專利名稱：一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程和組織工程領(lǐng)域，特別是將力學(xué)環(huán)境與均勻電場環(huán)境聯(lián)合作用于細(xì)胞的培養(yǎng)裝置。
背景技術(shù)：
在組織工程中，細(xì)胞、組織的體外功能化培養(yǎng)已成為組織工程的核心，也是形成組織工程產(chǎn)業(yè)的必要技術(shù)基礎(chǔ)。而提供與體內(nèi)細(xì)胞生存條件相近似的或盡可能有利的體外生長環(huán)境，對于細(xì)胞、組織的三維培養(yǎng)和功能化至關(guān)重要。其中，機(jī)械力、電場等物理影響因子在其中起著不可忽視的作用。力學(xué)環(huán)境對器官、組織、細(xì)胞甚至亞細(xì)胞等各個層次的生命活動都有重要的影響。 如血流產(chǎn)生的剪切力，直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能均產(chǎn)生影響，有別于靜態(tài)培養(yǎng)情況。內(nèi)皮細(xì)胞在剪切力作用下細(xì)胞面積和長軸逐漸增加，長軸沿流向排列； 剪切力能激活內(nèi)皮細(xì)胞整合素、鉀離子、鈣離子通道等將機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為生化信號，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附及分泌等；剪切力能夠誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抑制蛋白表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。細(xì)胞間隙液流體剪切力可有助于骨細(xì)胞感知細(xì)胞周圍機(jī)械環(huán)境變化，在機(jī)械力信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用，從而影響骨細(xì)胞活化、骨細(xì)胞礦物動態(tài)平衡和礦化等。牽張力可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化、礦化，這種調(diào)節(jié)表現(xiàn)出對牽張力大小的依賴性。低剪切力可激活血管平滑肌細(xì)胞的C-fos和C-myc基因，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)剪切力-血管平滑肌細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡。內(nèi)源性生理性電場廣泛存在于活體組織器官，對細(xì)胞行為具有明顯的影響，外源性的電場對細(xì)胞功能也具有明顯的影響。一定強(qiáng)度的電場刺激可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力。用電容耦合電場治療小鼠脊椎骨骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)電場可逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松。電場可促進(jìn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖和骨生長因子如骨形成蛋白、β轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子II的形成。在心肌細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加載脈沖直流電場，發(fā)現(xiàn)肌原纖維α-肌動蛋白、間隙連接蛋白43、α -肌球蛋白重鏈及β -肌球蛋白重鏈呈高水平表達(dá)，心肌細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楠M長且平行于電場方向排列，可見閏盤，相鄰心肌細(xì)胞間建立縫隙連接，呈電-機(jī)械偶聯(lián)。無電場作用時，心肌細(xì)胞上述特征標(biāo)記表達(dá)很低。有實(shí)驗(yàn)顯示，對缺血性心肌病心力衰竭患者在絕對不應(yīng)期施加脈沖直流電場，可加強(qiáng)心室整體的收縮功能，提高射血分?jǐn)?shù)。由以上可知，力刺激或電場刺激的分別加載，能夠?qū)?xì)胞的生長產(chǎn)生影響。單一的力刺激和單一的電場刺激對于維持細(xì)胞正常功能、促進(jìn)細(xì)胞分化及分泌等已經(jīng)被廣泛研究。目前已經(jīng)有研究者開始考慮將這兩種因素的綜合影響應(yīng)用在組織、細(xì)胞的培養(yǎng)中。已有的電場加載方式中，采用的電極體系多為針電極-針電極、棒電極-棒電極等，而有的電極體系不能提供均勻的電場環(huán)境，如針電極-板電極體系。在我們的先期研究中，在剪切力加載裝置中采用了針電極-板電極，不能提供均勻電場和剪切力刺激同時加載。國內(nèi)至今也還未發(fā)現(xiàn)可同時對細(xì)胞加載剪切力和均勻電場刺激的培養(yǎng)裝置。本發(fā)明提供一種能同時加載剪切力刺激和均勻電刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。

