專利名稱：基于STAT3和NF-κB雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，尤其涉及一種基于STAT3和NF-K B雙信號通路為靶點(diǎn)的高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型；本發(fā)明同時(shí)還涉及該抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在許多腫瘤細(xì)胞中，特別像結(jié)腸癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肺癌等細(xì)胞中，都有持續(xù)活化的STAT3 (信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3)和NF-kB (核因子-κ B)活性。NF-κ B 家族主要包括以下成員，具體為RelA (p65)、RelB、c-Rel、p50和p52，通常NF-kB以同源或者異源二聚體的形式存在，其中p65/p50 二聚體是哺乳動物中最常見的NF-kB形式。正常情況下，NF-kB 二聚體由于結(jié)合了其抑制蛋白lKBdnhibitor of NF-κ B)而主要滯留在細(xì)胞質(zhì)中，外加刺激或病理情況下由于IkB被過量降解而導(dǎo)致NF-KB活化入核行使一系列功能。而STAT3作為STATs分子家族的一員，受到上游信號細(xì)胞因子刺激或在某些酪氨酸激酶持續(xù)活化的狀態(tài)下，其C端705位酪氨酸被磷酸化而形成二聚體， 進(jìn)而入核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。STAT3和NF-kB入核之后都能結(jié)合特異的核酸序列調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(在啟動子區(qū)域一般為增強(qiáng)下游基因的轉(zhuǎn)錄);NF-κ B的結(jié)合序列通常為列5’-GGGRNNYYCC-3’ (R 代表嘌呤，Y代表嘧啶，N代表任意四種堿基之一)，而STAT3的結(jié)合序列為5’ -TT (C/A) CNNNAA-3’(N為任意四種堿基之一 )。NF-kB和STAT3的活化所調(diào)控的下游基因往往都與抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。大量證據(jù)表明，抑制上述兩種轉(zhuǎn)錄因子的活性或其上下游信號都將極大的抑制腫瘤細(xì)胞的生存、增殖和遷移(Wang等人=Science 1996 ； mi 等人EMB0 J 1996 ；Wang 等人Nat Med 1999 ； Ni 等人Cancer Res 2000 ； Leong 等入Proc Natl Acad Sci 2003 ； Barton ^A Mol Cancer Ther 2004 ； Kortylewski φ 人Nat Med 2005 ； Xin 等人Cancer Res 2009)。目前越來越多研究者意識到以STAT3和NF-kB為信號通路進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選的可行性，并開始嘗試相關(guān)的方法，但基于STAT3和NF-kB信號通路為靶點(diǎn)的篩藥系統(tǒng)由于所選用的細(xì)胞系本身的STAT3或NF-kB活性比較低，篩選特異性抑制劑時(shí)，往往需要事先外加細(xì)胞因子刺激細(xì)胞，再進(jìn)行化合物篩選，細(xì)胞因子的使用不僅使成本大大提高， 且篩藥體系每增加一步將大大增加系統(tǒng)的不穩(wěn)定性；同時(shí)外加的刺激并不能完全模擬腫瘤細(xì)胞實(shí)際具有較高STAT3或NF-kB活性的狀態(tài)。另外，最近的研究表明，在眾多腫瘤細(xì)胞中，STAT3和NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子還存在相互結(jié)合、共同作用促進(jìn)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)和腫瘤發(fā)生、發(fā)展的現(xiàn)象(Yang J等人=Cancer Res 2005 ； Yang J等人=Genes & Dev 2007 ； Torres J等人Nat Cell Biol 2008 ；Lee H等人=Cancer Cell 2009 ；Yu H等人:Nat Rev Cancer 2009)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種基于STAT3和NF-KB 雙信號通路為靶點(diǎn)的高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型。
本發(fā)明的另一目的是提供一種基于STAT3和NF-KB雙信號通路為靶點(diǎn)的高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的，就是提供一種基于STAT3和NF-KB雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型在篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
