回收液，則可以在移送后直接培養(yǎng)，因而優(yōu)選。另外，在細胞分離過濾器SF中成體干細胞主要存在于上游側的可能性高，因此管路L21優(yōu)選與位于細胞分離過濾器SF下游側的管路L2連接。進而，根據(jù)需要，使管路L3上的流路開關閥V3關閉，使管路L31上的流路開關閥V31開啟，并驅動泵P2，從而可以從充填有培養(yǎng)基的培養(yǎng)基槽T4經(jīng)由管路L31和L3對細胞培養(yǎng)容器CC進行培養(yǎng)基的追加。將由細胞分離過濾器SF回收的成體干細胞用細胞培養(yǎng)容器CC培養(yǎng)，擴增到所需細胞數(shù)，但此時，可以在保持作為成體干細胞的性質(zhì)的情況下擴增，也可以被分化誘導成適當?shù)奶囟毎⒔M織。在保持作為成體干細胞的性質(zhì)的情況下擴增的細胞組合物，被分化誘導成特定細胞、組織的細胞組合物均被包括在本發(fā)明的范疇內(nèi)。另外，在細胞培養(yǎng)容器CC中，被擴增到所需細胞數(shù)的成體干細胞可以在其后殘留一部分細胞，進而接著在細胞培養(yǎng)容器CC內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。在剝離于細胞培養(yǎng)容器CC內(nèi)增殖的細胞時，通過驅動泵P4，從而將培養(yǎng)基從管路L7排液到廢液槽W3。另外，在細胞培養(yǎng)容器CC內(nèi)殘留培養(yǎng)基時，由于培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分、二價陽離子等的影響而導致存在細胞剝離劑的效力變差的可能性，因此通過驅動泵P2，經(jīng)由管路L12和管路L3將清洗液槽WAl內(nèi)的清洗液注入到細胞培養(yǎng)容器CC內(nèi)，從而可以清洗殘留的
培養(yǎng)基。進行清洗時，驅動泵P4，將清洗液從管路L7排液到廢液槽W3。接著，驅動泵P2，經(jīng)由管路L32、L31和L3，將用于剝離細胞剝離液槽T5內(nèi)的細胞的胰蛋白酶等酶、螯合劑等細胞剝離劑注入到細胞培養(yǎng)容器CC內(nèi)。此時，可以進行細胞培養(yǎng)容器CC的搖動，以使得細胞剝離劑遍布細胞培養(yǎng)容器CC的整體。
就利用細胞剝離劑對細胞的處理時間而言，作為目標，優(yōu)選I 15分鐘，經(jīng)過規(guī)定時間后，為了使細胞剝離劑失活，從培養(yǎng)基槽T4經(jīng)由管路L31和L3追加培養(yǎng)基。在追加細胞培養(yǎng)基前，為了使細胞充分剝離，可以在加入了細胞剝離劑的狀態(tài)下進行細胞培養(yǎng)容器CC的搖動。就混合有細胞剝離劑與培養(yǎng)基的細胞懸濁液而言，介由細胞濾過過濾器RF從管路L4流過到細胞回收過濾器CF，從而增殖的細胞被細胞回收過濾器CF捕捉。未被捕捉的細胞以外的有核細胞、血清成分、酶、螯合劑、培養(yǎng)基等不需要的成分通過管路L5而被移送到廢液槽W2。由于存在用于細胞剝離的胰蛋白酶等酶、螯合劑等殘留在細胞回收過濾器CF內(nèi)的可能性，因此為了除去這些不需要的成分，可以通過管路L8、L6、L4使清洗液槽WA2內(nèi) 的生理食鹽液等清洗液流過到細胞回收過濾器CF。被處理液在細胞回收過濾器CF中的流過速度和清洗細胞回收過濾器CF時的流速沒有特別限定，但以被處理液相對于過濾器厚度的通過速度(線速度)表示時，優(yōu)選處于
O.I 1000mm/min的范圍，更優(yōu)選的線速度為O. 5 500mm/min,進一步優(yōu)選為I 250mm/