發(fā)明內(nèi)容
體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相差甚遠(yuǎn)，模擬體內(nèi)細(xì)胞的生長環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化，對推動細(xì)胞和組織工程快速發(fā)展有深遠(yuǎn)的影響，本發(fā)明提供了一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有方法不能模擬體內(nèi)細(xì)胞處于剪切力、電刺激同時存在的物理微環(huán)境的技術(shù)問題，提出一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激細(xì)胞培養(yǎng)裝置，將細(xì)胞置于剪切力刺激與電刺激的聯(lián)合作用下，模擬體內(nèi)細(xì)胞生存環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的生長及分化， 構(gòu)建出具有特定功能的細(xì)胞或組織。本發(fā)明為一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括動物細(xì)胞培養(yǎng)箱、信號發(fā)生器，以及設(shè)置在動物細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)部的蠕動泵、上游儲液瓶、下游儲液瓶、三通、空氣濾器和平板流動腔。蠕動泵、上游儲液瓶、下游儲液瓶、三通和空氣濾器共同構(gòu)成培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)，用于為平板流動腔內(nèi)的細(xì)胞生長提供循環(huán)的細(xì)胞培養(yǎng)液從而施加剪切力；信號發(fā)生器有正極和負(fù)極兩個電極，正極通過電極線與平板流動腔的下平板電極相連，負(fù)極通過電極線與平板流動腔的上平板電極相連，為平板流動腔內(nèi)的細(xì)胞生長提供均勻的電場刺激；平板流動腔，用于提供細(xì)胞生長所需的空間。培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)各部分具體連接為上游儲液瓶與下游儲液瓶之間通過三條硅膠管連接，第一條硅膠管上連接有蠕動泵，硅膠管兩端分別連接在下游儲液瓶的底部位置和上游儲液瓶的頂部位置，下游儲液瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液在蠕動泵的作用下被輸送到上游儲液瓶；第二條硅膠管的兩端分別連接在下游儲液瓶上靠近頂部的位置和上游儲液瓶上靠近頂部的位置，以連通兩個儲液瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液上方的氣體環(huán)境，同時第二條硅膠管通過三通連接空氣濾器，使得上游儲液瓶、下游儲液瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液上方氣體環(huán)境與動物細(xì)胞培養(yǎng)箱中氣體環(huán)境相通，有利于維持細(xì)胞所需的濕度和PH值，而空氣濾器可以防止細(xì)菌進(jìn)入， 保證細(xì)胞生長的無菌環(huán)境；第三條硅膠管的一端連接在下游儲液瓶的頂部位置，另一端連接在上游儲液瓶上的位置低于第二條硅膠管連接端，當(dāng)上游儲液瓶內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液的水平面到達(dá)第三條硅膠管的位置時，細(xì)胞培養(yǎng)液回流到下游儲液瓶中。上游儲液瓶底部通過硅膠管與平板流動腔的流體入口連通；下游儲液瓶頂部通過硅膠管與平板流動腔的流體出口連通，形成一個細(xì)胞培養(yǎng)液循環(huán)系統(tǒng)。平板流動腔的結(jié)構(gòu)包括蓋子、上平板電極、下平板電極、硅膠墊圈、底座、流體入口和流體出口。其中，蓋子上開有長方體槽，便于安裝流體入口和流體出口，并在蓋子上開有凹槽，以便于固定上平板電極。上平板電極電極上有兩個圓孔，分別用來固定流體入口和流體出口。底座上開有凹槽用來固定下平板電極，底座上還開有長方體槽以便于觀察細(xì)胞。蓋子和底座的長邊兩側(cè)均鉆有螺孔，用于安裝螺絲以固定平行板裝置。底座放置在最下面，在底座的凹槽中固定下平板電極，在下平板電極上放置有長方形硅膠墊圈，硅膠墊圈上放置上平板電極，蓋子放置在上平板電極上，通過凹槽固定上平板電極；上平板電極、硅膠墊圈及下平板電極共同圍成流動腔。流體入口和流體出口分別用生物膠固定在上平板電極兩端的圓孔上，與所述流動腔相通。