(一)基于STAT3和NF-κΒ雙信號通路為靶點(diǎn)的高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型本發(fā)明基于STAT3和NF-kB雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，采用 STAT3特異性結(jié)合序列與NF-kB特異性結(jié)合序列組合，建立報(bào)告系統(tǒng)載體；結(jié)合具有組成型NF-kB和STAT3的活性細(xì)胞，構(gòu)建成穩(wěn)定易用的高通量抗腫瘤藥物篩藥模型。
STAT3特異性結(jié)合序列與NF-KB特異性結(jié)合序列組合，建立的報(bào)告系統(tǒng)載體對上述兩信號通路的激活都能有顯著的響應(yīng)，能同時(shí)表征STAT3和/或NF-KB活性變化； 利用具有組成型NF-KB和STAT3的活性細(xì)胞構(gòu)建的藥物篩選模型，使整個(gè)報(bào)告系統(tǒng)載體達(dá)到理想的活化狀態(tài)，并且單獨(dú)抑制一個(gè)信號通路時(shí)在熒光水平上都能有顯著的變化， 最終使得該系統(tǒng)能夠靈敏地用于高通量藥物篩選。
所述NF-κΒ特異性結(jié)合序列為5’ -GGGRNNYYCC-3’，其中R為嘌呤，Y為嘧啶，N 為堿基。優(yōu)選序列為5，-GGGAATTTCC-3，(簡稱κ B)。
所述STAT3的特異性結(jié)合序列為5’ -TT(C/A)CNNNAA-3’，N為堿基。優(yōu)選序列為5，-TTCCCGTAA-3，或 / 禾口 5，-TTCCTGTAA-3，(統(tǒng)稱 SIE)。
所述報(bào)告系統(tǒng)載體是在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有STAT3特異性結(jié)合序列與NF-κΒ特異性結(jié)合序列作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成的報(bào)告系統(tǒng)載體。
所述報(bào)告系統(tǒng)載體中，STAT3特異性結(jié)合序列與NF-κΒ特異性結(jié)合序列以任何方式組合。為了達(dá)到最優(yōu)的篩選效果，所述STAT3特異性結(jié)合序列與NF-κΒ特異性結(jié)合序列的組合方式為結(jié)合序列包含η個(gè)STAT3特異性結(jié)合序列與m個(gè)NF-K B特異性結(jié)合序列，且n:m=l:廣16:1，兩種序列可以前后組合，也可以嵌套組合。
所述具有組成型NF-κΒ和STAT3的活性細(xì)胞為DU145前列腺癌細(xì)胞、H印G2人肝癌細(xì)胞、H1299人肺癌細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞、HCT119人結(jié)腸癌細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞、 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞或MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞。
(二)基于STAT3和NF- κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建本發(fā)明基于STAT3和NF-κΒ雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建，具體包括以下工藝步驟(1)報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建利用分子生物學(xué)方法在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有STAT3特異性結(jié)合序列與NF-κΒ特異性結(jié)合序列以及3’端含有 TATA盒序列的DNA片段，作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成報(bào)告系統(tǒng)載體。
上述STAT3特異性結(jié)合序列與NF- κ B特異性結(jié)合序列包含有η個(gè)STAT3特異性結(jié)合序列與m個(gè)NF-κΒ特異性結(jié)合序列，且n:m=l:廣16:1。
插入序列位于熒光素酶報(bào)告基因的上游，當(dāng)STAT3和/或NF-K B活化時(shí)，便可增強(qiáng)熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和熒光素酶翻譯，從而增強(qiáng)了熒光素酶的活性，加入熒光素酶底物時(shí)即可檢測到更強(qiáng)的熒光；抑制STAT3和/或NF-kB活性時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和熒光素酶翻譯的水平都降低，也就抑制細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的活性，加入熒光素酶底物時(shí)熒光強(qiáng)度也就減弱。(2)細(xì)胞模型的構(gòu)建將報(bào)告系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染同時(shí)具有組成型STAT3和NF-K B活性細(xì)胞后，用嘌呤霉素進(jìn)行陽性克隆篩選，選取對STAT3和NF-κ B信號抑制劑有響應(yīng)的克隆， 即為基于STAT3和NF-kB雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型。
在同時(shí)具有組成型STAT3和NF-K B活性的細(xì)胞中，報(bào)告系統(tǒng)載體能很好地被活化，當(dāng)使用STAT3和/或NF-K B信號通路抑制劑時(shí)即可使熒光被顯著抑制，構(gòu)建的細(xì)胞模型也就無需在外源刺激下靈敏地用于高通量藥物篩選。