mirio在此使用的清洗液只要是不對細胞造成負面影響的液體，就沒有特別限定，作為具體例，可以舉出生理食鹽液、林格液等在實踐中作為注射用劑使用的清洗液等。另外，清洗量根據(jù)細胞回收過濾器CF的容量不同而異，但優(yōu)選以該過濾器容積的約I 100倍的體積進行清洗。被細胞回收過濾器CF捕捉的細胞可以通過使細胞回收液沿著與使細胞懸濁液流動的方向相反的方向流動來回收。具體而言，從第2細胞回收液導入部C2介由管路L51、L5而使細胞回收液流過到細胞回收過濾器CF，從而介由管路L4、L6回收到細胞回收槽T3。由于細胞在細胞回收過濾器CF中主要存在于上游側的可能性高，因此管路L51優(yōu)選與位于細胞回收過濾器CF下游側的管路L5連接。作為細胞回收液，只要是對細胞不造成負面影響的液體，就沒有特別限定，作為具體例，可以舉出生理食鹽液、林格液等在實踐中作為注射用劑使用的溶液，血漿，血清等。另外，也可以在生理食鹽液、林格液等中添加血漿、血清等而使用。(實施例I)使用由圖3中的構成的細胞培養(yǎng)容器CC、細胞分離套件A及細胞回收套件B構成的細胞培養(yǎng)用一次性器具，使用在圖3所示的位置具備流路開關閥和泵并且具備進行流路開關閥的開關控制和泵的驅動控制以及圖2所示的外部按壓單元D的驅動控制的控制裝置的細胞培養(yǎng)裝置。另外，作為細胞分離過濾器SF，使用容納有細胞分離材料的過濾器，所述細胞分離材料是在具備出入口的外徑為26mm、內(nèi)徑為22mm的圓筒狀柱中層疊36片由聚酯和丙烯構成的無紡布(密度(單位面積重量(g/m2)/厚度(m))= 1.8X 105 (95/(5. 2 X 10_4) ) (g/m3)、纖維徑=15± 10 μ m、孔徑=5 50 μ m)并壓縮直至無紡布的厚度成為9mm壓縮而成的。首先，使清洗液槽WAl內(nèi)的生理食鹽液30ml通過管路L12和LI以30ml/min的流速流過到細胞分離過濾器SF而進行清洗。接著，在被處理液槽Tl中加入購入的人骨髓液20ml，將被處理液槽Tl內(nèi)的人骨髓液通過管路LI以6ml/min的流速導入到細胞分離過濾器SF，對于由細胞分離過濾器SF導出的被處理液，從管路L2進行取樣，利用自動血球計數(shù)裝置(Sysmex K-4500)實施血球數(shù)的測定。接著，使清洗液槽WAl內(nèi)的生理食鹽液30ml通過管路L12和LI以6ml/min的流速流到細胞分離過濾器SF，從而進行紅血球、白血球、血小板的清洗除去。接著，將含有胎牛血清10%的細胞培養(yǎng)基(a -MEM培養(yǎng)基(GIBC0公司制))150ml容納在作為第I細胞回收液導入部Cl的注射器中作為細胞回收液。然后，利用使壓力氣體為二氧化碳的圖2所示的外部按壓單元D對上述注射器的柱塞進行按壓，由與從第I細胞回收液導入部Cl通過管路L21和L2而使骨髓液流動的方向相反的方向，在流速為300ml/min、壓力為O. 3Mpa下注入到細胞分離過濾器SF，由此從細胞分離過濾器SF通過管路LI而將目標細胞組分暫時儲存在被處理液槽Tl中。接著，介由管路LI和L3移送到細胞培養(yǎng)容器CC (直徑為250_)，從管路L3進行 取樣，利用自動血球計數(shù)裝置(Sysmex K-4500)實施血球數(shù)的測定。通過用通過前的血球數(shù)去除細胞分離過濾器SF通過后的血球數(shù)而求得血球的通過率,結果紅血球和血小板的通過率均為95%以上，白血球的通過率為70%。另外，通過用細胞分離過濾器SF通過前的血球數(shù)去除回收溶液中的細胞數(shù)而求得細胞的回收率，結果如表I所示，紅血球為O. 5%，血小板為4%，白血球為25%。如上可知，利用細胞分離過濾器SF，紅血球和血小板大體上被除去。[表I]
I紅血球回收率(％ )~j白血球回收率(％) I血小板回收率(％)
實施例I O. 5254
比較例I 低于I259將含有被輸送到細胞培養(yǎng)容器CC的細胞組分的細胞回收液在5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)于370C的溫度環(huán)境下進行14天培養(yǎng)。此時，每2 3天進行培養(yǎng)基更換，使細胞增殖到細胞培養(yǎng)容器CC底面積大致鋪滿(confluent)。接著，示出培養(yǎng)來自人骨髓液的間葉系干細胞后的清洗濃縮方法。作為細胞回收過濾器CF，使用容納有細胞回收材料的過濾器,所述細胞回收材料是在具備出入口外徑為26mm、內(nèi)徑為22mm的圓筒狀柱中層疊36片由聚酯構成的無紡布(密度(單位面積重量(g/m2)/厚度(m)) = 1.6X 105 (85/ (5.3X 10-4)) (g/m3)、纖維徑=12±2 μ m、孔徑=10 26 μ m)并壓縮直至無紡布的厚度成為9mm而成的。使在清洗液槽WA2內(nèi)的生理食鹽液30ml通過管路L8以30ml/min的流速流過到細胞回收過濾器CF，從而進行清洗。接著，通過管路L7將細胞培養(yǎng)基排液到廢液槽W3，將清洗液槽WA2內(nèi)的生理食鹽液IOOml通過管路L8、L6和L4注入到細胞培養(yǎng)容器CC。接著，將細胞培養(yǎng)容器CC內(nèi)的生理食鹽液通過管路L7排液到廢液槽W3，清洗細胞培養(yǎng)容器CC內(nèi)。
