專利名稱：一種鑒定山羊草屬殺配子染色體2C的TRAP-SCAR₅₈₅標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于殺配子染色體鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒定山羊草屬殺配子染色體 2C的標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一。在中國它是僅次于水稻的第二大農(nóng)作物，小麥生產(chǎn)對(duì)國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著十分重要的戰(zhàn)略意義。由于小麥栽培品種單一化，使其遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，抗源匱乏，極大地限制了其產(chǎn)量和品質(zhì)的進(jìn)一步改良。小麥的近緣物種中存在著大量的遺傳變異，是小麥改良可以利用的有益基因資源，將這些有益基因?qū)胄←溡恢笔沁z傳學(xué)家和育種學(xué)家經(jīng)久不衰的研究課題。創(chuàng)制易位系是把外源有益基因?qū)胄←湹囊环N有效途徑。常用的創(chuàng)制易位系的方法有自發(fā)易位、輻射誘發(fā)、利用Wi基因、染色體錯(cuò)分裂與著絲點(diǎn)再融合、組織培養(yǎng)以及利用殺配子染色體等。國內(nèi)外的研究都已證明，利用殺配子染色體誘導(dǎo)產(chǎn)生易位的頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它方法。山羊草屬植物中的一些殺配子染色體，當(dāng)單體附加到不同基因型普通小麥中時(shí)， 具有完全或不完全的殺配子作用，在不完全殺配子作用下，可高頻誘導(dǎo)各種類型的染色體結(jié)構(gòu)變異，變異頻率可達(dá)10%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自發(fā)易位、輻射誘發(fā)、Wi基因等其他方法的誘導(dǎo)效率。這些殺配子染色體是經(jīng)長期自然選擇保留下來的，有的與小麥有部分同源關(guān)系，在誘導(dǎo)染色體結(jié)構(gòu)變異中有特殊的意義。殺配子染色體不僅可誘導(dǎo)普通小麥染色體結(jié)構(gòu)變異，而且對(duì)附加或代換到普通小麥中的外源染色體也具有同樣的功能，這就為小麥的誘變育種開辟了一條新途徑。殺配子染色體起源于不同的基因組(C，S或M)，就同祖性來說，現(xiàn)已識(shí)別出三種類型的山羊草殺配子染色體同祖群2中的殺配子染色體Ae. Iongissima (2), Ae. sharonensis、Ae. cylindrical Ae. speltoides (1)禾口 Ae. speltoides (2)；同祖群 3 中的殺配子染色體Ae. triuncialis(l)和Ae. triuncialis (2)；同祖群4中的殺配子染色體 Ae. Iongissima(1)、Ae. Iongissima(3)、Ae.sharonensis(2)禾口 Ae. sharonensis(3)。殺配子染色體效應(yīng)的強(qiáng)度是多樣的，從致死到半致死，而且也受不同小麥的遺傳背景的影響，其作用特點(diǎn)、方式也各不相同。染色體2S1()，2Ssh，T2B-2Ssp'au,4Sl0,4Ssh,4Ssh#2, 在“中國春”小麥中引起不帶這些染色體的配子完全不育，因此無法傳遞給下一代。3C染色體在“中國春”中發(fā)揮很強(qiáng)的殺配子效應(yīng)，但在其它品種中卻產(chǎn)生溫和的、半致死效應(yīng)，暗示在這些栽培品種中仍存在阻遏基因。染色體T2B-2SSP "，2C，3(fAT和4Mg，在中國春中誘導(dǎo)半致死效應(yīng)的染色體斷裂，而且結(jié)構(gòu)重排的染色體可以被保留和分離。染色體3C和3Csat都起源于離果山羊草，但是它們的殺配子效應(yīng)強(qiáng)度在“中國春”中卻不相同；其中3C的效應(yīng)是致死的，而3CSAT則是半致死的。殺配子染色體2C在普通小麥“中國春”等遺傳背景下可誘導(dǎo)半致死效應(yīng)的染色體斷裂，使后代產(chǎn)生易位、缺失等染色體結(jié)構(gòu)畸變。利用殺配子染色體2C在構(gòu)建大麥染色體缺失圖譜，誘導(dǎo)小麥-偃麥草、小麥-冰草易位等方面取得了很好的成效。在殺配子染色體2C的利用過程中，雜種后代中2C染色體的鑒定是非常重要的環(huán)節(jié)。有很多學(xué)者利用分帶的方法對(duì)后代進(jìn)行鑒定，但該方法非常繁瑣，而且需要結(jié)合相關(guān)的細(xì)胞學(xué)技術(shù)。與之相比，利用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定則是十分方便快捷的途徑。靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(TRAP)是一種新型的基于PCR的分子標(biāo)記，由美國農(nóng)業(yè)部北方作物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室Hu與Vick于2003年提出，它借助大規(guī)模測序技術(shù)產(chǎn)生的許多生物的大量序列信息，利用生物信息學(xué)工具和表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag, EST)數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計(jì)引物，對(duì)目標(biāo)候選基因序列區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生多態(tài)性分子標(biāo)記，該標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的研究中，主要在種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、遺傳圖譜的構(gòu)建、繪制基因組轉(zhuǎn)錄圖譜、重要的性狀標(biāo)記、比較基因組學(xué)、親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面取得了進(jìn)展。目前，該標(biāo)記已經(jīng)在水稻、大麥、小麥、菜豆、向日葵、甜菜等植物中得到成功應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種鑒定山羊草屬殺配子染色體2C的標(biāo)記基因及其應(yīng)用，為快速、準(zhǔn)確地鑒定小麥遺傳背景下的外源山羊草屬殺配子染色體2C染色質(zhì)或染色體奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種鑒定山羊草屬殺配子染色體2C的標(biāo)記基因，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3或 SEQ. ID. NO. 6 所示。