染色體特異分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于作物分子生物學(xué)與遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及希爾斯山羊草1Ss染色體的特異分子標(biāo)記的建立與應(yīng)用，堿基序列見序列表，擴(kuò)增圖譜見附圖。使用建立的希爾斯山羊草1Ss染色體特異分子標(biāo)記對雜交群體的鑒定結(jié)果與基因組原位雜交鑒定結(jié)果一致性為100%，因而，建立的分子標(biāo)記可以對小麥背景中是否含有希爾斯山羊草1Ss染色體進(jìn)行有效檢測。本發(fā)明獲得的特異分子標(biāo)記不僅可用于小麥-希爾斯山羊草雜交群體的篩選、鑒定，還可以應(yīng)用于輔助選育籽粒微量元素含量高及高品質(zhì)的小麥新品系/品種，提高篩選效率，縮短育種時間，具有積極的產(chǎn)業(yè)化價值。
【專利說明】希爾斯山羊草1 Ss染色體特異分子標(biāo)記及其應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明屬于作物分子生物學(xué)與遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及希爾斯山羊草ISs染色體特異 分子標(biāo)記的建立，還涉及所述特異分子標(biāo)記在跟蹤檢測小麥背景中希爾斯山羊草染色體方 面的應(yīng)用。
[0002]

【背景技術(shù)】 全球有超過30億的人口處在體內(nèi)缺Fe和Zn元素的"隱性饑餓"狀態(tài)下，有超過2. 5 億兒童不同程度的缺乏Fe和Zn元素（Underwood等，1998)。礦質(zhì)元素特別是微量元素缺 乏和蛋白攝入量不足將增加社會醫(yī)療保健的開支，嚴(yán)重阻礙社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。我國小麥籽 粒礦質(zhì)元素尤其是Fe和Zn元素含量還不能滿足人們的基本需求(朱展才和吳兆蘇，1991 ; 張勇等，2007)，因此，需要改良我國小麥礦質(zhì)元素含量來改善人們的營養(yǎng)狀況。通過往土壤 里施用含微量元素的肥料和選擇礦質(zhì)含量高的小麥基因型作為親本進(jìn)行育種工作，都是 可以提高小麥籽粒Fe和Zn元素含量的有效途徑。但是，在土壤偏堿性的情況下，施用微量 元素肥料也于事無補(bǔ)。施用微量元素肥料將增加投入成本并且施用過量還會對土壤造成污 染。因此，選擇礦質(zhì)元素含量高的小麥親本或培育含有微量元素高效吸收基因的小麥品種 是最為有效和經(jīng)濟(jì)的手段。小麥遠(yuǎn)緣物種部分染色體上攜帶有控制礦質(zhì)元素吸收和轉(zhuǎn)運的 基因，可以利用染色體工程的方法將小麥遠(yuǎn)緣物種中攜帶高效吸收和轉(zhuǎn)運微量元素尤其是 Fe和Zn元素的染色體或染色體片段導(dǎo)入小麥，達(dá)到有效提高小麥籽粒Fe和Zn元素含量的 目的。
[0003] 山羊草屬（Genus JegiTrOAS)包含23個物種，均是小麥的遠(yuǎn)緣物種。該屬物種的基 本基因組包括C、D、U、S、S^S'S'S'M.N和T。5個S型染色體（Sj1Jjsh和S b)和小 麥的B染色體都具有一定同源性。希爾斯山羊草Ga 染色體和擬斯卑爾脫 山羊草的S染色體都有可能是小麥B染色體的供體，這表明相比于其他 染色體，這二者可能與小麥B染色體發(fā)生重組更為容易，因此，值得在小麥育種中應(yīng)用。目 前，擬斯卑爾脫山羊草的抗病和抗逆基因已經(jīng)被應(yīng)用于小麥抗性育種工作（Cherukuri等， 2005 ;Seyfarth等，1999 ;Helguera等，2000 ;Jia等，1996)。然而，對于希爾斯山羊草的利 用還有待于進(jìn)一步加強(qiáng)。
[0004] 希爾斯山羊草，2n=14，基因組SsSs,高抗小麥葉銹病和白粉?。˙uloichik等， 2008)、高抗小麥桿銹病（Liu等，2011)以及禾谷類二叉姆（Holubec和Havlickova, 1994)、 對干旱和鹽脅迫也有較好的抗性（Nevo和Chen, 2010)。因此，該種質(zhì)中的優(yōu)異基因值得 進(jìn)一步向小麥轉(zhuǎn)移。Friebe等（1995)鑒定了一整套中國春-希爾斯山羊草附加系，為定 位優(yōu)異基因在染色體上的位置提供了研究材料。以這套附加系為工具，Garg等（2009)和 Wang等（2011)將顯者提商小麥品質(zhì)、顯者提商小麥桿粒鐵和鋒兀素的基因分別都定位在 了希爾斯山羊草ISs染色體上；Buloichik等（2008)將抗小麥白粉病基因定位在2S S染色 體上；Liu等（2011)將抗小麥桿銹病基因定位在3SS染色體上。
[0005] 小麥-外源物種附加系中除了含有小麥育種需要的優(yōu)異基因外，還含有一些控 制不利農(nóng)藝性狀的基因，因此，需要利用染色體工程方法將其誘導(dǎo)后才能應(yīng)用于小麥育 種工作。到目前為止，中國春-希爾斯山羊草3$附加系已經(jīng)被成功改造并應(yīng)用于小麥 抗軒鎊病育種工作中（Liu WX，Jin Y，Rouse M，F(xiàn)riebe B，Gill BS，and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet，2011，122:1537-1545.)。希爾斯山羊草ISs染色體的導(dǎo)入小麥不僅可 以提高籽粒鐵鋅含量，還可以提高小麥品質(zhì)，但是IS s附加系尚未被利用染色體工程方法誘 導(dǎo)?；诖?，我們開展了 ISs附加系的誘導(dǎo)工作。誘導(dǎo)群體的篩選與鑒定需要分子標(biāo)記的 輔助進(jìn)行，因此，希爾斯山羊草ISs染色體特異標(biāo)記的建立對該工作的順利開展起著重要作 用。