剪切力-均勻電場聯(lián)合作用細(xì)胞培養(yǎng)裝置中平板流動腔的蓋子、底座以及流體入口、流體出口的材質(zhì)為有機(jī)玻璃、聚碳酸酯。平板流動腔的上平板電極和下平板電極由導(dǎo)電玻璃組成，或者由導(dǎo)電玻璃和導(dǎo)電聚合物組成，導(dǎo)電玻璃為摻雜氟的二氧化錫導(dǎo)電玻璃，或者氧化銦錫導(dǎo)電玻璃；導(dǎo)電聚合物為聚吡咯、或者聚吡咯與聚乳酸的共聚物、或者聚吡咯與殼聚糖的共聚物，沉積或平鋪于導(dǎo)電玻璃上，導(dǎo)電聚合物沉積時控制膜的透明度，以便于細(xì)胞觀察。儲液瓶的材質(zhì)為玻璃、塑料、聚碳酸酯，經(jīng)由循環(huán)培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)中空氣濾器與動物細(xì)胞培養(yǎng)箱相通；儲液瓶的容量在0. 2L-1. OL之間。剪切力刺激為定常流或者脈動流的流體剪切應(yīng)力。電刺激為恒定電壓、脈沖電壓或者微直流電。上平板電極和下平板電極面積、大小相同，位置相對，能提供均勻的電場刺激。打開蠕動泵和信號發(fā)生器，同時對平板電極上的細(xì)胞加載剪切力刺激和均勻的電場刺激，為細(xì)胞提供剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的生長環(huán)境。剪切力-均勻電場聯(lián)合作用細(xì)胞培養(yǎng)裝置整個循環(huán)管路放置在動物細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，保證37°C、95%相對濕度和5% CO2的培養(yǎng)條件。整個細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括循環(huán)培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)和平板流動腔安裝、拆卸方便，可消毒，消毒條件為130°C、3個大氣壓，時間1小時。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供剪切力刺激與均勻電場刺激的聯(lián)合加載方式，更有利于細(xì)胞生長和發(fā)育。剪切力與均勻電場的聯(lián)合作用可改善細(xì)胞生長環(huán)境，從而促進(jìn)細(xì)胞生長，提高細(xì)胞活性；(2)本發(fā)明的平板電極對平板電極體系，能對細(xì)胞、組織的生長提供均勻的電場刺激；(3)本發(fā)明的剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激細(xì)胞培養(yǎng)裝置能夠?qū)崿F(xiàn)對離體細(xì)胞同時加載剪切力力刺激和電場刺激，選用透明的有機(jī)玻璃、聚碳酸酯及導(dǎo)電玻璃材料，便于在培養(yǎng)過程中實(shí)時觀察，且生物相容性好、操作簡單；(4)本發(fā)明既可用于細(xì)胞、組織培養(yǎng)，也可用于細(xì)胞、組織生長研究，并且對細(xì)胞體外擴(kuò)增、細(xì)胞/支架復(fù)合物的體外構(gòu)建及功能化有積極的意義；(5)本發(fā)明操作簡單，穩(wěn)定性好，具有較好的應(yīng)用前景。


圖ι為剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激細(xì)胞培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖
圖2為平板流動腔的示意圖3平板流動腔組裝圖及部分零件示意圖,O
圖中
1-動物細(xì)胞培養(yǎng)箱2-蠕動泵3-上游儲液瓶4-下游儲液瓶
5-三通6-空氣濾器7-平板流動腔8-信號發(fā)生器
701-蓋子702-上平板電極703-下平板電極704-硅膠墊圈
705-底座706-流體入口707-流體出口