(三)基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的應(yīng)用本發(fā)明基于STAT3和NF-kB雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用于篩選治療STAT3和/或NF-kB持續(xù)活化造成的細(xì)胞癌變、STAT3與NF-κ B相互結(jié)合、相互促進(jìn)引起的細(xì)胞癌變的藥物。具體篩選方法如下(1)將所述抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用100ml培養(yǎng)基接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為30% 40% ；(2)培養(yǎng)基中加入待篩選化合物0.1m廣anl，繼續(xù)培養(yǎng)對小時(shí)；(3)在96孔板中加入50ml穩(wěn)定型熒光素酶底物，使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀測定熒光強(qiáng)度并分析熒光抑制率，當(dāng)熒光抑制率達(dá)到40%以上得到初篩產(chǎn)物；(4)以化合物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)消除化合物對細(xì)胞模型的直接損傷，熒光抑制率達(dá)仍在 40%以上得到復(fù)篩產(chǎn)物，即為以STAT3和/或NF-κ B信號通路為靶點(diǎn)的腫瘤抑制藥物。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)以STAT3與NF-K B雙信號通路為靶點(diǎn)， 采用基于同時(shí)具有組成型STAT3與NF-K B活性的細(xì)胞系為策略，使報(bào)告系統(tǒng)本身在細(xì)胞中處于高度活化狀態(tài)，無需使用外加刺激物，得到的穩(wěn)定細(xì)胞模型可直接用于化合物的篩選；不僅大大降低了篩選的成本，同時(shí)也使整個(gè)篩選流程從“細(xì)胞培養(yǎng)一激活STAT3和/或 NF-kB —加化合物一檢測”簡化為“細(xì)胞培養(yǎng)一加化合物一檢測”，縮短了篩選的周期，減少了操作步驟，提升了系統(tǒng)的穩(wěn)定性、高效性及易用性，更適用于高通量藥物篩選。此外，本發(fā)明能同時(shí)篩選治療STAT3和/或NF-κΒ持續(xù)活化造成的細(xì)胞癌變，STAT3與NF-κ B相互結(jié)合、相互促進(jìn)引起的細(xì)胞癌變的藥物，相對于單信號的藥物篩選系統(tǒng)，具更高地效率。


圖1為使用Western-Blot方法檢測本發(fā)明所涉及的細(xì)胞中STAT3和NF-κ B 活性結(jié)果。
圖2為使用凝膠電泳阻抑試驗(yàn)(EMSA)檢測本發(fā)明所涉及的細(xì)胞中STAT3活性結(jié)^ ο
圖3為使用凝膠電泳阻抑試驗(yàn)(EMSA)檢測本發(fā)明所涉及的細(xì)胞中NF-KB活性結(jié)果。
圖4為本發(fā)明所用報(bào)告系統(tǒng)的基本原理圖。圖5為實(shí)施列1所用報(bào)告載體基本骨架。圖6為實(shí)施例1所構(gòu)建的報(bào)告系統(tǒng)載體SIE- κ B-Iuc插入序列的測序結(jié)果圖。圖7為實(shí)施例1利用細(xì)胞檢測報(bào)告系統(tǒng)載體中兩種結(jié)合序列的響應(yīng)能力。圖8為實(shí)施例1利用ΑΜ9細(xì)胞檢測報(bào)告系統(tǒng)載體啟動轉(zhuǎn)錄能力。圖9為實(shí)施例1抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株SKA及SKK對STAT3 或NF-κΒ活性升高的響應(yīng)。圖10為實(shí)施例1抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株SKA及SKK對STAT3 或NF-κΒ活性降低的響應(yīng)。圖11為實(shí)施例1所篩選天然產(chǎn)物化合物庫中，篩選出的經(jīng)文獻(xiàn)可證的特異性抑制化合物的抑制率。圖12為使用Western-Blot方法檢測所篩得未知天然產(chǎn)物h31 (10 μ Μ)處理 DU145細(xì)胞后其STAT3的活性的抑制效果。圖13為實(shí)施例2所構(gòu)建的報(bào)告系統(tǒng)載體(SIE-K B)_luc插入序列的測序結(jié)果圖。圖14為實(shí)施例2利用293T細(xì)胞檢測報(bào)告系統(tǒng)載體中(SIE- κ B) -Iuc對STAT3 和/或NF- κ B信號通路活化的響應(yīng)能力。圖15為實(shí)施例2抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型對STAT3或NF-κ B活性降低的響應(yīng)。圖16為實(shí)施例3所構(gòu)建的報(bào)告系統(tǒng)載體SIE/ κ B-Iuc插入序列的測序結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建方法和應(yīng)用做進(jìn)一步說明。實(shí)驗(yàn)中所采用的儀器和試劑如下
