專利名稱：水稻立枯絲核菌effector基因AG1IA010188及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種水稻立枯絲核菌effector基因AG1IA010188及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由立枯絲核菌引起的水稻紋枯病是一種真菌病害，和稻瘟病、白葉枯病并列水稻三大病害。立枯絲核菌侵染范圍廣，包括水稻、玉米、小麥、土豆、牧草、大豆等多種作物。立枯絲核菌能夠引起如此多種作物發(fā)生病害是與其分泌effector (效應(yīng)因子)分子密切相關(guān)的。這種分子可以調(diào)節(jié)宿主的先天免疫并增強(qiáng)寄生感染。現(xiàn)在已普遍認(rèn)為這些effector 是增強(qiáng)寄生感染的關(guān)鍵的致病性決定因素(Kamoun，2007 ；Hogenhout et al.，2009)。立枯絲核菌通過分泌effector分子，緊密的與其宿主植物聯(lián)系并精密的操控植物細(xì)胞。Effector靶向植物分子，改變植株進(jìn)程。在植物病原菌相互作用中，effector是主要的致病性決定因素，他們調(diào)解植物的先天免疫并且加強(qiáng)寄生感染。現(xiàn)在，在國際會議上， 絲狀病原菌effector的染色體組組織、進(jìn)化、交換及功能研究已經(jīng)成為很活躍的研究探討領(lǐng)域。絲狀病原菌分泌蛋白質(zhì)以擾亂它們侵入的宿主的概念并不是特別新穎，但是這方面的研究正在加快，因?yàn)樗股赡硞€(gè)特定病原菌物種中的整套分泌蛋白目錄成為可能 (Dean et al.，2005 ；Kamper et al.，2006 ；Haas et al. , 2009)。這一方面的研究被基因組測序時(shí)代的到來以及伴隨的分泌信號的云計(jì)算預(yù)測和其它的effector序列基序診斷程序所推動。一些病原真菌effector家族的特征之一是含有線性基序或是含有與特定功能相關(guān)的短序列模式，比如轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞內(nèi)或是靶向宿主細(xì)胞核。RXLR是這些effector分子中最突出的例子，它定義了卵菌RXLR家族中的一個(gè)宿主運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域。預(yù)測的RXLR也被用在高通量的篩選中，以盡快并有效的確定它們的新的功能活性。ATRl和ATR13是模式植物擬南芥的卵菌病原菌Hyaloperonospora arabidopsidis 的具有無毒基因活性的兩個(gè)effector。ATRl和ATR13是分泌型的RXLR effector長度分別為310和150個(gè)氨基酸，并分別誘發(fā)RPPl-Nd/ffsB和PP13_Nd介導(dǎo)的抗性(Allen et al.， 2004 ；Rehmany et al.，2005)。這種相互作用的共調(diào)解已經(jīng)形成了不同的、快速進(jìn)化的無毒基因和抗性基因的同位基因(Allen et al. ,2008 ；Hall et al.，2009)。ATR13除了具有信號肽和RXLR基序的特征外，還包含一個(gè)保守的7亮氨酸/異亮氨酸重復(fù)序列，這個(gè)重復(fù)序列是被RPP13識別所必須的(Allen et al.，2008)。事實(shí)上這個(gè)重復(fù)序列的突變并沒有進(jìn)化意味著它是發(fā)揮毒性作用所必須的(Allen et al.，2008)。另外，無毒活性也依賴于ATR13C-端的可變氨基酸(Allen et al.，2008)。值得注意的是在RPP13家族中至少有一個(gè)基因以迄今為止都不知道的方式識別ATR13的等位基因，這強(qiáng)調(diào)了無毒基因和抗性基因復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)(Hallet al. ,2009) ATRl和ATR13在H. arabidopsidis中的高度可變性及它們在擬南芥中的同源基因的多樣性意味著這些effector可能極其有助于病原菌的適應(yīng)性。ATRl和ATR13在抑制基礎(chǔ)的抗性通路中的作用已經(jīng)通過在細(xì)菌植物病原菌Pseudomonas syringae DC3000中進(jìn)行異源表達(dá)并運(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞中建立起來(Sohn et al.，2007)。當(dāng)被P. syringae DC3000運(yùn)輸?shù)綌M南芥中時(shí)，ATRl和ATR13都增加了毒性，并且減少了擬南芥中胼胝質(zhì)的積累(Sohn et al.，2007)。AVR3a 是 Phytophthora infestans 的細(xì)胞質(zhì) RXLR effector 蛋白。AVR3a 的一個(gè)有趣特征是它在致病機(jī)制中的雙重活性。AVR3a在表達(dá)R3a基因的植物中誘發(fā)過敏反應(yīng) (HR) (Armstrong et al.，2005)。