具體實(shí)施例方式如圖1所示的，本發(fā)明是一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1、蠕動泵2、上游儲液瓶3、下游儲液瓶4、三通5、空氣濾器6、平板流動腔7 和信號發(fā)生器8。其中，蠕動泵2、上游儲液瓶3、下游儲液瓶4、三通5、空氣濾器6和平板流動腔7通過若干硅膠管連接，共同構(gòu)成培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)，用于為細(xì)胞加載剪切力，提供細(xì)胞生長所需營養(yǎng)。本發(fā)明的培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)和平板流動腔7都置于動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1中，以保持適于細(xì)胞生長的溫度、濕度和PH值。培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)各部分間連接，如圖1所示，上游儲液瓶3和下游儲液瓶4之間通過三條硅膠管相連，第一條硅膠管連接有蠕動泵2，用于將下游儲液瓶4中的細(xì)胞培養(yǎng)液送到上游儲液瓶3，該硅膠管的兩端分別連接在下游儲液瓶4底部位置與上游儲液瓶3的頂部位置。第二條硅膠管用于連通兩個儲液瓶中的氣體環(huán)境，該硅膠管的兩端分別連接在下游儲液瓶4上靠近頂部的位置與上游儲液瓶3上靠近頂部的位置，同時這條硅膠管通過三通 5連接空氣濾器6，使下游儲液瓶4和上游儲液瓶3的氣體環(huán)境與動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1中氣體環(huán)境相通，防止細(xì)菌進(jìn)入。第三條硅膠管用于使上游儲液瓶3中的細(xì)胞培養(yǎng)液回流到下游儲液瓶4，該硅膠管的兩端分別連接在下游儲液瓶4的頂部，與上游儲液瓶3底部與第二條硅膠管連接端之間位置。如圖1所示，細(xì)胞培養(yǎng)液裝入下游儲液瓶4中，蠕動泵2為下游儲液瓶4中的細(xì)胞培養(yǎng)液流到上游儲液瓶3提供動力，在上游儲液瓶3中細(xì)胞培養(yǎng)液的水平面到達(dá)與下游儲液瓶4所連接的第三條硅膠管的位置時，細(xì)胞培養(yǎng)液才回流到下游儲液瓶4中。上游儲液瓶3和下游儲液瓶4的材質(zhì)可為玻璃、塑料、聚碳酸酯。如圖1所示的動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1用于提供細(xì)胞生長所需的溫度、濕度和二氧化碳環(huán)境，動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1兩側(cè)分別有一個與外界相通的孔道，用于通過信號發(fā)生器8的電極線和蠕動泵2的電源線。動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1兩側(cè)的孔道與電極線、電源線連接處是密封的。如圖1所示的信號發(fā)生器8的正極和負(fù)極通過電極線與平板流動腔7相連接。平板流動腔7如圖2所示，包括蓋子701、上平板電極702、下平板電極703、硅膠墊圈704和底座705，以及一個流體入口 706和一個流體出口 707。如圖2所示的平板流動腔7是一個集剪切力刺激與均勻電場刺激為一體的平板流動腔，其上平板電極702通過電極線與信號發(fā)生器8的負(fù)極相連，下平板電極703通過電極線與信號發(fā)生器8的正極相連，流體入口 706通過硅膠管與上游儲液瓶3的底部連通，流體出口 707通過硅膠管與下游儲液瓶4頂部相連通。通過打開蠕動泵2和信號發(fā)生器8，同時對下平板電極703上的細(xì)胞加載剪切力刺激和均勻電場刺激。將接種細(xì)胞的下平板電極703放于底座705上，固定在底座705上的凹槽內(nèi)。再將硅膠墊圈704放于下平板電極703上，硅膠墊圈704圍成長方形，并與放在其上的上平板電極702，圍成流動腔。流體入口 706與流體出口 707用生物膠固定在上平板電極702的兩個圓孔上，下平板電極703和硅膠墊圈704所圍成的流動腔連通。蓋子701放置在最上面， 流體入口 706與流體出口 707從蓋子701上長槽內(nèi)通過，安裝方便。用螺絲將蓋子701和底座705固定。底座705開有的長方體槽和凹槽，可便于細(xì)胞觀察和固定下平板電極703， 蓋子701上開有的長方體槽和凹槽，可便于安裝流體入口 706和流體出口 707及固定上平板電極702。
為便于平板電極與電極線相連，上平板電極702和下平板電極703在平板流動腔 7兩側(cè)分別突出蓋子701和底座705 —部分。蓋子701、底座705以及流體入口 706、流體出口 707的材質(zhì)可為有機(jī)玻璃、聚碳酸酯。上平板電極702和下平板電極703可由導(dǎo)電玻璃組成，或者導(dǎo)電玻璃和導(dǎo)電聚合物共同組成。導(dǎo)電玻璃為摻雜氟的二氧化錫導(dǎo)電玻璃或者氧化銦錫導(dǎo)電玻璃；導(dǎo)電聚合物為聚吡咯，或者聚吡咯與聚乳酸的共聚物，或者聚吡咯與殼聚糖的共聚物，可沉積或平鋪于導(dǎo)電玻璃上。導(dǎo)電聚合物沉積時控制膜的透明度，以便于觀察細(xì)胞。剪切力可為定常流和脈動流的流體剪切力。信號發(fā)生器8可提供的電刺激可為恒定電壓、脈沖電壓、微直流電。