專利名稱：一種雙鏈核苷酸序列、含其的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法
一種雙鏈核苷酸序列、含其的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種含多克隆位點的雙鏈核苷酸序列，包含該雙鏈核苷酸序列的重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
miRNA是真核生物中一類長度約為22個堿基的核苷酸，是參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA。成熟的miRNA是由較長的可折疊形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過 Dicer酶或類似于Dicer酶的內(nèi)切核酸酶加工形成的。miRNA基因存在于基因組的間隔區(qū)域或者內(nèi)含子當(dāng)中，這些小分子的RNA通過堿基配對與靶mRNA序列的3’MTR區(qū)結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)。
目前人們對miRNA的生物合成過程已經(jīng)了解比較清楚。簡單而言，所述合成過程包括細(xì)胞內(nèi)編碼的miRNA的基因首先在RNA聚合酶II的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)錄，從而形成長度約為幾百個核苷酸的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA ;初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在RNaseIII家族酶—— Drosha的參與下被加工成只含60_70nt具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單個miRNA前體pre_miRNA,然后在另一個RNaseIII家族酶——Dicer的參與下，miRNA前體被加工為雙鏈的miRNA，隨后接連形成單鏈成熟的miRNA。miRNA的轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄酶與蛋白表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄酶都屬于RNA 聚合酶II，因此可以使用同一個II型轉(zhuǎn)錄啟動子。
目前較為常用的miRNA表達(dá)載體一般是利用某一特定的miRNA基因的 5’ -flanking region和3’ -flanking region作為克隆位點來連接體外合成發(fā)卡形狀的 miRNA的前體。由于miRNA在基因組中的位置的特殊性，決定了在體外情況下，普通的miRNA 表達(dá)載體中無法插入外源蛋白進(jìn)行表達(dá)。這就限制了載體的用途。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于構(gòu)建既能夠表達(dá) miRNA又能夠表達(dá)蛋白的重組質(zhì)粒的雙鏈核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供包含所述雙鏈核苷酸序列的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒既能夠表達(dá)miRNA又能夠表達(dá)蛋白。
本發(fā)明的又一個目的是提供該重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一方面，本發(fā)明提供一種雙鏈核苷酸序列，所述核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別如式I和式2所示
5，-⑴ nlGAGACC ⑴ JITAAA ⑴ n3GGTCTC ⑴ n4_3’(式 I)
5，- (Y) n5GAGACC (Y) n6TTTAAA (Y) n7GGTCTC (Y) n8_3 ’(式 2)
其中，所述式I中的X為A、T、C或G，nl為I至20的整數(shù)，n2為I至20的整數(shù)，n3 為I至20的整數(shù)，n4為I至20的整數(shù)，條件是(X)nl, (X)n2, (X)n3或(X)n4均不包含GAGACC, TTTAAA 或 GGTCTC ；
所述式2中的Y為A、T、C或G，n5為I至20的整數(shù)，n6為I至20的整數(shù)，n7為 I至20的整數(shù)，n8為I至20的整數(shù)，條件是(Y)n5, (Y)n6, (Y)n7或(Y)n8均不包含GAGACC, TTTAAA 或 GGTCTC ;并且
Xil = Xil, (X)n2 與(Y)n7 互補；n3 = n6, (X)n3 與(Y)n6 互補。
優(yōu)選地，n2和n7為6至20的整數(shù)；n3和n6為6至20的整數(shù)。
優(yōu)選地，所述(X)nl為TGCTG，所述(X)n4為A ;
優(yōu)選地，所述(Y)n5為CCTGT，所述(Y)n8為C。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，所述核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別如SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示
(SEQ ID NO. I)
5’ -TGCTGGAGACCGAATTCTTTAAACTGCAGAAGCTTGGTCTCA-3’
(SEQ ID NO. 2)
5’ -CCTGTGAGACCAAGCTTCTGCAGTTTAAAGAATTCGGTCTCC-3’
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，所述核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別還可以如 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示
(SEQ ID NO. 3)
5’ -TGCTGGAGACCCTACTTCTTTAAAGTGTAAGAAGCTTGGTCTCA-3’
(SEQ ID NO. 4)