在希爾斯山羊草染色體分子標(biāo)記建立方面，Liu等（Liu WX，Jin Y，Rouse M，F(xiàn)riebe Bj Gill BSj and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet，2011，122:1537-1545.)建立了希爾斯 山羊草3SS染色體的EST-STS標(biāo)記，用這些標(biāo)記鑒定了小麥-希爾斯山羊草易位系并定位 了來自希爾斯山羊草上的抗小麥軒銹病基因。Sun等（Sun X，Hu SL，Liu X，Qian WQ， Hao STj Zhang AM, Wang DW. Characterization of the HMW glutenin subunits from Aegilops searsii and identification of a novel variant HMW glutenin subunit. Theor Appl Genet，2006，113:631-641.)和 Garg 等（Garg M，Tanaka H，Ishikawa N， Takata K， Yanaka M， Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry, 2009， 86:26-321.)均建立了希爾斯山羊草ISs的種子蛋白標(biāo)記。待測小麥材料若種植后收獲種 子再進(jìn)行種子蛋白檢測，耗時太長而操作繁瑣。然而，能用于快速、簡便、實用且不依據(jù)待測 小麥整個生育期(材料發(fā)芽即可提取其DNA進(jìn)行檢測)的小麥背景中希爾斯山羊草IS s染色 體(或染色體片段)的PCR標(biāo)記檢測方法未見報道，因此，希爾斯山羊草ISs染色體PCR標(biāo)記 的建立，將對其誘導(dǎo)群體的篩選鑒定以及高鐵鋅含量及高品質(zhì)小麥品種選育都有很重要的 實際意義。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】
為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中沒有希爾斯山羊草ISs染色體的PCR標(biāo)記的問題，本發(fā)明提 供了一種能夠快捷、有效、簡便地鑒定待測樣本中是否含有希爾斯山羊草ISs染色體的特異 分子標(biāo)記。因此，本發(fā)明的目的是建立希爾斯山羊草IS s染色體特異分子標(biāo)記，提供一種檢 測小麥背景中希爾斯山羊草染色質(zhì)的新方法。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述希爾斯山羊草ISs染色體特異分子標(biāo)記在雜交種質(zhì)篩選與鑒 定中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明是通過以下措施得到的： 本發(fā)明所提供的檢測小麥背景中希爾斯山羊草ISs染色體的方法，是以待測希爾斯山 羊草、小麥-希爾斯山羊草ISs附加系及小麥對照基因組總DNA (表1)為模板，對EST-STS (expressed sequence tag-sequence tagged sites)、 EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeat)、SSR (simple sequence repeat)、COS (conserved orthologous set)和 PLUG (PCR-based landmark unique gene)引物進(jìn)行篩選，篩選出能 在小麥-希爾斯山羊草ISs附加系中擴(kuò)增出特異DNA條帶的引物，引物篩選的統(tǒng)計結(jié)果見 表2。進(jìn)而，用篩選出的引物對小麥-希爾斯山羊草1SS-7SS附加系、端體附加系及小麥對照 (表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得小麥-希爾斯山羊草ISs附加系和相應(yīng)端體附加系（ISsS或IS sL 端體附加系)中的能擴(kuò)增出而小麥中不能擴(kuò)增出的特異DNA條帶，獲得的這些特異DNA條帶 則來自希爾斯山羊草ISs染色體。其檢測特異擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別如表3所示。
[0009] EST-STS、COS和PLUG引物擴(kuò)增特征在于15 μ L PCR反應(yīng)體系為：25 ng/ μ L的 模板 DNA 1 μ L，5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 IOX PCRbuffer 1.5 μ?，10μΜ的上、下游引物各lyL，用無菌雙蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系 至 15μ L ; PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94°C變性45 S，57°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0010] EST-SSR引物擴(kuò)增特征在于15 μ L PCR反應(yīng)體系為：25 ng/μ L的模板DNA 1 μ L， 5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1. 5μ L，10μ M的上、下游引物各1 μ L，用無菌雙蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至15μ L ; PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94°C變性45 S，52°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0011] SSR引物擴(kuò)增特征在于15 μ L PCR反應(yīng)體系為：25 ng/μ L的模板DNA 1 μ L， 5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1. 