上平板電極702和下平板電極703面積相同，位置相對，能提供均勻的電場刺激。下面提供了應(yīng)用本發(fā)明裝置的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不僅限于以下實(shí)施例。_仿丨丨1 fit刀力-J約申搬胸胞麟在無菌條件下把人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞按1 X 105/cm2密度接種在下平板電極703上， 如氧化銦錫導(dǎo)電玻璃，細(xì)胞貼壁第二天，將接種了內(nèi)皮細(xì)胞的下平板電極703固定在有機(jī)玻璃底座705凹槽上，再將硅膠墊圈704放于下平板電極703上，然后將上平板電極702放于硅膠墊片上，有機(jī)玻璃蓋子701放在最上面，將上平板電極702固定在有機(jī)玻璃蓋子701 的凹槽內(nèi)。為便于平板電極與電極線相連，上平板電極702和下平板電極703在平板流動腔7兩側(cè)分別突出蓋子701和底座705 —部分。最后用螺絲將有機(jī)玻璃蓋子701和有機(jī)玻璃底座705固定。將高壓滅菌后的上游儲液瓶3、下游儲液瓶4通過三根硅膠管如圖1所示相連。再將上游儲液瓶3通過硅膠管與流體入口 706相連，下游儲液瓶4通過根硅膠管與流體出口 707相連。在下游儲液瓶4中加入培養(yǎng)基。將連接好的裝置放入動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1中，以保證細(xì)胞生長對溫度、濕度及二氧化碳的要求。將連通下游儲液瓶4底部和上游儲液瓶3頂部的一根硅膠管放入蠕動泵2中。 分別將蠕動泵2的電源線和信號發(fā)生器8的電極線穿過動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1側(cè)面的孔接入動物細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。信號發(fā)生器8分別與上平板電極702、下平板電極703相連。打開調(diào)節(jié)好的蠕動泵2和信號發(fā)生器8的電源，使得剪切力刺激和均勻電場刺激聯(lián)合作用于內(nèi)皮細(xì)胞， 內(nèi)皮細(xì)胞在剪切力和均勻電場雙重刺激的環(huán)境下生長、發(fā)育，完成培養(yǎng)物的培育。施加的剪切力刺激為15dyne/cm2，信號發(fā)生器提供恒定電壓為200mV，聯(lián)合刺激時間為6h。^MM 2 in刀力-m^^Mm^mmm^mmMm在無菌條件下把成骨細(xì)胞按1 X 105/cm2密度接種在下平板電極703上，如沉積有導(dǎo)電聚吡咯的導(dǎo)電玻璃，細(xì)胞貼壁第二天，將接種成骨細(xì)胞的下平板電極703固定在有機(jī)玻璃底座705凹槽上，再將硅膠墊圈704放于下平板電極703上，然后將上平板電極702放于硅膠墊片上，有機(jī)玻璃蓋子701放在最上面，將上平板電極702固定在有機(jī)玻璃蓋子701 的凹槽內(nèi)。為便于平板電極與電極線相連，上平板電極702和下平板電極703在平板流動腔7兩側(cè)分別突出蓋子701和底座705 —部分。最后用螺絲將有機(jī)玻璃蓋子701和有機(jī)玻璃底座705固定。
將高壓滅菌后的下游儲液瓶4、上游儲液瓶3通過三根硅膠管如圖1所示相連。再將上游儲液瓶3通過一根硅膠管與流體入口 706相連，下游儲液瓶4通過另一根硅膠管與流體出口 707相連。在下游儲液瓶4中加入培養(yǎng)基。將連接好的裝置放入動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1中，以保證細(xì)胞生長的對溫度、濕度及二氧化碳的要求。將連通下游儲液瓶4底部和上游儲液瓶3頂部的一根硅膠管放入蠕動泵2 中。分別將蠕動泵2的電源線和信號發(fā)生器8的電極線穿過動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1側(cè)面的孔接入動物細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。信號發(fā)生器8正電極線與下平板電極703相連，負(fù)電極線與上平板電極702相連。打開調(diào)節(jié)好的蠕動泵2和信號發(fā)生器8的電源，使得剪切力刺激和電刺激聯(lián)合作用于成骨細(xì)胞，使成骨細(xì)胞在剪切力和均勻電場雙重刺激的環(huán)境下生長、發(fā)育，完成培養(yǎng)物的培育。施加的剪切力刺激為13dyne/cm2，信號發(fā)生器提供的恒定電壓為150mV，聯(lián)合刺激時間為24h。