但是在缺少 R3a 基因的植株中，AVR3a 抑制 P. infestans INFl隱地蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Bos et al.，2006)。這些不同的活性可以在結(jié)構(gòu)水平上分離。在C-端氨基酸殘基酪氨酸147處發(fā)生了刪除或突變的AVR3a保留了 R3a介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，但是不能抑制INFl誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Bos et al.，2006 ；2009)。另外，AVR3a的兩個(gè)主要的等位基因編碼的蛋白質(zhì)在effector結(jié)構(gòu)域處只有兩個(gè)氨基酸的差別，但是卻有著很明顯的活性差別。是AVR3aK8°m°3而不是AVR3a E80/M103活化了 R3a并且是INFl誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的比較強(qiáng)的抑制子((Bos et al.，2006)。除了 RXLR effector外，對P. infestans的分泌蛋白的研究又確認(rèn)了另一個(gè)細(xì)胞質(zhì)effector家族，即Crinkler。Crinkler是卵菌的另外一個(gè)大的、多樣化的effector 家族。高通量的功能篩選揭示了兩個(gè)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白CRm和CRN2(Crinkling and necrosis)，當(dāng)它們在植株中系統(tǒng)性的表達(dá)時(shí)會引起葉片的皺縮表型(Torto et al., 2003)。隨著P. infestans基因組序列的可利用性，對基因稀有區(qū)域的研究揭示了除了 RXLR effector基因外，CRN基因家族共定位于重復(fù)富集區(qū)域，并且跟其它的Wiytophthora基因家族相比，在P. infestans中CRN基因家族已經(jīng)戲劇性的擴(kuò)張(193個(gè)預(yù)測的基因)(Haas et al.，2009)。這個(gè)基因家族的擴(kuò)充已經(jīng)通過多基因復(fù)制和基因內(nèi)部重組事件發(fā)生，這一事件最終導(dǎo)致了一個(gè)大的、多樣化的嵌合effector系統(tǒng)(Haas et al.，2009)。CRN effector是以一個(gè)預(yù)測的N-端分泌信號肽為特征的模塊化的蛋白質(zhì)，后面是一個(gè)被保守的但并不是不變的LXLFLAK基序(CRN蛋白的主要的定義特征)定義的結(jié)構(gòu)域(Haas et al.，2009)。大多數(shù)CRN在LXLFLAK結(jié)構(gòu)域后攜帶一個(gè)以HVLVXXP基序結(jié)尾的DWL結(jié)構(gòu)域(Haas et al.， 2009) 0 Haas et al. O009)提出CRN之間的重組，尤其是HVLVXXP基序后的重組，產(chǎn)生了極其多樣化的C-端結(jié)構(gòu)域(在P. infestans中是由36個(gè)相異的氨基酸決定的)。類似于好幾個(gè)RXLR蛋白，一些CRN C-端(因此缺少預(yù)測的N-端轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域)的在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡(Haas et al.，2009)。然而，在病害中CRN誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的相關(guān)性仍然是不清楚的。Yoshida et al. (2009)發(fā)現(xiàn)了從稻瘟病菌lnal68特有序列中挖掘到的三個(gè)候選 effector 基因 Pex22，Pex31 和 Pex33，分別與三個(gè)無毒表型 Avr-Pia，Avr-Pik/km/kp 和 Avr-Pii有著完美的聯(lián)系。隨后的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了是effector Pex22,Pex31和Pex33 賦予了分別表達(dá)Pia Pik/km/kp和Pii抗性基因的水稻培養(yǎng)系的無毒性。通過定位克隆得知被鑒定為是 Avr-Pia 的 Pex22 是獨(dú)立的(Miki et al.，2009)。Pex22，Pex31 和 Pex33 都很小，在長度上分別為85，70和113個(gè)氨基酸，包含分泌信號，并且在水稻細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)中被識別，這意味著在感染的過程中它們被運(yùn)輸?shù)街参锛?xì)胞中。有趣的是Pex22形成一個(gè)包含四個(gè)同源物的小家族，這個(gè)小家族以兩個(gè)序列基序的出現(xiàn)為特點(diǎn)基序1是[LI]xAR[SE] [DSE]，類似于Avr-Piz-t的LxAR基序，能夠抑制BAX介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Li et al. ,2009)； 基序2是[RK]CXXCX12H，表現(xiàn)出與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)的C2H2鋅指基序的相似性(Yoshida et al. ，2009)。