接著，將細胞剝離液槽T5內(nèi)的胰蛋白酶-EDTA液(TrypLE SeleCt，GIBC0公司制)75ml通過管路L32、L31和L3，加入到除去了生理食鹽液的細胞培養(yǎng)容器CC中，在進行細胞培養(yǎng)容器CC的搖動后，在37°C的溫度條件下靜置10分鐘后，再次進行細胞培養(yǎng)容器CC的fe動，從而剝尚細胞。接著，將培養(yǎng)基槽T4內(nèi)的細胞培養(yǎng)基150ml通過管路L31和L3加入到細胞培養(yǎng)容器CC，制備剝離了培養(yǎng)細胞的細胞懸濁液。將該細胞懸濁液通過管路L4，介由細胞濾過過濾器RF (70 μ m),以10ml/min的流速流過到細胞回收過濾器CF，由細胞回收過濾器CF導出的廢液通過管路L5而廢棄在廢液槽W2中。將導入到細胞回收過濾器CF并由細胞回收過濾器CF導出的細胞懸濁液從管路L5進行取樣。
接著，使清洗液槽WA2內(nèi)的生理食鹽液30ml通過管路L8以10ml/min的流速流到細胞回收過濾器CF，從而從被細胞回收過濾器CF捕捉的細胞進行在細胞剝離時使用的胰蛋白酶等細胞剝離劑的除去。接著，將血清IOml容納在作為第2細胞回收液導入部C2的注射器作為細胞回收液。然后，利用使壓力氣體為二氧化碳的圖2所示的外部按壓單元D按壓上述注射器的柱塞，由第2細胞回收液導入部C2通過管路L51和L5，從與使細胞懸濁液流動的方向相反的方向，以300ml/min的流速、O. 3MPa的壓力注入到細胞回收過濾器CF，從而從細胞回收過濾器CF通過管路L6將清洗后的細胞回收到細胞回收槽T3。在此，通過用細胞回收過濾器CF通過前的細胞數(shù)去除細胞回收過濾器CF通過后的細胞數(shù)，從而求得細胞回收過濾器CF的培養(yǎng)細胞的通過率。另外，通過用細胞回收過濾器CF通過前的細胞數(shù)去除被細胞回收槽T3回收的培養(yǎng)細胞的細胞數(shù)，從而求得利用細胞回收過濾器CF的細胞回收率。應予說明，細胞數(shù)利用血球計數(shù)板進行測定。其結果是，如表2所示，在培養(yǎng)14天后得到的細胞數(shù)顯示出達2. O X IO7個的非常高的值。將其與將后述比較例I (通常使用的干細胞分離方法)的骨髓液處理量(2ml)換算成在細胞分離過濾器SF中的處理液量(20ml)而得到的值進行比較，得到約2. 5倍的大量細胞。用細胞回收過濾器CF對上述細胞懸濁液處理時的細胞數(shù)為血球計數(shù)板的檢測限以下，細胞的通過率成為0%，幾乎全部細胞被細胞回收過濾器CF捕捉。如表2所示，此時的由細胞回收過濾器CF回收的細胞數(shù)為I. 8 X IO7個，回收率顯示出90%這樣的非常高的值。在此,就含有胰蛋白酶溶液的細胞懸濁液而言,可以將細胞懸濁液量從225ml減少到10ml，確認細胞得到濃縮。另外，如表2所示，在細胞懸濁液流過到細胞回收過濾器CF后用生理食鹽液進行細胞回收過濾器CF的清洗時，細胞回收過濾器CF出口側的生理食鹽液中的最終胰蛋白酶濃度在通過280nm的紫外吸收光譜測定時為檢測限以下，胰蛋白酶被充分地清洗除去。[表2]
權利要求
1.一種細胞培養(yǎng)用一次性器具，其特征在于，包含 細胞培養(yǎng)容器，具有液體流入口和液體排出口， 細胞分離套件，與所述液體流入口連接，用于分離在細胞培養(yǎng)中使用的細胞，以及 細胞回收套件，與所述液體排出口連接，用于清洗濃縮在所述細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)的細胞。