5μ L，10μ M的上、下游引物各1 μ L，用無菌雙蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至15μ L ; PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94°C變性45S，55°C退火 45S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0012] EST-SSR，SSR和COS引物擴(kuò)增產(chǎn)物用8 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩 沖液為1XTBE。取15μ?擴(kuò)增產(chǎn)物，加入3yL指示劑(含0· 1%溴酚藍(lán)和0· 1%二甲苯青)， 混勻，上樣量3 μ L，180V恒定電壓電泳約55min。經(jīng)硝酸銀染色30 min后觀察照相。PLUG 和EST-STS引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂凝膠上電泳，電泳緩沖液為1XTAE。擴(kuò)增產(chǎn)物 IOuL在150V恒壓下電泳約25min，然后用lug/mL的溴化乙錠溶液進(jìn)行染色30min，最后在 ⑶S-Gel Dol 2000紫外凝膠成像系統(tǒng)下掃描照像。
[0013] 依據(jù)上述方法步驟，獲得一種希爾斯山羊草ISs染色體特異分子標(biāo)記，一一列舉如 下： 短臂引物對堿基序列如下： MAG2137-EST-SSR ： F :5' -GAGTTCGATGACATGGCTGA-3'，（見序列表中序列 1) R: :5' -CCGATAACAAAGTGCGTGAA-3' ；（見序列表中序列 2) 長臂引物對堿基序列如下： Xgwml35-SSR ： F :5' -TGTCAACATCGTTTTGAAAAGG-3'，（見序列表中序列 3) R :5' -ACACTGTCAACCTGGCAATG-3' ；（見序列表中序列 4) BG606586-EST-STS ： F :5' -GGAGAAGCAAGACCACTTCG-3'，（見序列表中序列 5) R :5' -ATGTCGAATTCCAGCACCTC-3' ；（見序列表中序列 6) BF604958-EST-STS ： F :5' -GCAAAAGAAGAAGGGGAAGG-3'，（見序列表中序列 7) R :5' -GGTCATGTTGGTGATGTTGG-3' ；（見序列表中序列 8) BF474878-EST-STS ： F :5' -CATGTATCTGGTGGTGAGCTTT-3'，（見序列表中序列 9) R:5' -GTTCACCTGTGCTTGCATTC-3' ；（見序列表中序列 10) 希爾斯山羊草ISs染色體特異分子標(biāo)記為上述5對引物中的一對以上的組合或者短臂 引物對與一對以上的長臂引物對的組合。
[0014] 所述的希爾斯山羊草ISs染色體特異分子標(biāo)記的應(yīng)用是使用所述的希爾斯山羊草 ISs染色體特異分子標(biāo)記對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對小麥背景中是否含有希爾斯山羊草 ISs染色體進(jìn)行檢測或輔助檢測。
[0015] 檢測或輔助檢測步驟如下： (1) 以待測的可能含有希爾斯山羊草ISs染色體（或染色體片段）的小麥背景系的基 因組總DNA為模板，希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草ISs附加系為陽性對照，以中國春 小麥和其他4個不同小麥品種/品系為陰性對照，用權(quán)利要求1所述的希爾斯山羊草IS s染 色體特異分子標(biāo)記分別對模板和對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果使用2%瓊脂糖凝膠或8%聚 丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度為2. 5%)電泳進(jìn)行檢測； (2) 如果待測模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中含有與陽性對照相同的特異DNA條帶而陰 性對照無該帶，則說明待測小麥背景系的基因組中含有希爾斯山羊草IS s染色體；如果待測 模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中不含有與對照相同的特異多態(tài)性DNA條帶，則說明待測小麥 背景系的基因組中不含有希爾斯山羊草IS s染色體。
[0016] 本發(fā)明的有益效果： 1、 本發(fā)明建立了希爾斯山羊草ISs染色體的新標(biāo)記，提供了使用新標(biāo)記檢測小麥背景 中希爾斯山羊草IS s染色體的新方法。因為希爾斯山羊草ISs染色體能顯著提高小麥籽粒 中微量元素 Fe和Zn含量，并且ISs的導(dǎo)入小麥可以顯著提高小麥加工品質(zhì)，因此，本發(fā)明 獲得的特異分子標(biāo)記可用于雜交群體的篩選、鑒定與輔助選育籽粒微量元素（Fe和Zn)含 量商及商品質(zhì)的小麥新品系/品種； 2、 所篩選出的特異性分子標(biāo)記，對小麥背景中是否含有希爾斯山羊草ISs染色體進(jìn)行 檢測或輔助檢測，特異性強(qiáng)，檢測準(zhǔn)確率高，提高篩選效率，縮短育種時間，具有積極的產(chǎn)業(yè) 化價值。