來自亞麻銹病菌Melampsora Iini的轉(zhuǎn)移effectorAvrL567家族是通過與亞麻的抗性蛋白L5，L6和L7直被接的相互作用被認(rèn)識到的(Dodds et al.，2006)。這個(gè)系統(tǒng)是特別的，因?yàn)锳vrL567-A和AvrL567-D的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到闡明(Wang et al.，2007)。這就允許在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)背景下，在基因?qū)蚧A(chǔ)上跟分子識別事件有關(guān)的多態(tài)性殘基的作用進(jìn)行檢測(Wang et al.，2007)。兩種蛋白都沒有接近已知的結(jié)構(gòu)同源物。四個(gè)重要的高度多態(tài)性殘基在AvrL567的50、56、90和96位置處，它們對于激活R蛋白是關(guān)鍵的，并定位在這些effector蛋白的表面。有趣的是AvrL567的四個(gè)殘基的分布橫跨整個(gè)蛋白質(zhì)表面，表明AvrL567和R蛋白的富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，要求對于整體相互作用有累積效應(yīng)的多重連接點(diǎn)。這在協(xié)同進(jìn)化中保持或發(fā)展毒性功能(對于病原體來說是有利的)但同時(shí)規(guī)避宿主的檢測可能是重要的。蛋白的結(jié)構(gòu)也揭示了結(jié)合DNA的兩個(gè)正電荷表面點(diǎn)，隨后的體外實(shí)驗(yàn)表明這些蛋白結(jié)合到核酸上。這表明當(dāng)從最初序列中幾乎不能得到有用線索時(shí)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)是怎樣促進(jìn)effector的功能研究的。使用圖位克隆策略克隆從L印tosphaeria maculans中得到了 AvrLml，AvrLm6 and AvrLm4-7 三個(gè)無毒基因(Gout et al. ,2006 ；Fudal et al. ,2007 ；Parlange et al., 2009)。它們編碼預(yù)測的小的從122到205個(gè)氨基酸的分泌蛋白，與公共數(shù)據(jù)庫中的任何蛋白都沒有相似性。AvrLm6和AvrLm4-7分別包含6個(gè)和8個(gè)半胱氨酸殘基。這些半胱氨酸可能在質(zhì)體外能穩(wěn)定AvrLm6和AvrLm4_7蛋白。然而，AvrLml只有一個(gè)半胱氨酸殘基，考慮到目前為止所有被描述的質(zhì)體外effector都是富半胱氨酸蛋白，所以AvrLml很可能轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞內(nèi)(KamOUn，2007)。盡管我們很清楚它們有無毒性的活性，但是AvrLm識別的機(jī)制，相應(yīng)的Rlm抗性基因和它們的作用位點(diǎn)仍然是不清楚的。跟目前克隆到的大多數(shù)其它真菌的effector真菌相比，這三個(gè)L. maculans基因有著較低的GC含量。它們都是單拷貝基因，位于富AT和富轉(zhuǎn)座子的60kb (AvrLm4-7)，133kb (AvrLm6)，269kb (AvrLml)的類異染色質(zhì)區(qū)域。這些effector定位在獨(dú)特的基因組環(huán)境中，是真菌有條件的獨(dú)立于染色體 (van der Does and R印，2007)，Plasmodium 的亞端粒區(qū)域(Pain et al.，2008)，或者在 P. infestans中基因稀有區(qū)域(Haas et al. ,2009)的遺跡。這被認(rèn)為能夠加快基因進(jìn)化并加速病原體對宿主的適應(yīng)性(van der Does and Rep, 2007 ；Pain et al.，2008 ；Haas et al.，2009)。絲狀植物病原菌已經(jīng)進(jìn)化出了具有抑制蛋白酶活性以保護(hù)幾種宿主水解酶活性的 effector 蛋白(Kamoun，2006)。近來 Misas-Villamil 禾口 van der Hoorn 已經(jīng)對這些 effector和它們的宿主靶標(biāo)做了評價(jià)O008)。寄主?；远舅?HST)是具有化學(xué)多樣性的effector分子，它是由植物致病真菌產(chǎn)生的作為毒性因子發(fā)揮功能。這些致病性決定因子只有在對產(chǎn)生這種毒素的病原菌敏感的宿主植物中才有活性(Wolpert et al.，2002)。有趣的是，好幾種蛋白質(zhì)HST，比如腐質(zhì)營養(yǎng)真菌物禾中 Pyrenophora tritici-repentis 禾口 Stagonospora nodorum 白勺 PtrToxA, SnToxl, SnTox2和SnToX4都表現(xiàn)出光依賴模式的壞死誘導(dǎo)并促進(jìn)了毒素敏感性的宿主小麥植株的感病性(Liu et al.