一種擴(kuò)增SEQ. ID. NO. 3所示的標(biāo)記的引物對(duì)，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2 所示。一種擴(kuò)增SEQ. ID. NO. 6所示的標(biāo)記的引物對(duì)，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5 所示。SEQ. ID. NO. 6所示的序列作為SCAR標(biāo)記應(yīng)用于小麥遺傳背景下的山羊草屬殺配子染色體2C的鑒定或跟蹤檢測。應(yīng)用于基于殺配子體系培育小麥品種的分子標(biāo)記輔助育種。所述的應(yīng)用是以SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物對(duì)待測基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對(duì)是否含有山羊草屬殺配子染色體2C進(jìn)行判定。所述的PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，57°C退火30s， 72°C延伸60s，30 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。其判定為若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中含有的目標(biāo)片段，則待測基因組中含有山羊草屬殺配子染色體2C ；若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中沒有的目標(biāo)片段，則待測基因組中沒有山羊草屬殺配子染色體2C。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明采用多個(gè)引物組合利用TRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)“中國春”小麥、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗山羊草三種材料進(jìn)行殺配子染色體2C的多態(tài)性的分析，篩選出與小麥染色體3B特異BAC庫中的62個(gè)堿基具有95%的同源性的TRAP特異性的片段，然后再將其轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記；這樣的SCAR標(biāo)記具有了殺配子染色體2C的特異性和低背景，提高了檢測的準(zhǔn)確性，非常有利于小麥遺傳背景下的殺配子染色體2C的鑒定和跟蹤檢測。與現(xiàn)有的利用分帶的方法進(jìn)行的鑒定相比，利用該SCAR標(biāo)記進(jìn)行鑒定則無疑正確率要明顯提升，而且是十分方便、快捷的。2、本發(fā)明獲得的SCAR標(biāo)記稱為SCAR585，在尾狀山羊草(Ae. caudata2n = 2x, CC) 的染色體上進(jìn)行了定位，結(jié)果顯示該標(biāo)記散布于尾狀山羊草染色體的長短臂，屬于染色體全身分布，這將為該標(biāo)記提供更加廣闊的應(yīng)用前景。利用普通小麥“中國春”、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗山羊草、二倍體長穗偃麥草材料進(jìn)行了 SCAR標(biāo)記驗(yàn)證，在“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗山羊草中擴(kuò)增出了的片段，而在普通小麥“中國春”、二倍體長穗偃麥草中沒有該產(chǎn)物，初步證明此標(biāo)記可以用于殺配子染色體2C的檢測。進(jìn)一步用該對(duì)SCAR引物對(duì)“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系與“中國春”-長穗偃麥草7E 二體附加系的雜種F1代、F2代進(jìn)行了分析，結(jié)果在全部F1代以及部分 F2代材料中擴(kuò)增出了目的片段，進(jìn)一步證明了此SCAR585標(biāo)記可以用來檢測小麥背景下的殺配子染色體2C，為小麥背景中殺配子染色體2C的快速跟蹤檢測提供了新途徑。3、所用到的SCAR標(biāo)記的檢測，使用的PCR反應(yīng)體系，不需要特殊的PCR反應(yīng)儀器和特殊的反應(yīng)試劑，與其它普通PCR反應(yīng)要求一樣；只需要在PCR擴(kuò)增之后通過電泳檢測， 就可以根據(jù)電泳結(jié)果有無大小相同的目的條帶進(jìn)行判定，操作簡單方便。4、本發(fā)明提供的山羊草屬殺配子染色體2C的標(biāo)記，通過SCAR標(biāo)記的檢測，為快速鑒定小麥遺傳背景下的殺配子染色體2C外源染色質(zhì)或染色體奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為分子標(biāo)記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑。


圖1為TRAP引物在三種不同材料中的擴(kuò)增結(jié)果，泳道1為普通小麥“中國春”，泳道2為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系，泳道3為柱穗山羊草；圖2為核苷酸序列SEQ. ID No. 3 (稱為RGA-IlR T13)，在NCBI中進(jìn)行Blast搜索的結(jié)果；圖3為SCAR585標(biāo)記在四種不同材料中的擴(kuò)增結(jié)果，泳道1為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系，泳道2為柱穗山羊草，泳道3為“中國春”，泳道4為二倍體長穗偃麥草 (Marker :DL2000)；圖4為SCAR585標(biāo)記在尾狀山羊草(Ae. caudata 2n = 2x, CC)染色體上的FISH定位結(jié)果。圖5為SCAIi585標(biāo)記在“中國春”-長穗偃麥草7E 二體附加系與“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜種后代F1I2中的擴(kuò)增結(jié)果，泳道1為普通小麥-“中國春”，泳道2 為二倍體長穗偃麥草，泳道3為柱穗山羊草，泳道4 13為“中國春”-長穗偃麥草7E 二體附加系與“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代材料，泳道14 M為 F1代自交獲得的F2代材料(Marker :DL2000)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種鑒定山羊草屬殺配子染色體2C的TRAP-SCAR585標(biāo)記及其應(yīng)用，通過TRAP-SCAR法篩選獲得特異性的TRAP片段，并轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，并對(duì)其擴(kuò)增進(jìn)行了檢測。