[0017]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1.引物MAG2137擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度為2. 5%)中的電泳 結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物MAG2137對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山 羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，B圖為引物 MAG2137對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SSB加系和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，C圖為引物MAG2137 對中國春-希爾斯山羊草IS s附加系、中國春-希爾斯山羊草ISs短臂和ISs長臂端體附加 系以及中國春的擴(kuò)增結(jié)果； 圖2.引物Xgwml35擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度為2. 5%)中的電泳 結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物Xgwml35對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山 羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，B圖為引物 Xgwml35對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SS附加系和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，C圖為引物Xgwml35 對中國春-希爾斯山羊草IS s附加系、中國春-希爾斯山羊草ISs短臂和ISs長臂端體附加 系以及中國春的擴(kuò)增結(jié)果； 圖3.引物BG606586擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶#沙1酶切后在2%的瓊脂糖凝膠中的電 泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物BG606586對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯 山羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，B圖為引物 BG606586對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SS附加系和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，C為引物BG606586 對中國春-希爾斯山羊草IS s附加系、中國春-希爾斯山羊草短臂和ISs長臂端體附加系的 擴(kuò)增結(jié)果； 圖4.引物BF604958擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶#沙1酶切后在2%的瓊脂糖中的電泳 結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物BF604958對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯 山羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，B圖為引 物BF604958對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加系和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，C圖為引物 BF604958對中國春-希爾斯山羊草ISs附加系、中國春-希爾斯山羊草ISs短臂和IS s長 臂端體附加系以及中國春的擴(kuò)增結(jié)果； 圖5.引物BF474878擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶你 el II酶切后在2%的瓊脂糖中的電 泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物BF474878對希爾斯山羊草、中國春-希爾 斯山羊草ISs附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、綿陽15和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，B圖為 引物BF474878對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加系和中國春的擴(kuò)增結(jié)果，C圖為引物 BF474878對中國春-希爾斯山羊草ISs附加系、中國春-希爾斯山羊草ISs短臂和IS s長 臂端體附加系以及中國春的擴(kuò)增結(jié)果； 圖6為引物MAG2137對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2群 體的擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳圖； 圖7為引物Xgwml35對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2群 體的擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳圖； 圖8為引物BG606586對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2群 