，2004 ；Friesen et al.，2007 ；Abeysekara et al.，2009 ； Manning et al.，2009)。這些effector發(fā)揮功能所必須的，相應(yīng)的顯性的宿主基因Tsnl， Srml，Srm2，Snn4被繪制在毒素敏感宿主的染色體圖譜上，并且這些基因的產(chǎn)物被認(rèn)為是跟HST直接或間接相互作用的受體(Liu et al. ,2004 ；Friesen et al. ,2007 ；Abeysekara et al. ,2009 ；Manning et al.，2009)。值得注意的是，在HST中表現(xiàn)出與基因?qū)虿煌南嗷プ饔?，在HST中受體分子是必須的而不是在經(jīng)典的無毒-抗性基因相互作用中的抗性 (ffolpert et al.，2002)。PtrToxA 是在 P. triticirepentis 禾口 S. nodorum 的 HST 中研究的最透徹的。它有一個(gè)含N-端分泌信號的模塊結(jié)構(gòu)，分泌信號被切除以形成成熟蛋白，分泌信號后是宿主轉(zhuǎn)運(yùn)所必須的R⑶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-端effector結(jié)構(gòu)域(Sarma et al. ,2005 ； Manning et al. ,2007) 據(jù)報(bào)道PtrToxA定位在葉綠體并且跟葉綠體蛋白ToxABPl相互作用(Manning et al.，2007)。一旦它轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中，PtrToxA就以光依賴的方式，通過干擾光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II促進(jìn)毒力并最終誘導(dǎo)活性氧物質(zhì)積累(Manning et al.，2009)。類^pl蛋白(NLP)是誘導(dǎo)雙子葉植物壞死的細(xì)菌、真菌和卵菌毒素(Pemberton and Salmond, 2004 ；Ottmann et al. ,2009) 盡管它們在不同的分類群中的分布多種多樣，NLP具有一個(gè)共同的折疊特征，S卩，有一個(gè)七肽(GHRHDWE)基序和兩個(gè)保守的半胱氨酸，表現(xiàn)出與海洋生物產(chǎn)生的?？芗?xì)胞素和溶細(xì)胞毒素的結(jié)構(gòu)相似性(Gijzen and Nurnberger，2006 ；Ottmann et al. ,2009) 在半活體營養(yǎng)的卵菌病原體 P. so jae 和 P. infestans中NLP基因(NPP1和PiNPPl. 1)的表達(dá)在宿主感染的后期腐質(zhì)營養(yǎng)階段是上調(diào)的(Qutob et al. ,2002 ；Kanneganti et al. ,2006) 這些NLP在它們的溶細(xì)胞活性作用下可能有助于宿主組織的死亡，并因此在腐質(zhì)營養(yǎng)病原體生長過程中促進(jìn)其侵入(Qutob et al. ,2002 ；Kanneganti et al.，2006)。盡管現(xiàn)在已經(jīng)清楚一些NLP作為毒素促進(jìn)毒力， 并不見得這一家族的所有成員在它們的宿主中都有溶細(xì)胞毒素的活性。目前我們?nèi)匀徊磺宄芏鄀ffector的生物化學(xué)活性以及它們是如何增強(qiáng)病原體的成功生殖的。我們也幾乎不知道絲狀病原體effector的靶標(biāo)，特別是轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)部的 effector。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆立枯絲核菌菌株AGlIA中攜帶的effector基因和包含調(diào)控這個(gè)基因的啟動子的DNA片段。本發(fā)明的另一目的是提供該基因在設(shè)計(jì)農(nóng)藥分子靶點(diǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供該基因在建立分子檢測體系，檢測植物紋枯病發(fā)病情況中的應(yīng)用。本發(fā)明的更進(jìn)一步目的是提供該基因在提高水稻抗病育種中的應(yīng)用。本發(fā)明分離克隆的立枯絲核菌菌株AGlIA中的effector基因AG1IA010188，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。該核苷酸序列在立枯絲核菌菌絲中呈組成型表達(dá)。上述基因的蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。應(yīng)當(dāng)理解，在不影響蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本領(lǐng)域技術(shù)人員對SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修飾。因此，本發(fā)明還包括對編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸序列。