2.根據(jù)權利要求I所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述細胞分離套件包含從含有細胞的被處理液選擇性地捕捉細胞的細胞分離材料。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述細胞分離套件由細胞分離過濾器、被處理液槽、廢液槽、第I細胞回收液導入部、以及第3管路構成， 所述細胞分離過濾器容納有從含有細胞的被處理液選擇性地捕捉細胞的細胞分離材料， 所述被處理液槽通過第I管路與所述細胞分離過濾器的上游側連接，容納有含有細胞的被處理液， 所述廢液槽通過第2管路與所述細胞分離過濾器的下游側連接， 所述第I細胞回收液導入部利用從所述第2管路的中途分支的管路進行連接，用于導入細胞回收液， 所述第3管路從所述第I管路的中途分支，與所述細胞培養(yǎng)容器的液體流入口連接。
4.根據(jù)權利要求3所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，是將細胞儲存袋與從所述第I管路的與所述第3管路相比上游側的位置分支的管路連接而成的， 所述細胞儲存袋用于將由從所述第I細胞回收液導入部導入到所述細胞分離過濾器的所述細胞回收液回收的細胞暫時儲存。
5.根據(jù)權利要求3所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述被處理液槽兼作細胞儲存袋， 所述細胞儲存袋將由從所述第I細胞回收液導入部導入到所述細胞分離過濾器的所述細胞回收液回收的細胞暫時儲存。
6.根據(jù)權利要求3 5中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述細胞分離過濾器使含有對細胞醫(yī)療或者再生醫(yī)療有用的細胞和夾雜細胞的被處理液流過而實質(zhì)上使夾雜細胞通過，從而實質(zhì)上捕捉對細胞醫(yī)療或者再生醫(yī)療有用的細胞，并且使所述細胞回收液向與使所述被處理液流過的方向相反的方向流過，從而回收被捕捉的細胞。
7.根據(jù)權利要求3 6中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述第I細胞回收液導入部是容納有所述細胞回收液的注射器， 所述注射器的柱塞被以氣體壓力驅動的外部按壓單元按壓，對所述細胞分離過濾器進行所述細胞回收液的供給。
8.根據(jù)權利要求3 7中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，是通過管路將容納有清洗液的清洗液槽與所述細胞分離過濾器的上游側連接而成的。
9.根據(jù)權利要求3 8中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，是由從所述第3管路的中途分支的管路連接容納有培養(yǎng)基的培養(yǎng)基槽和容納有包含細胞剝離劑的細胞剝離液的細胞剝離液槽中的至少任一個而成的。
10.根據(jù)權利要求I 9中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述細胞回收套件含有捕捉培養(yǎng)的細胞并使夾雜物通過的細胞回收材料。
11.根據(jù)權利要求I 10中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述細胞回收套件由細胞回收過濾器、第4管路、廢液槽、第2細胞回收液導入部、以及細胞回收槽構成， 所述細胞回收過濾器容納有捕捉培養(yǎng)的細胞并使夾雜物通過的細胞回收材料， 所述第4管路與所述細胞培養(yǎng)容器的液體排出口和所述細胞回收過濾器的上游側連接， 所述廢液槽通過第5管路與所述細胞回收過濾器的下游側連接， 所述第2細胞回收液導入部利用從所述第5管路的中途分支的管路進行連接，用于導入細胞回收液， 所述細胞回收槽利用從所述第4管路的中途分支的管路進行連接，用于將由從所述第2細胞回收液導入部導入到所述細胞回收過濾器的所述細胞回收液回收的細胞進行回收。
12.根據(jù)權利要求11所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，是使用于除去細胞凝集塊的細胞濾過過濾器設在所述第4管路的中途而成的。