儀器PerkinElmer Victor3熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀。試劑螢火蟲熒光素酶測定試劑盒，包括普通熒光素酶底物以及穩(wěn)定型熒光素酶底物(Steady-Glo)購自Promega公司；白細(xì)胞介素6 (IL-6)及腫瘤壞死因子α (TNFa ) 購自P印rotech公司；PD180970，TPCA-I以及嘌呤霉素購自Sigma-Aldrich公司；用于篩藥的96孔板購自Corning公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自!^rmentas公司；載體提取及DNA產(chǎn)物純化相關(guān)試劑盒，購自天根生化公司；引物合成及測序，上海生工提供；DMEM (高糖)及胎牛血清購自Hyclone (Thermo公司);轉(zhuǎn)染試劑Ger^scort II購自南京慧基生物公司；篩選的化合物由國家小分子化合物資源中心提供；各種抗體購自Cell Signaling Technology 公司。實(shí)施例1
1、報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建
按圖4所示基本原理圖，人工構(gòu)建響應(yīng)序列，其中包含STAT3結(jié)合序列和NF-K B結(jié)合序列。STAT3結(jié)合序列簡稱SIE，NF-kB結(jié)合序列簡稱κΒ。這里的STAT3結(jié)合序列由5，-TTCCCGTAA-3，和5，-TTCCTGTAA-3，各8個(gè)交替串聯(lián)；NF- κ B結(jié)合序列為 5’-GGGAATTTCC-3’ ；將兩種結(jié)合序列串聯(lián)在一起，后面加上通用的TATA盒輔助序列 5’ -ΤΑΤΑΤΑΑ-3’，插入到通用的熒光素酶報(bào)告載體pBR322-luC-puro，得到重組載體命名為SIE-K B-Iuc ；作為對照，將單獨(dú)包含STAT3結(jié)合序列或NF-κ B結(jié)合序列(其余構(gòu)成一樣) 的核酸序列插入熒光素酶報(bào)告載體上，分別命名為SIE-Iuc和κΒ-luc。這里兩種響應(yīng)元件序列的比例為16:1，該比例根據(jù)構(gòu)建細(xì)胞模型時(shí)所用具有組成型NF-kB和STAT3 活性細(xì)胞(參見圖1，圖2，圖3)的實(shí)際情況以及對報(bào)告基因的啟動情況調(diào)整。熒光素酶報(bào)告載體pBR322-luC-puro由pBR322載體Hind III和Ml I之間插入北美螢火蟲熒光素酶 (Firefly Luciferase，參見 J R de Wet 等人Mol. Cell. Biol. 1987)報(bào)告基因和嘌呤霉素基因(Puromycin，參見 Lacalle RA 等人Gene. 1989，GenBank: M25346. 1)所得，并且熒光素酶報(bào)告基因和嘌呤霉素篩選基因通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(IRES)相連，嘌呤霉素基因終止密碼子下游有AATAAA序列為poly A加尾信號。pBR322-luC-puro多克隆位點(diǎn)位于原EcoR I和Hind III之間(參見圖5)。
構(gòu)建時(shí)，先插入含有NF-K B結(jié)合序列和TATA盒的序列，然后插入STAT3結(jié)合序列，最終得到SIE-κ B-TATA盒的整體插入序列，具體步驟如下①熒光素酶報(bào)告載體 pBR322-luc-puro用天根高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒提取，取10 Pg以Bio I和Hind III (各3 μ )做雙酶切，37 8 h，瓊脂糖凝膠電泳，使用天根DNA純化回收試劑盒回收，得到產(chǎn)物I ；將兩條帶有粘性末端(并可與》10 I和Hind III酶切位點(diǎn)配對)的互補(bǔ)引物(包含了 NF- κ B結(jié)合序列和TATA盒序列，見下劃線)
權(quán)利要求
1.基于STAT3和NF-KB雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于采用STAT3特異性結(jié)合序列與NF-kB特異性結(jié)合序列組合，建立報(bào)告系統(tǒng)載體；結(jié)合同時(shí)具有組成型STAT3和NF-kB的活性細(xì)胞，構(gòu)建成穩(wěn)定易用的高通量抗腫瘤藥物篩選模型。
2.如權(quán)利要求1所述基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述NF-κ B特異性結(jié)合序列為5’ -GGGRNNYYCC-3’ ；其中R為嘌呤，Y為嘧啶，N為堿基。
3.如權(quán)利要求1所述基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述STAT3的特異性結(jié)合序列為5’ -TT(C/A)CNNNAA-3’，N為堿基。
4.如權(quán)利要求1所述基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述報(bào)告系統(tǒng)載體是在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有STAT3特異性結(jié)合序列與NF-kB特異性結(jié)合序列作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成的報(bào)告系統(tǒng)載體。
5.如權(quán)利要求1所述基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述報(bào)告系統(tǒng)載體中，STAT3特異性結(jié)合序列與NF-kB特異性結(jié)合序列的組合的方式為結(jié)合序列包含η個(gè)STAT3特異性結(jié)合序列與m個(gè)NF-KB特異性結(jié)合序列，且 n:m=l:l 16:1。