5’ -CCTGTGAGACCAAGCTTCTTACACTTTAAAGAAGTAGGGTCTCC-3’
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，所述核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別還可以如 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示
(SEQ ID NO. 5)
5’ -TGCTGGAGACCGCACATGTCTTTAAACTGCTAGCTTGGTCTCA-3’
(SEQ ID NO. 6)
5’ -CCTGTGAGACCAAGCTAGCAGTTTAAAGACATGTGCGGTCTCC-3’
另一方面，本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含上述任一雙鏈核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒為包含上述任一雙鏈核苷酸序列的序列如SEQID NO. 10所示的質(zhì)粒pcDNA6. 2-EmGFP-mir (重組質(zhì)粒pcDNA6. 2-EmGFP-PL)，其結(jié)構(gòu)如圖I所示。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，所述重組質(zhì)粒的序列如SEQ ID NO. 7所示(重組質(zhì)粒 pcDNA6. 2-EmGFP-PLI)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，所述重組質(zhì)粒的序列如SEQ ID NO. 8所示(重組質(zhì)粒 pcDNA6. 2-EmGFP-PL2)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，所述重組質(zhì)粒的序列如SEQ ID NO. 9所示(重組質(zhì)粒 pcDNA6. 2-EmGFP-PL3)。
又一方面，本發(fā)明提供上述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，所述方法包括以下步驟
I)分別合成上述雙鏈核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列，然后將兩條單鏈核苷酸序列退火形成所述雙鏈核苷酸序列；以及
2)將經(jīng)步驟I)得到的雙鏈核苷酸序列插入到質(zhì)粒中，以形成所述重組質(zhì)粒。
優(yōu)選地,所述步驟2)包括
連接經(jīng)步驟I)得到的雙鏈核苷酸序列和經(jīng)線性化的質(zhì)粒，用獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后從宿主細(xì)胞獲得所述重組質(zhì)粒。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，在步驟I)中，通過HPLC方法純化雙鏈核苷酸序列， 退火條件包括95°C水浴后緩慢降溫至室溫。
可以采用T4DNA連接酶連接雙鏈核苷酸序列與經(jīng)線性化的載體質(zhì)粒。所述宿主細(xì)胞可以為細(xì)菌細(xì)胞，例如T0P10。
普通的miRNA表達(dá)載體中無法插入外源蛋白基因進(jìn)行表達(dá)，這限制了該類載體的用途。和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過在miRNA載體中引入含多克隆位點的核苷酸序列，從而提供了一種多用途表達(dá)質(zhì)粒，實驗證明該重組質(zhì)粒即可以用于表達(dá)miRNA，也可以用于表達(dá)蛋白質(zhì)。
具體而言，本發(fā)明在miRNA表達(dá)載體的5’ -flanking region和 3’ -flankingregion克隆位點處連接了包含特定的多克隆位點的核苷酸序列。其中，核苷酸序列中的克隆位點之一BsaI可以用于利用BsaI DNA內(nèi)切酶的特殊切法而輕松地切出原來的 5’-flanking region 和 3’-flanking region 連接 pre-miRNA 的克隆位點，且同時不破壞核苷酸序列，因此可以通過連接表達(dá)miRNA的基因而表達(dá)miRNA。同時利用該核苷酸序列中的另一克隆位點DraI,可以切除掉miRNA表達(dá)載體的5’ -flanking region,進(jìn)而可以通過連接所需要表達(dá)的蛋白序列而表達(dá)目的蛋白。本發(fā)明利用一個特定的多克隆位點序列與pcDNA6. 2-EmGFP-mir載體的連接得到了一個可以用來表達(dá)miRNA和蛋白的多用途表達(dá)載體。
并且，本發(fā)明所提供的包含多克隆位點的核苷酸序列是經(jīng)過設(shè)計優(yōu)化的。 pcDNA6. 2-EmGFP-mir線性質(zhì)粒本來用于表達(dá)miRNA,該線性質(zhì)粒購買時即是線性的,兩端有粘性末端(參見圖2) ,5’ -flanking region和3’ -flankingregion及兩端的粘性末端對于miRNA的表達(dá)是必須的，序列不能改變，而此粘性末端不是DNA內(nèi)切酶的識別位點，不能用一般的DNA酶切開，所以不能自行連接一般的polylinker進(jìn)行擴(kuò)增，因此該線性質(zhì)粒使用一次就必須從公司購買一次，非常浪費成本。為了克服這個問題，本發(fā)明人通過試驗大量DNA酶的酶切位點，最終確立了限制性DNA內(nèi)切酶BsaI，該酶的酶切位點與酶識別位點不在一起
5’.....GGTCTC (N) I ..........3’
5......CCAGAG (N). ▲......3’
(上面序列中帶下劃線部分為識別位點，三角形代表酶切位點)。此酶切出的位點有四個堿基的粘性末端，這幾個堿基是隨機的堿基，沒有序列特異性，因此可用BsaI切出 pcDNA6. 2-EmGFP-mir粘性末端的四個堿基,這樣就不會破壞flanking region的堿基序列也就不會影響miRNA的表達(dá)，因此發(fā)明人設(shè)計了兩端加BsaI酶切位點。