實(shí)施例3翦切力-均勻電場聯(lián)合刺激的心肌細(xì)胞培養(yǎng)在無菌條件下把1-3天齡SD大鼠乳鼠的心肌細(xì)胞按lX105/cm2密度接種在下平板電極703上，下平板電極采用如摻雜氟的二氧化錫的導(dǎo)電玻璃，預(yù)培養(yǎng)3天后，將接種心肌細(xì)胞的下平板電極703固定于聚碳酸酯底座705凹槽上，再將硅膠墊圈704放于下平板電極703上，然后上平板電極702放于硅膠墊片上，聚碳酸酯蓋子701放在最上面，將上平板電極702固定在聚碳酸酯蓋子701的凹槽內(nèi)。為便于平板電極與電極線相連，上平板電極702和下平板電極703在平板流動腔7兩側(cè)分別突出蓋子701和底座705 —部分。最后用螺絲將聚碳酸酯蓋子701和聚碳酸酯底座705固定。將高壓滅菌后的上游儲液瓶3、下游儲液瓶4通過三根硅膠管如圖1所示相連。再將上游儲液瓶3通過一根硅膠管與流體入口 706相連，下游儲液瓶4通過另一根硅膠管與流體出口 707相連。在下游儲液瓶4中加入培養(yǎng)基。將連接好的裝置放入動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1中，以保證細(xì)胞生長對溫度、濕度及二氧化碳的要求。將連通下游儲液瓶3底部和上游儲液瓶4頂部的一根硅膠管放入蠕動泵2中。 分別將蠕動泵2的電源線和信號發(fā)生器8的電極線穿過動物細(xì)胞培養(yǎng)箱1側(cè)面的孔接入動物細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。信號發(fā)生器8電極線分別與下平板電極703、上平板電極702相連。打開調(diào)節(jié)好的蠕動泵2和信號發(fā)生器8的電源，使得剪切力刺激和均勻電場刺激聯(lián)合作用于心肌細(xì)胞，使心肌細(xì)胞在剪切力和均勻電場雙重刺激的環(huán)境下生長、發(fā)育，完成培養(yǎng)物的培育。施加的剪切力刺激為lOdyne/cm2，信號發(fā)生器提供脈沖電壓，幅值為IOOmV,頻率為1Hz，脈沖寬度為10ms，聯(lián)合刺激時間為12h。上述剪切力刺激、均勻電場刺激參數(shù)的設(shè)置，材料的改變是根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞特點(diǎn)不同進(jìn)行選擇的。
權(quán)利要求
1.一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于裝置包括動物細(xì)胞培養(yǎng)箱(1)、蠕動泵O)、上游儲液瓶(3)、下游儲液瓶、三通(5)、空氣濾器(6)、平板流動腔(7)和信號發(fā)生器(8)。信號發(fā)生器(8)設(shè)置在動物細(xì)胞培養(yǎng)箱(1)外部，其余設(shè)置在動物細(xì)胞培養(yǎng)箱(1)內(nèi)部；所述的蠕動泵O)、上游儲液瓶(3)、下游儲液瓶、三通(5)和空氣濾器(6)共同構(gòu)成培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)，用于為平板流動腔(7)內(nèi)的細(xì)胞生長提供循環(huán)的細(xì)胞培養(yǎng)液從而施加剪切力；所述的信號發(fā)生器(8)有正極和負(fù)極兩個電極，正極通過電極線與平板流動腔(7)的下平板電極相連，負(fù)極通過電極線與平板流動腔(7)的上平板電極相連，為平板流動腔(7) 內(nèi)的細(xì)胞生長提供均勻電場刺激；所述的循環(huán)培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)各部分具體連接為上游儲液瓶C3)與下游儲液瓶(4)之間通過三條硅膠管連接，第一條硅膠管上連接有蠕動泵O)，硅膠管兩端分別連接在下游儲液瓶(4)的底部位置和上游儲液瓶(3)的頂部位置，下游儲液瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液在蠕動泵的作用下被輸送到上游儲液瓶(3)；第二條硅膠管的兩端分別連接在下游儲液瓶(4) 上靠近頂部的位置和上游儲液瓶C3)上靠近頂部的位置，以連通兩個儲液瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液上方的氣體環(huán)境，同時第二條硅膠管通過三通( 連接空氣濾器(6)，使得上游儲液瓶(3)、 下游儲液瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液上方氣體環(huán)境與動物細(xì)胞培養(yǎng)箱(1)中氣體環(huán)境相通；第三條硅膠管的一端連接在下游儲液瓶的頂部位置，另一端連接在上游儲液瓶C3)上的位置低于第二條硅膠管連接端，當(dāng)上游儲液瓶(3)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液的水平面到達(dá)第三條硅膠管的位置時，細(xì)胞培養(yǎng)液回流到下游儲液瓶(4)中；上游儲液瓶C3)底部通過硅膠管與平板流動腔(6)的流體入口連通；下游儲液瓶(4)頂部通過硅膠管與平板流動腔(7)的流體出口連通，形成一個細(xì)胞培養(yǎng)液循環(huán)系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述動物細(xì)胞培養(yǎng)箱(1)兩側(cè)分別有一個與外界相通的孔道，用于通過信號發(fā)生器(8) 