本發(fā)明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明同樣包括將該基因的編碼區(qū)和一個(gè)誘導(dǎo)型啟動子連接，該啟動子可以在 IPTG誘導(dǎo)下，在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)這個(gè)基因。誘導(dǎo)型啟動子包括組織特異性表達(dá)的啟動子和精確環(huán)境誘導(dǎo)的啟動子。本發(fā)明還包括將該基因的編碼區(qū)和一個(gè)組成型表達(dá)的啟動子連接，該啟動子可以在任何條件下及在侵入組織的不同時(shí)期表達(dá)。這種組成型的啟動子優(yōu)選花椰菜花葉病毒35S的啟動子，該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。AG1IA010188與誘導(dǎo)型啟動子連接后加入誘導(dǎo)劑后表達(dá)，不加誘導(dǎo)劑不表達(dá)；與組成型啟動子連接后不需加入任何誘導(dǎo)劑便可持續(xù)表達(dá)。這樣，環(huán)境的改變，侵入植株的不同時(shí)期都可以改變基因的表達(dá)。其中環(huán)境條件包括植株的生長狀況、溫度、濕度等，侵入植株的不同時(shí)期包括孢子萌發(fā)、附著胞形成、侵入釘分化和侵染菌絲擴(kuò)展等。本發(fā)明提供的立枯絲核菌effector基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用之一是根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)及其功能來設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶點(diǎn)。應(yīng)用之二是將所述基因序列連接到任何一種含有熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)化載體，用任何一種轉(zhuǎn)化方法effector基因和熒光蛋白基因共價(jià)導(dǎo)入水稻或其它植物細(xì)胞。利用熒光共聚焦透射電鏡可以觀察到在水稻或其它植物細(xì)胞中與熒光蛋白融合表達(dá)的effector蛋白在植物細(xì)胞中的遷移及定位。利用此effector為誘餌蛋白釣出水稻或其它植株中與該 effector蛋白結(jié)合的受體蛋白。應(yīng)用之三是利用基因工程方法敲除水稻或其它植物細(xì)胞中該受體基因或刪除、 添加、突變該受體基因的一個(gè)或多個(gè)堿基以缺失或改變受體基因的功能，得到抗某一 effector的抗性植株。本發(fā)明提供的effector基因的另一個(gè)應(yīng)用是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，包括但不限于SNP (單核苷酸多態(tài)性)、SSR(簡單序列重復(fù)多態(tài)性)、RFLP (限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性)、CAP(切割擴(kuò)增片段多肽)。用這些標(biāo)記可檢測田間立枯絲核菌群體的生理小種及其遺傳結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，以及該effector基因在田間自然群體中的分布情況；有助于水稻品種的抗病性鑒定和立枯絲核菌小種的鑒定；也有助于抗病品種的合理布局和輪換，以便有效地控制紋枯病的發(fā)生。本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的無相應(yīng)effector基因功能的轉(zhuǎn)基因菌株，以及用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化的菌株。也可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其它的菌株。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過對立枯絲核菌effector基因的克隆及其功能分析，有助于揭示立枯絲核菌小種與水稻品種間特異性互作及其進(jìn)化的分子機(jī)理。在實(shí)踐上可以根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)及其功能設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶點(diǎn)；可以將水稻等宿主細(xì)胞中該 effector蛋白的受體蛋白基因敲除或突變，以得到持久抗病品種；有助于建立立枯絲核菌自然群體致病性變異的分子檢測體系，研究立枯絲核菌effector基因在田間自然群體中的分布情況，揭示立枯絲核菌群體中小種的組成和變異特點(diǎn)；也有助于水稻品種的抗病性鑒定及其合理布局和輪換，以便有效地控制紋枯病的發(fā)生。


圖1為立枯絲核菌effector基因AG1IA010188的圖位克隆示意圖；圖2為立枯絲核菌effector基因AG1IA010188的PCR檢測結(jié)果圖；圖3為立枯絲核菌effector基因AG1IA010188表達(dá)蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖；其中，圖2中泳道M為分子量標(biāo)記，依次為5000bp，3000bp, 2000bp, IOOObp， 750bp (加亮帶)，500bp, 250bp, IOObp ；泳道1、2為PCR產(chǎn)物；泳道3-6為轉(zhuǎn)化子菌株的PCR