關(guān)于DraI的設(shè)計,在圖I中可以看出在5’ -flanking region的前端有EmGFP的序列，此序列前后都有DraI酶切位點，在此序列的后面有終止密碼子(后一個DraI后， 5’ -flanking region前面，miRNA的表達(dá)不受影響)，因此，此線性的末端不能直接連接蛋白表達(dá)。在試驗中，本發(fā)明人在插入的多克隆位點中間加入一個DraI酶。加上插入的Dral， 該質(zhì)粒中共有三個DraI位點，用DraI酶切正好切除EmGFP和5’ -flanking region的區(qū)6域，而不破壞EmGFP前面的啟動子，因此蛋白可以正常表達(dá)。
綜上所述，本發(fā)明通過提供含優(yōu)化設(shè)計的多克隆位點的核苷酸序列，進(jìn)而提供了可以用于表達(dá)miRNA和蛋白質(zhì)的多用途表達(dá)載體，拓寬了特定表達(dá)載體的用途。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中
圖I為本發(fā)明提供的多用途載體pcDNA6. 2-EmGFP-PL質(zhì)粒示意性圖譜；
圖2顯示了載體cDNA6. 2-EmGFP-mir線性質(zhì)粒的粘性末端示意圖。
圖3為實施例I中電泳檢測SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2的退火結(jié)果，其中電泳圖左側(cè)為分子量Marker，右側(cè)為退火形成的雙鏈。
圖4為實施例I中電泳檢測pcDNA6. 2-EmGFP-PL重組質(zhì)粒的結(jié)果，其中右側(cè)為分子量Marker，左側(cè)為重組質(zhì)粒pcDNA6. 2-EmGFP-PL。
圖5為實施例I電泳檢測pcDNA6. 2-EmGFP-PL重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切結(jié)果，其中左側(cè)為分子量Marker，右側(cè)為酶切結(jié)果。
圖6為實施例2中的電泳檢測檢測pcDNA6. 2-EmGFP-PL I質(zhì)粒經(jīng)BsaI酶切的結(jié)果， 由于插入的雙鏈核苷酸與載體相比太小，看不到該片段。
圖7為實施例2中電泳檢測pcDNA6. 2-EmGFP-mir_155質(zhì)粒的結(jié)果，其中右側(cè)為分子量 Marker,左側(cè)為表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-155。
圖8為實施例2中電泳檢測pcDNA6. 2-EmGFP-mir_155質(zhì)粒經(jīng)MscI酶切的結(jié)果， 其中左側(cè)為分子量Marker，右側(cè)為酶切結(jié)果。
圖 9 顯示了實施例 2 中轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-mir_155 質(zhì)粒、pcDNA6. 2-EmGFP-PL I 質(zhì)粒后hsa-mir-155在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異，其中A為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，B為轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-PL I 質(zhì)粒組，C 為轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-155 質(zhì)粒組。
圖10為實施例3中dsRed擴(kuò)增結(jié)果，其中右側(cè)為分子量Marker，左側(cè)為dsRed。
圖11為實施例3中電泳檢測pcDNA6. 2-PLl-DsRed質(zhì)粒的結(jié)果，其中左側(cè)為分子量 Marker,右側(cè)為表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA6. 2-PLl-DsRed。
圖12為實施例3中電泳檢測pcDNA6. 2-PLl-DsRed質(zhì)粒經(jīng)DraI酶切的結(jié)果，其中右側(cè)為分子量Marker，左側(cè)為酶切結(jié)果。
圖13為實施例3中轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-PLl-DsRed質(zhì)粒后在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況 (紅色熒光)。
圖 14顯示了實施例 5 中轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-mir_34a質(zhì)粒、pcDNA6. 2-EmGFP_PL2 質(zhì)粒后hsa-mir_34a在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異，其中A為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，B為轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-PL2 質(zhì)粒組，C 為轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-34a 質(zhì)粒組。
圖15為實施例6中轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-PL2_DsRed質(zhì)粒后在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況 (紅色熒光)。
圖 16 顯示了實施例 8 中轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-mir_34c 質(zhì)粒、pcDNA6. 2-EmGFP_PL3 質(zhì)粒后hsa-mir_34c在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異，其中A為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，B為轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-PL3 質(zhì)粒組，C 為轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-34c 質(zhì)粒組。