由于采用了 TRAP-SCAR法進(jìn)行篩選，因此該標(biāo)記也可稱為TRAP-SCAIi585標(biāo)記。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)標(biāo)記的制備、擴(kuò)增和鑒定做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。所涉及的材料來源“中國春”小麥來源于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2010年4月將材料種于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)試驗(yàn)苗圃基地，2個(gè)月后提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記篩選試驗(yàn)。“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系來源于日本國家生物資源計(jì)劃小麥中心 (http//www. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp) ,2010 年 4 月將材料種于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)試驗(yàn)苗圃基地，2個(gè)月后提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記篩選試驗(yàn)。柱穗山羊草來源于日本國家生物資源計(jì)劃小麥中心，2010年1月將材料種于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種溫室，3個(gè)月后提取DNA，保存?zhèn)溆谩６扼w長穗偃麥草來源于日本國家生物資源計(jì)劃小麥中心，2010年1月將材料種于哈爾濱師范大學(xué)分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種溫室，3個(gè)月后提取DNA，保存?zhèn)溆谩?、TRAP分子標(biāo)記方法篩選特異性TRAP片段利用TRAP分子標(biāo)記方法，在普通小麥“中國春”、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系、柱穗山羊草中進(jìn)行多態(tài)性的篩選，獲得特異性片段。1. 1采用CTAB法從新鮮的不同材料幼嫩葉片中分別提取基因組DNA，并檢測DNA
濃度及質(zhì)量。1. 2TRAP 片段擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系=DNA 模板 50ng, 10 X PCR buffer 2· 0 μ 1，dNTPMix (2. 5mM) 1. 5 μ 1， 任意引物(0· 3pmol)ly 1，固定引物(IOpmol) 1 μ l，rTaq polymerase (5U/μ 1) 0· 2 μ 1，滅菌超純水補(bǔ)足至20 μ 1 ；具體的PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 權(quán)利要求
1.一種鑒定山羊草屬殺配子染色體2C的標(biāo)記基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3 或 SEQ. ID. NO. 6 所示。
2.一種擴(kuò)增SEQ. ID. NO. 3所示的標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2 所示。
3.一種擴(kuò)增SEQ. ID. NO. 6所示的標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5 所示。
4.SEQ. ID. NO. 6所示的序列作為SCAR標(biāo)記應(yīng)用于小麥遺傳背景下的山羊草屬殺配子染色體2C的鑒定或跟蹤檢測。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于基于殺配子體系培育小麥品種的分子標(biāo)記輔助育種。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的鑒定或跟蹤檢測是以SEQ.ID. NO. 4、 SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物對(duì)待測基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，對(duì)是否含有山羊草屬殺配子染色體2C進(jìn)行判定。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s, 57°C退火 30s, 72°C延伸 60s, 30 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中含有585bp的目標(biāo)片段，則待測基因組中含有山羊草屬殺配子染色體2C;若擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果當(dāng)中沒有 585bp的目標(biāo)片段，則待測基因組中沒有山羊草屬殺配子染色體2C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定山羊草屬殺配子染色體2C的TRAP-SCAR585標(biāo)記及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.6所示。通過TRAP-SCAR法篩選獲得特異性的TRAP片段，并轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，并對(duì)其擴(kuò)增進(jìn)行了檢測。本發(fā)明提供的山羊草屬殺配子染色體2C的標(biāo)記，通過SCAR標(biāo)記的檢測，為快速鑒定小麥遺傳背景下的殺配子染色體2C外源染色質(zhì)或染色體奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為分子標(biāo)記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102373289SQ20111040441
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者劉賀亮, 姜格格, 徐國輝, 束永俊, 蘇文悅, 郭長虹 申請(qǐng)人:哈爾濱師范大學(xué)