產(chǎn)物，其中6為假陽性。圖3中泳道7為分子量標(biāo)記，大小如圖；泳道1、3、5為誘導(dǎo)后的蛋白條帶；泳道1、 3為effector蛋白產(chǎn)物；泳道5為空載；2、4、6為未誘導(dǎo)的菌液蛋白條帶。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。這些實(shí)施例除另有說明外，本申請中的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常采用常規(guī)條件例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。實(shí)施例1 預(yù)測的effector基因的克隆AGlIA菌株是由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所自行從田間水稻紋枯病發(fā)病植株上分離純化的，為水稻植株上普遍存在的真菌菌株，廣泛分布在水稻栽培的地區(qū)。(AG1IA菌株已公開發(fā)表于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士論文，立枯絲核菌AGlIA誘導(dǎo)玉米差異蛋白的分析，作者李蕓)在超凈工作臺下，用鑷子挑取少量AGlIA的菌絲，接入50ml PDA培養(yǎng)基中，把菌絲搗碎，280C，200r/m培養(yǎng)兩天后，用四層紗布過濾收集菌絲，用液氮研磨提取總RNA。用 oligodT做引物，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)預(yù)測的序列設(shè)計(jì)引物如下前弓I 物 BamHI 5，GCC GGA TCC CCG GGC CCAGAAGCATTCAAGTAC3，后弓 | 物 Not 15，ATTTGC GGC CGC TTACTTTTGTGTAGCGTCCACAAC3，，以 cDNA為模板克隆得到目的基因， 克隆到的基因如圖2。實(shí)施例2 :effector基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達(dá)PCR得到的目的基因電泳檢測沒有雜帶，即可根據(jù)TransGen Biotech Peasy-Elkit說明，把目的基因連接到表達(dá)載體pEASY_El上，經(jīng)過測序基因AG1IA010188與預(yù)測序列只有個(gè)別堿基的差別，堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。轉(zhuǎn)化條件與常規(guī)大腸桿菌轉(zhuǎn)化條件相同，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，37 °C培養(yǎng)至OD值為0. 6后，轉(zhuǎn)入^°C，IPTGlmM誘導(dǎo)7到 11個(gè)小時(shí)，表達(dá)effector蛋白。表達(dá)蛋白的SDS-PAGE檢測圖如圖3。實(shí)施例3 表達(dá)蛋白的致病性檢測收集AG1IA010188表達(dá)后的菌體超聲波破碎得到粗蛋白，破碎過程中注意勿使蛋白變性。選取生長一致的田間水稻葉片，放在內(nèi)置兩層濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中保持濾紙濕潤以使葉片保濕。用滅菌的牙簽在水稻葉片中央打一個(gè)小孔，用三層滅菌的0. 5cmX0. 5cm的濾紙片覆蓋在小孔上，接種粗蛋白的量為50微升。侵染后的葉片放在洲攝氏度光照培養(yǎng)箱，光照12h，黑暗12h，RH(病情指數(shù))80%。連續(xù)數(shù)天觀察葉片發(fā)病情況并拍照，記錄病程。侵染后6天對照蛋白侵染的葉片沒有肉眼可見的變化，AG1IA010188蛋白產(chǎn)物侵染的葉片小孔周圍發(fā)黃且孔變大；侵染后7天AG1IA010188蛋白產(chǎn)物侵染的葉片明顯比對照蛋白侵染的葉片黃，且局部區(qū)域出現(xiàn)黑色；侵染后8天對照蛋白侵染的葉片只是略微發(fā)黃，而 AG1IA010188蛋白產(chǎn)物侵染的葉片則大面積發(fā)黃、發(fā)黑，壞死(P⑶)。實(shí)施例4 effector基因的表達(dá)特性分析利用RT-PCR技術(shù)對收集AG1IA010188表達(dá)后的菌體超聲波破碎得到粗蛋白，破碎過程中注意勿使蛋白變性(破碎時(shí)間5S為宜，功率不超過200W，破碎過程中始終保持樣品在冰浴條件下)。選取生長一致的田間水稻葉片，放在內(nèi)置兩層濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中保持濾紙濕潤以使葉片保濕。用滅菌的牙簽在水稻葉片中央打一個(gè)小孔，用三層滅菌的 0. 5cmX0. 5cm的濾紙片覆蓋在小孔上，接種粗蛋白的量為50微升。侵染后的葉片放在觀攝氏度光照培養(yǎng)箱，光照12h，黑暗12h，RH80%。連續(xù)數(shù)天觀察葉片發(fā)病情況并拍照，記錄病程?；虻谋磉_(dá)模式進(jìn)行了分析。