圖17為實施例9中轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-PL3_DsRed質(zhì)粒后在Hela細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況(紅色熒光)。
具體實施方式
以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。其中，發(fā)明中所用到的 pcDNA6. 2-EmGFP-mir 載體(購自 Invitrogen)和 Hela 細(xì)胞(ATCC-CCL2)，以及后續(xù)試驗中所插入的外源蛋白序列為北京工業(yè)大學(xué)病毒藥理室所有(可購自Clontech Laboratories, Inc)。質(zhì)粒中量提取試劑盒為 QIAGEN Plasmid Midi kit,購于德國 QIAGEN 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于北京TIANGEN公司；所用的BsaI和DraI及其他常用的DNA內(nèi)切酶和T4DNA Ligase均購于英國NEB公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM，無血清培養(yǎng)基 Opti-MEM,胎牛血清,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine及miRNA反轉(zhuǎn)錄和miRNA定量檢測試劑盒均購于美國Invitrogen公司；Realtime PCR反應(yīng)儀為美國stratagene Mx3000P。
本發(fā)明所涉及的分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)如核酸操作技術(shù)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)等在科學(xué)文獻(xiàn)中都已有充分描述(如參見J 薩姆布魯克E F 弗里奇T 曼尼要蒂斯，《分子克隆實驗指南》(第三版))。涉及到各種試劑(或試劑盒)的具體操作，按照各試劑(或試劑盒) 的使用說明書進(jìn)行。
實施例I 采用 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 構(gòu)律重鉬質(zhì)粒 dcDNA6. 2-EmGFP-PL
I、采用本領(lǐng)域常規(guī)合成技術(shù)合成序列SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，然后使2條單鏈序列退火形成雙鏈序列，即為本發(fā)明提供的含多克隆位點的核苷酸序列。
在退火使得兩條單鏈形成雙鏈的過程中，兩條單鏈的濃度應(yīng)該是相同的，退火反應(yīng)體系中所用的單鏈的DNA的濃度為50 u M0首先將合成的兩條單鏈加入適量的TE緩沖液中配成濃度為200 u M的溶液，各取5 ill單鏈溶液加入到反應(yīng)EP管里，加入2 ill的IOx退火反應(yīng)液，加入8 ii I的無DNase/RNase的水，將反應(yīng)體系加入到95°C的水浴鍋中緩慢降溫至室溫，2. 5%瓊脂糖膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。
將所得到的雙鏈多克隆位點序列按梯度稀釋法稀釋到IOnM的濃度。S卩，首先取 I U I上一步得到的50 i! M的雙鏈多克隆位點序列母液加入到99 ill無DNase/RNase水中， 混勻得到雙鏈DNA的濃度為500nM，取500nM的雙鏈DNA Iu I加入到49 無DNase/RNase 的水中混勻得到濃度為IOnM的雙鏈多克隆位點序列。所的雙鏈片段_20°C保存。
2、連接得到的雙鏈多克隆位點序列和線性的pcDNA6. 2-EmGFP-MIR質(zhì)粒載體。
所用到的線性的pcDNA6. 2-EmGFP-MIR質(zhì)粒載體(SEQ ID NO. 10)的母液濃度為IOng/yl。在EP管中加入4iU IOnM雙鏈多克隆位點序列反應(yīng)液，2iU線性的 pcDNA6. 2-EmGFP-MIR 質(zhì)粒載體母液，2 u I IOx Ligase b u ffer, I u IDNA Ligase 11 U I, 無DNase/RNase的水，配成20 的反應(yīng)體系，16°C過夜連接。
3、制備T0P10感受態(tài)細(xì)菌
從37°C培養(yǎng)16-20hrs的新鮮平板上挑取T0P10單菌落，接種于3ml不含抗生素的 LB培養(yǎng)基中，37°C中速搖床培養(yǎng)過夜(250r/mim，12-16h)。取Iml上述培養(yǎng)物按I : 100 的接種比例加入到IOOml的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待菌液的OD值達(dá)到0. 3-0. 6時，將菌液移植到兩支預(yù)冷的無菌的50ml離心管中，冰浴30mins。4°C,3000g離心IOmins,棄上清,加A IOml冰冷的CaCl2重懸，冰上放置30min，4°C，3000g離心5mins，再次加入含10% DMSO 的2ml冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，按每管100 U I的量分裝到預(yù)冷無菌的EP管中。
4、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
取步驟2中的10 ill連接產(chǎn)物加入到步驟3中的100 ill的T0P10感受態(tài)細(xì)菌中， 將反應(yīng)體系冰上孵育30mins后，迅速放入42°C水浴中孵育90s熱激活,熱激活后再次冰浴3mins。冰浴結(jié)束后向反應(yīng)體系加入500 ill新鮮LB培養(yǎng)基，37°C，150r/min，復(fù)蘇培養(yǎng) 45mins。取200 復(fù)蘇好的菌液均勻涂到LB壯觀霉素選擇性固體培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)。
5、獲得 pcDNA6. 2-EmGFP-PL 重組質(zhì)粒