的電極線和蠕動泵O)的電源線，所述的孔道與電極線、電源線的連接處是密封的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述平板流動腔(7)包括蓋子、上平板電極、下平板電極、硅膠墊圈、底座、流體入口和流體出口；其中，蓋子上開有長方體槽，便于安裝流體入口和流體出口，并在蓋子上開有凹槽，以便于固定上平板電極。上平板電極上兩端有兩個圓孔，分別用來固定流體入口和流體出口。底座上也開有長方體槽和凹槽，以便于觀察細(xì)胞和固定下平板電極。蓋子和底座的長邊兩側(cè)均鉆有螺孔，用于安裝螺絲以固定平行板裝置；所述底座放置在最下面，在底座的凹槽中固定下平板電極，在下平板電極上放置有長方形硅膠墊圈，硅膠墊圈上放置上平板電極，蓋子放置在上平板電極上；上平板電極、硅膠墊圈及下平板電極共同圍成流動腔；流體入口和流體出口分別用生物膠固定在上平板電極兩端的圓孔上，與所述流動腔相ο
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述平板流動腔(7)的蓋子、底座以及流體入口、流體出口的材質(zhì)為有機(jī)玻璃、聚碳酸
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述平板流動腔(7)的上平板電極和下平板電極由導(dǎo)電玻璃組成，或者由導(dǎo)電玻璃和導(dǎo)電聚合物組成；所述導(dǎo)電玻璃，為摻雜氟的二氧化錫導(dǎo)電玻璃，或者氧化銦錫導(dǎo)電玻璃；所述導(dǎo)電聚合物，為聚吡咯、或者聚吡咯與聚乳酸的共聚物、或者聚吡咯與殼聚糖的共聚物，沉積或平鋪于導(dǎo)電玻璃上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于儲液瓶的材質(zhì)為玻璃、塑料、聚碳酸酯；儲液瓶的容量在0. 2L-1. OL之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述的剪切力為定常流或者脈動流的流體剪切應(yīng)力。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述的電刺激為恒定電壓、脈沖電壓或者微直流電。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述的上平板電極和下平板電極面積、大小相同，位置相對，能提供均勻的電場刺激。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于所述剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激為剪切力刺激和均勻電場刺激同時加載。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種剪切力-均勻電場聯(lián)合刺激的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，包括動物細(xì)胞培養(yǎng)箱、蠕動泵、上游儲液瓶、下游儲液瓶、信號發(fā)生器和平板流動腔。蠕動泵、上游儲液瓶與下游儲液瓶通過硅膠管連接，構(gòu)成培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)，為細(xì)胞加載剪切力刺激；信號發(fā)生器用于為平板流動腔提供電信號，平板流動腔通過平板電極-平板電極系統(tǒng)給細(xì)胞加載均勻的電場刺激；平板流動腔，用于提供細(xì)胞生長所需基底，并通過與培養(yǎng)液灌流系統(tǒng)和信號發(fā)生器相連為平板電極上的細(xì)胞提供剪切力-均勻電場共同作用的環(huán)境。本發(fā)明建立了剪切力刺激聯(lián)合均勻電場刺激下的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)不能模擬體內(nèi)細(xì)胞處于力、電刺激共同作用環(huán)境的缺陷，為促進(jìn)細(xì)胞、組織的功能化培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12M1/42GK102533547SQ20111041886
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者劉成國, 劉李珍, 宋崴, 李萍, 樊瑜波, 賈璐 申請人:北京航空航天大學(xué)