從接種水稻葉片和接種水稻葉片的菌絲提取的總RNA， 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，利用預(yù)測序列設(shè)計(jì)引物(引物序列同實(shí)施例1中的引物序列)，均能克隆到目的基因，如圖2所示，目的基因的大小與預(yù)期完全一致。PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性 4min ；94°C變性 50sec，55°C退火 50sec，72°C延伸 lmin，;35 個(gè)循環(huán)；72°C后延伸 lOmin。說明該基因?yàn)榻M成型表達(dá)的基因。實(shí)施例5 :effector基因AG1IA010188基因的應(yīng)用利用本發(fā)明提供的AG1IA010188基因的序列信息，根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)及功能設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶點(diǎn)；該新型農(nóng)藥的主要成分可以是AG1IA010188基因蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物，可以與AG1IA010188基因蛋白產(chǎn)物競爭性結(jié)合到水稻中的靶位點(diǎn)，但卻不會使水稻發(fā)病的信號通路進(jìn)一步向下游傳遞，從而使AG1IA010188基因蛋白產(chǎn)物不能結(jié)合到水稻中的靶位點(diǎn)，使發(fā)病信號通路阻斷在受體蛋白部位。還可以將該基因蛋白產(chǎn)物在水稻中的受體蛋白基因或信號通路中的其它基因沉默或敲除掉，培育抗紋枯病的水稻新品種，使紋枯病菌只能在植株表面形成附著胞或侵染墊，卻不能進(jìn)一步侵入到植株組織內(nèi)部；或者即使侵入植株組織內(nèi)部，因?yàn)槭荏w蛋白基因或信號通路中的其它基因被沉默或敲除掉而使過敏反應(yīng)等發(fā)病信號通路阻斷，使病癥減輕并且只能局限在某一小部分區(qū)域內(nèi)而不是發(fā)展到整株植株。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種水稻立枯絲核菌effector基因AG1IA010188，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所不。
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白，其氨基酸序列是1)SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的載體和宿主細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，其功能是通過啟動子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)控的。
6.如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于，所述啟動子為誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。
7.權(quán)利要求1所述基因在設(shè)計(jì)農(nóng)藥分子靶點(diǎn)中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述基因在建立分子檢測體系，檢測植物紋枯病發(fā)病情況中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述基因在水稻抗病育種中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗病育種是將權(quán)利要求1所述基因的蛋白產(chǎn)物在水稻中的受體蛋白基因或信號通路中的其它基因沉默或敲除掉。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水稻立枯絲核菌effector基因AG1IA010188，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。對本發(fā)明基因的研究，在實(shí)踐上可以根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)及其功能設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶點(diǎn)；可以將水稻等宿主細(xì)胞中該effector蛋白的受體蛋白基因敲除或突變，以得到持久抗病品種；有助于建立立枯絲核菌自然群體致病性變異的分子檢測體系，研究立枯絲核菌effector基因在田間自然群體中的分布情況，揭示立枯絲核菌群體中小種的組成和變異特點(diǎn)；也有助于水稻品種的抗病性鑒定及其合理布局和輪換，以便有效地控制紋枯病的發(fā)生。
文檔編號C12Q1/68GK102517298SQ20111043482
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者劉堯, 張丹華, 朱軍, 李雙成, 李平, 王世全, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)