分別挑取步驟4中的單個菌落接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37°C，200r/min過夜搖菌 (12-16hrs)，次日取2ml菌液堿裂解法提取質(zhì)粒，I %瓊脂糖電泳檢測(圖4)。EcoRI酶切鑒定，EcoRI是插在PL中的一個酶，pcDNA6. 2-EmGFP-PL中只有一個EcoRI酶切切位點(圖 5)。鑒定正確，使用質(zhì)粒中提試劑盒制備pcDNA6. 2-EmGFP-PL質(zhì)粒。
由于此pcDNA6. 2-EmGFP-PL重組質(zhì)粒所包含的多克隆位點序列來自SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2，將其命名為 pcDNA6. 2_EmGFP-PLl，線性序列為 SEQ ID NO. 7。
實施例2將實施例I構(gòu)律的重纟目質(zhì)粒dcDNA6. 2-EmGFP-PL I用于表汰miRNA
I、合成 Hsa-miR-155 的 pre-miRNA 的互補單鏈序列(SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12)
正義鏈(SEQID NO. 11)
5-TGCTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCCCTATCGATTAGCATTA A-3
反義鏈(SEQID NO. 12)
5-CCTGTTAATGCTAATCGATAGGGGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACCCCTATCACGATTAGCATTAA C-3
序列最終含有MscI DNA內(nèi)切酶以便于檢測。2條單鏈退火合成雙鏈的過程如實施例I的步驟I所述。
2、pcDNA6. 2-EmGFP-PL I表達(dá)miRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及中量制備
用BsaI酶切小量制備的pcDNA6. 2-EmGFP-PL I質(zhì)粒，I %瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收大片段(圖6)，按照實施例I所述方法連接hsa-mir-155和線性的pcDNA6. 2-EmGFP-PL I 質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)菌，分別挑取單個菌落接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37°C 搖菌活化細(xì)胞8hrs，將活化后的細(xì)菌按I : 1000的比例接種到100ml LB培養(yǎng)基中， 37°C,250r/min過夜搖菌(12_16hrs)，次日使用質(zhì)粒中提試劑盒提取質(zhì)粒，將其命名為 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-155。MscI DNA內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒8hrs，1%瓊脂糖電泳膠鑒定。質(zhì)粒提取結(jié)果見圖7，MscI酶切結(jié)果見圖8。
3、pcDNA6. 2-EmGFP-mir_155 質(zhì)粒在 Hela 細(xì)胞表達(dá) miRNA
將pcDNA6. 2-EmGFP-mir_155 質(zhì)粒和 pcDNA6. 2-EmGFP-PL I 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞。Hela細(xì)胞按3xl05/孔的量鋪六孔板，用無抗生素的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到 90-95%融合的時候進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前Ihrs去掉6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入Iml無血清無抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基。4 ii g質(zhì)粒溶解在250 U I無血清無抗生素Opti-MEM培溶解在250 無血清無抗生素OPti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5mins后，將含質(zhì)粒的Opti-MEM培養(yǎng)基分別加入到含Iipofectamine的Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻，室溫孵育30mins，將脂質(zhì)體和質(zhì)粒的混合物均勻地滴加到6孔板中的Hela細(xì)胞中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜孵育后去掉舊培養(yǎng)基換上帶血清的DMEM培養(yǎng)基。18-36 小時以后提取RNA，DNaseI消化以后做反轉(zhuǎn)錄，用Realtime PCR儀檢測Hsanir-155的表達(dá)情況。反應(yīng)的條件是:共 40 個循環(huán)的“50°C 2mins，95°C，2mins ;95°C，15s ;60°C，lmin”; 95°C, Imin ;55°C, 30s,95°C, 30s。
實驗結(jié)果表明在hsa-mir-155表達(dá)量方面,轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-mir_155質(zhì)粒組比轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-PL I質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組增高7倍，證實pcDNA6. 2-EmGFP-PL I載體可以用于表達(dá)miRNA。實驗結(jié)果見圖9。
實施例3將實施例I構(gòu)律的重鉬質(zhì)粒dcDNA6. 2-EmGFP-PL I用于表汰dsRed蛋白
UdsRed蛋白DNA序列的克隆