6.如權(quán)利要求1所述基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述同時(shí)具有組成型NF-kB和STAT3的活性細(xì)胞為DU145前列腺癌細(xì)胞、!fepG2人肝癌細(xì)胞、H1299人肺癌細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞、HCT119人結(jié)腸癌細(xì)胞、Hela 人宮頸癌細(xì)胞、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞或MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，包括以下工藝步驟(1)報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建利用分子生物學(xué)方法在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有STAT3特異性結(jié)合序列與NF-kB特異性結(jié)合序列以及3’端含有 TATA盒序列的DNA片段，作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成報(bào)告系統(tǒng)載體；(2)細(xì)胞模型的構(gòu)建將報(bào)告系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染同時(shí)具有組成型STAT3和NF-KB活性細(xì)胞后，用嘌呤霉素進(jìn)行陽性克隆篩選，選取對STAT3和NF-κ B信號抑制劑有響應(yīng)的克隆， 即為基于STAT3和NF-kB雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型。
8.如權(quán)利要求7所述基于STAT3和NF-κB雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述STAT3特異性結(jié)合序列與NF-kB特異性結(jié)合序列包含有η個(gè)STAT3特異性結(jié)合序列與m個(gè)NF-κ B特異性結(jié)合序列，且n:m=l 廣16:1。
9.如權(quán)利要求1所述基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用于篩選治療STAT3和/或NF-kB持續(xù)活化造成的細(xì)胞癌變、STAT3與NF-κ B相互結(jié)合、相互促進(jìn)引起的細(xì)胞癌變的藥物。
10.如權(quán)利要求9所述基于STAT3和NF-κ B雙信號通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型在用于篩選治療STAT3和/或NF-kB持續(xù)活化造成的細(xì)胞癌變、STAT3與NF-κ B 相互結(jié)合、相互促進(jìn)引起的細(xì)胞癌變的藥物，其特征在于所述篩選抗腫瘤藥物的方法包括以下工藝步驟(1)將所述抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型用100μ 1培養(yǎng)基接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為30% 40% ；(2)在培養(yǎng)基中加入待篩選化合物0.1μ廣2μl，繼續(xù)培養(yǎng) 小時(shí)；(3)在96孔板中加入50μ 1穩(wěn)定型熒光素酶底物，使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀測定熒光強(qiáng)度并分析熒光抑制率，當(dāng)熒光抑制率達(dá)到40%以上得到初篩產(chǎn)物；(4)以化合物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)消除化合物對細(xì)胞模型的直接損傷，熒光抑制率達(dá)仍在 40%以上得到復(fù)篩產(chǎn)物，即為以STAT3和/或NF-K B信號通路為靶點(diǎn)的腫瘤抑制藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于STAT3和NF-κB雙信號通路為靶點(diǎn)的高通量抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，該模型采用STAT3特異性結(jié)合序列與NF-κB特異性結(jié)合序列組合建立報(bào)告系統(tǒng)載體；結(jié)合同時(shí)具有組成型STAT3和NF-kB活性細(xì)胞構(gòu)建而成，用于篩選治療STAT3和/或NF-κB持續(xù)活化造成的細(xì)胞癌變，STAT3與NF-κB相互結(jié)合、相互促進(jìn)引起的細(xì)胞癌變的藥物，相對于單信號的藥物篩選系統(tǒng)具更高的效率。由于選用同時(shí)具有組成型STAT3和NF-kB的活性細(xì)胞，模型細(xì)胞中報(bào)告基因處于高度活化狀態(tài)，無需使用外加刺激物，簡化了篩選流程，降低了篩選成本，提升了系統(tǒng)穩(wěn)定性、高效性及易用性，更適用于高通量藥物篩選。
文檔編號C12N15/63GK102492656SQ20111042335
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者杜宇平, 楊金波, 王勤, 陳星 申請人:蘭州大學(xué)