13.根據(jù)權利要求11或12所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述細胞回收過濾器使含有在所述細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)而得的細胞的細胞懸濁液流過而捕捉被培養(yǎng)的細胞，使所述細胞回收液向與所述細胞懸濁液流過的方向相反的方向流過，從而回收被捕捉的細胞。
14.根據(jù)權利要求11 13中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，其中，所述第2細胞回收液導入部是容納有所述細胞回收液的注射器， 所述注射器的柱塞被以氣體壓力驅動的外部按壓單元按壓，對所述細胞回收過濾器進行所述細胞回收液的供給。
15.根據(jù)權利要求11 14中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具，是通過管路將容納有清洗液的清洗液槽與所述細胞回收過濾器的上游側連接而成的。
16.一種細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于，使用權利要求I 15中任一項所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具并具備配設于該細胞培養(yǎng)用一次性器具的管路的適當部位的泵和控制裝置， 所述泵將壓夾所述管路而開關其流路的流路開關閥和所述管路依次進行按壓， 所述控制裝置進行所述流路開關閥的開關控制和所述泵的驅動控制。
17.一種細胞培養(yǎng)裝置，其特征在于，是使用權利要求7或14所述的細胞培養(yǎng)用一次性器具并具備配設于該細胞培養(yǎng)用一次性器具的管路的適當部位的泵、外部按壓單元和控制裝置而成的， 所述泵將壓夾所述管路而開關其流路的流路開關閥和所述管路依次進行按壓， 所述外部按壓單元以按壓所述注射器柱塞的壓力氣體作為驅動源， 所述控制裝置進行所述流路開關閥的開關控制和所述泵的驅動控制以及所述外部按壓單元的驅動控制。
18.根據(jù)權利要求17所述的細胞培養(yǎng)裝置，其中，所述壓力氣體的供給源是容納有壓力氣體的儲氣瓶。
19.根據(jù)權利要求18所述的細胞培養(yǎng)裝置，其中，所述壓力氣體是二氧化碳。
20.一種細胞制備方法，其特征在于，使用權利要求16 19中任一項所述的細胞培養(yǎng)裝置，在封閉體系中連貫地進行如下工序播種的有用細胞的分離工序，在所述分離工序中被分離的有用細胞的培養(yǎng)工序，以及在所述培養(yǎng)工序中被培養(yǎng)的細胞的清洗、 濃縮工序。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于，能夠將有用細胞的分離工序、分離到的有用細胞的培養(yǎng)工序及已培養(yǎng)的細胞的清洗·濃縮工序全部連貫地進行，能夠實現(xiàn)不依賴大型設備的簡單構成的封閉體系系統(tǒng)而提高操作性，并且能夠制備安全性和品質(zhì)高的有用細胞。利用細胞培養(yǎng)用一次性器具，由配設于該細胞培養(yǎng)用一次性器具的管路的適當部位的流路開關閥和泵、與控制這些的控制裝置構成細胞培養(yǎng)裝置，所述細胞培養(yǎng)裝置由以下構成具有液體流入口(Lin)和液體排出口(Lout)的細胞培養(yǎng)容器(CC)，與液體流入口(Lin)連接的、用于使在細胞培養(yǎng)中使用的細胞分離的細胞分離套件(A)，與液體排出口(Lout)連接的、用于將細胞培養(yǎng)容器(CC)中培養(yǎng)得到的細胞清洗濃縮的細胞回收套件(B)。
文檔編號C12N5/02GK102971411SQ20118003255
公開日2013年3月13日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權日2010年7月1日
發(fā)明者小林明, 市村昌紀, 中谷勝 申請人:株式會社鐘化