蛋白表達(dá)所插入的外源蛋白核酸是紅色熒光蛋白dsRed蛋白核酸序列(SEQ ID NO 13)，此蛋白在波長為557nm的激發(fā)光照射下可以顯示紅色熒光。通過PCR的方式從質(zhì)粒 pDsRed-Monomer-Hyg-Nl載體中克隆得到?？寺eRed的上游和下游引物分別插入DraI酶切位點(上游弓 I 物 AGCITTGTTTAAAATGGACAAGACCGAGGACGTC ，下游引物 AGCITTGTTTAAACTA CTGGGAGCCGGAGTGGCG)。在 200 yl 的反應(yīng)管中加入 50 U I 的反應(yīng)體系lu 1(2. 5M) Taq DNA 聚合酶、5iil的IOx反應(yīng)緩沖液、I ill dNTP(10mM each),2u I每條引物溶液(5 u M), I U I 模板質(zhì)粒(0. I u g/ U I), ddH20 38 ill。PCR 反應(yīng)的設(shè)置條件95°C,5mins ;95°C，30s，58°C， 308，72°〇，11^11(共30個循環(huán))；72°C，5mins。將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用I %瓊脂糖電泳膠電泳并用瓊脂糖電泳回收試劑盒回收，目的產(chǎn)物大小為700bp左右(圖10)。
2、pcDNA6. 2-EmGFP-PL I表達(dá)蛋白質(zhì)粒構(gòu)建及中量制備
用DraI內(nèi)切酶酶切pcDNA6. 2-EmGFP-PL I質(zhì)粒，I %電泳膠電泳回收大片段，按照實施例I所述方法連接DsRed片段與回收到的線性pcDNA6. 2-EmGFP-PL I質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)菌，分別挑取單個轉(zhuǎn)化的菌落接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37°C 搖菌活化細(xì)胞8hrs，將活化后的細(xì)菌按I : 1000的比例接種到100ml LB培養(yǎng)基中， 37°C，250r/min過夜搖菌(12_16hrs)，次日使用質(zhì)粒中提試劑盒提取質(zhì)粒，將其命名為 pcDNA6. 2-PLl-DsRed，DraI DNA內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒8hrs，I %瓊脂糖電泳膠鑒定。質(zhì)粒提取結(jié)果見圖11，DraI酶切結(jié)果見圖12。
3、pcDNA6. 2-PLl-DsRed質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中表達(dá)與鑒定
將pcDNA6. 2-PLl-DsRed 質(zhì)粒和 pcDNA6. 2-EmGFP-PL I 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞。 Hela細(xì)胞按3xl05/孔的量鋪6孔板，用無抗生素的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到90-95 %融合的時候進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前Ihrs去掉6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)基加入Iml無血清無抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基，4 ii g質(zhì)粒溶解在250 ill無血清無抗生素Opti-MEM培養(yǎng)基中，10 ill Iipofectamine溶解在250 無血清無抗生素OPti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5mins后，將含質(zhì)粒的Opti-MEM培養(yǎng)基分別加入到含Iipofectamine的Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻，室溫孵育30mins，將脂質(zhì)體和質(zhì)粒的混合物均勻地滴加到6孔板中的Hela細(xì)胞中，37V, 5% CO2 培養(yǎng)箱中過夜孵育后去掉舊培養(yǎng)基換上帶血清的DMEM培養(yǎng)基。18-36小時以后熒光顯微鏡在557nm波長激發(fā)光條件下觀察轉(zhuǎn)染組Hela細(xì)胞紅色熒光的表達(dá)情況。10
實驗結(jié)果證實轉(zhuǎn)染PcDNA6. 2-PLl-DsRed質(zhì)粒組細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光的表達(dá)(圖13)，轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-PL I質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組無紅色熒光的表達(dá)，證明 pcDNA6. 2-EmGFP-PL I質(zhì)?？梢宰鳛橐环N表達(dá)蛋白的載體使用。
實施例4 采用 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 構(gòu)律重鉬質(zhì)粒 dcDNA6. 2-EmGFP-PL
基本上按照實施例I中所述操作構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA6. 2-EmGFP-PL,區(qū)別在于采用序列SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4形成含多克隆位點的核苷酸序列。
由于此pcDNA6. 2-EmGFP-PL重組質(zhì)粒所包含的多克隆位點序列來自SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4，將其命名為 pcDNA6. 2-EmGFP-PL2。
實施例5將實施例4構(gòu)律的重纟目質(zhì)粒dcDNA6. 2-EmGFP~PL2用于表汰miRNA
基本上按照實施例2所述操作進(jìn)行此實施例。
將重組質(zhì)粒pcDNA6. 2-EmGFP-PL2用于表達(dá)miRNA，區(qū)別在于采用 Hsa-miR-34a 代替 HsaiiR-155 和 pcDNA6. 2-EmGFP-PL2 一起構(gòu)建 miRNA 表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-34a。其中 Hsa_miR-34a(SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 15)為
正義鏈(SEQID NO. 14):
5-TGCTGTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTGTTTTGGCCACTGACTGACACAACCAGAAGACACTGCC A-3
反義鏈(SEQID NO. 15):
5-CCTG-TGGCAGTGTCTTCTGGTTGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACAACCAGCTAAGACACTGCCA C-3
將pcDNA6. 2-EmGFP-mir-34a 質(zhì)粒和 pcDNA6. 2-EmGFP_PL2 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞。
實驗結(jié)果表明在hsa-mir_34a表達(dá)量方面，轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-mir_34a質(zhì)粒組比轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-PL2質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組高5. 84倍，證實pcDNA6. 2-EmGFP_PL2載體可以用于表達(dá)miRNA。實驗結(jié)果見圖14。
實施例6將實施例4構(gòu)津的重組質(zhì)粒dcDNA6. 2-EmGFP~PL2用于表汰dsRed蛋白
基本上按照實施例3所述操作進(jìn)行此實施例，區(qū)別在于將重組質(zhì)粒 pcDNA6. 2-EmGFP-PL2和dsRed蛋白序列用于構(gòu)建表達(dá)dsRed蛋白的重組質(zhì)粒 pcDNA6. 2-PL2_DsRed。
將pcDNA6. 2-PL2-DsRed 質(zhì)粒和 pcDNA6. 2-EmGFP_PL2 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞。
實驗結(jié)果證實轉(zhuǎn)染PcDNA6. 2-PL2_DsRed質(zhì)粒組細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光的表達(dá)(圖15)，轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-PL2質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組無紅色熒光的表達(dá)，證明 pcDNA6. 2-EmGFP-PL2質(zhì)粒可以作為一種表達(dá)蛋白的載體使用。
實施例I 采用 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 構(gòu)津重組質(zhì)粒 dcDNA6. 2-EmGFP-PL
基本上按照實施例I中所述操作構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA6. 2-EmGFP-PL,區(qū)別在于采用序列SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6形成含多克隆位點的核苷酸序列。
由于此pcDNA6. 2-EmGFP-PL重組質(zhì)粒所包含的多克隆位點序列來自SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6，將其命名為 pcDNA6. 2-EmGFP-PL3。
實施例8將實施例7構(gòu)津的重組質(zhì)粒dcDNA6. 2-EmGFP~PL3用于表汰miRNA
基本上按照實施例2所述操作進(jìn)行此實施例。
將重組質(zhì)粒pcDNA6. 2-EmGFP_PL3用于表達(dá)miRNA，區(qū)別在于采用 Hsa-miR-34c 代替 HsaiiR-155 和 pcDNA6. 2-EmGFP-PL3 一起構(gòu)建 miRNA 表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-34c0 其中 Hsa_miR-34c (SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 17)為
正義鏈(SEQID NO. 16)
5-TGCTGAGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGCGTTTTGGCCACTGACTGACGCAATCAGAACTACACTGCC T-3
反義鏈(SEQID NO. 17)
5-CCTGAGGCAGTGTAGTTCTGATTGCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGCAATCAGCTAACTACACTGCCT C-3
將pcDNA6. 2-EmGFP-mir_34c 質(zhì)粒和 pcDNA6. 2-EmGFP_PL3 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞。
實驗結(jié)果表明在hsa-mir_34c表達(dá)量方面，轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-mir_34c質(zhì)粒組比轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-PL3質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組高6. 8倍，證實pcDNA6. 2-EmGFP_PL3載體可以用于表達(dá)miRNA。實驗結(jié)果見圖16。
實施例9將實施例7構(gòu)律的重鉬質(zhì)粒dcDNA6. 2-EmGFP~PL3用于表汰dsRed蛋白
基本上按照實施例3所述操作進(jìn)行此實施例，區(qū)別在于將重組質(zhì)粒 pcDNA6. 2-EmGFP-PL3和dsRed蛋白序列用于構(gòu)建表達(dá)dsRed蛋白的重組質(zhì)粒 pcDNA6. 2-PL3_DsRed。
將pcDNA6. 2-PL3_DsRed 質(zhì)粒和 pcDNA6. 2-EmGFP_PL3 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞。
實驗結(jié)果證實轉(zhuǎn)染PcDNA6. 2-PL3_DsRed質(zhì)粒組細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光的表達(dá)(圖17)，轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-PL3質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組無紅色熒光的表達(dá)，證明 pcDNA6. 2-EmGFP-PL3質(zhì)?？梢宰鳛橐环N表達(dá)蛋白的載體使用。
權(quán)利要求
1.一種雙鏈核苷酸序列，所述核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別如式I和式2所示5 ’ - (X) nlGAGACC (X) ^TTTAAA (X) n3GGTCTC (X) n4_3 ’式I5 ’ - (Y) n5GAGACC (Y) n6TTTAAA (Y) n7GGTCTC (Y) n8_3 ’式2其中，所述式I中的X為選自A、T、C或G，nl為I至20的整數(shù)，n2為I至20的整數(shù)，n3 為I至20的整數(shù)，n4為I至20的整數(shù)，條件是(X)nl、(X) n2、(X)n3或(X)n4均不包含GAGACC、 TTTAAA 或 GGTCTC ；所述式2中的Y為選自A、T、C或G，n5為I至20的整數(shù)，n6為I至20的整數(shù)，n7為 I至20的整數(shù)，n8為I至20的整數(shù)，條件是(Y)n5, (Y)n6, (Y)n7或(Y)n8均不包含GAGACC、 TTTAAA 或 GGTCTC ;并且n2 = n7, (X)n2 與(Y)n7 互補；n3 = n6, (X)n3 與(Y)n6 互補。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙鏈核苷酸序列，其特征在于，n2和n7為6至20的整數(shù)；n3 和n6為6至20的整數(shù)；優(yōu)選地，所述(X)nl為TGCTG，所述(X)n4為A ；優(yōu)選地，所述(Y)n5為CCTGT，所述(Y)n8為C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的雙鏈核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的雙鏈核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的雙鏈核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。
6.一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的雙鏈核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒為 pcDNA6. 2-EmGFP-PL。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒為 pcDNA6. 2-EmGFP-PLl，序列如 SEQ ID NO. 7 所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒為 pcDNA6. 2-EmGFP-PL2，序列如 SEQ ID NO. 8 所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒為 pcDNA6. 2-EmGFP-PL3，序列如 SEQ ID NO. 9 所示。
11.一種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項所述的重組質(zhì)粒的方法，所述方法包括1)分別合成如權(quán)利要求I至5中任一項所述的雙鏈核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列，然后使兩條單鏈核苷酸序列退火形成所述雙鏈核苷酸序列；以及2)將經(jīng)步驟I)得到的雙鏈核苷酸序列插入到質(zhì)粒中，以形成所述重組質(zhì)粒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟2)包括連接經(jīng)步驟I)得到的雙鏈核苷酸序列與經(jīng)線性化的質(zhì)粒，將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿CN 102533742 A主細(xì)胞，然后從宿主細(xì)胞獲得所述重組質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含多克隆位點的互補雙鏈核苷酸序列，包含該雙鏈核苷酸序列的重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。所述雙鏈核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸序列分別如式1和式2所示5’-(X)n1GAGACC(X)n2TTTAAA(X)n3GGTCTC(X)n4-3’(式1)，5’-(Y)n5GAGACC(Y)n6TTTAAA(Y)n7GGTCTC(Y)n8-3’(式2)。包含該雙鏈核苷酸序列的重組質(zhì)粒為多用途表達(dá)載體，可以用于表達(dá)miRNA和蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/11GK102533742SQ20111042580
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者周邵梅, 曾毅, 李澤琳, 盛望, 陳學(xué)斌 申請人:北京工業(yè)大學(xué)