體的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后在2%的瓊脂糖中的電泳圖； 圖9為引物BF604958對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2群 體的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后在2%的瓊脂糖中的電泳圖； 圖10為引物BF474878對中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草ISs附加系雜交F2 群體的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后在2%的瓊脂糖中的電泳圖； 圖11為基因組原位雜交鑒定分子標(biāo)記鑒定出的部分中國春IB缺體和中國春-希爾 斯山羊草ISs附加系的部分雜交F2分離群體的雜交圖譜，其中，圖AD分別為雜交后代植株 AS-17、AS-96、AS-189和AS-342的基因組原位雜交結(jié)果。

【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0019] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020] 下述實施例中，如無特殊說明，所用PCR體系方法與
【發(fā)明內(nèi)容】
部分的描述的PCR體 系及方法相同，所有引物合成均由成都瑞信生物公司完成。所用TA編號的實驗材料(表1) 全部由美國堪薩斯州立大學(xué)小麥基因組學(xué)與遺傳資源中心Gill BS教授惠贈，公眾可從美 國堪薩斯州立大學(xué)小麥基因組學(xué)與遺傳資源中心（http://www. k-state. edu/wgrc/)有償 獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0021] 下述實施例中的綿陽11小麥（MYll)和中國春（CS) (Liu C，Yang ZJ，Li GR， Zeng ZX, Zhang Y, Zhou JP, Liu ZH, Ren ZL. 2008. Isolation of a new repetitive DNA sequence from Secale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat background. 159(1-2): 249-258·);綿陽 15 (MY15) (Zhou JP, Zhang HY, Yang ZJ, Li GR, Hu LJ, Lei MP, Liu C, Zhang Y, Zhang Y, Ren ZL. 2012. Characterization of a new T2DS. 2DL-?R translocation triticale ZH-I with multiple resistances to diseases. Genet Resour Crop Evol, 59(6):1161-1168. ) 1? 電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院楊足君教授提供，公眾可從山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所獲 得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。ASl-AS384為 中國春IB缺體/中國春-希爾斯山羊草IS s附加系雜交F2群體。
[0022] 表1供試材料

【權(quán)利要求】
1. 一種希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標(biāo)記，其特征在于 短臂引物對堿基序列如下： MAG2137-EST-SSR ： F :5, -GAGTTCGATGACATGGCTGA-3，， R: :5' -CCGATAACAAAGTGCGTGAA-3' ； 長臂引物對為下述引物對中的一對以上： Xg碰135-SSR : F :5' -TGTCAACATCGTTTTGAAAAGG-3'， R:5, -ACACTGTCAACCTGGCAATG-3,； BG606586-EST-STS ： F :5, -GGAGAAGCAAGACCACTTCG-3，， R:5' -ATGTCGAATTCCAGCACCTC-3' ； BF604958-EST-STS ： F :5, -GCAAAAGAAGAAGGGGAAGG-3，， R:5' -GGTCATGTTGGTGATGTTGG-3' ； BF474878-EST-STS ： F :5' -CATGTATCTGGTGGTGAGCTTT-3'， R:5' -GTTCACCTGTGCTTGCATTC-3' ； 希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標(biāo)記為上述5對引物中的一對以上的組合或者短臂 引物對與一對以上的長臂引物對的組合。
2. -種權(quán)利要求1所述的希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于 使用權(quán)利要求1所述的希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對小麥背景 中是否含有希爾斯山羊草1SS染色體進(jìn)行檢測或輔助檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于檢測或輔助檢測步驟如下： (1) 以待測的可能含有希爾斯山羊草1^染色體或染色體片段的小麥背景系的基因組 總DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的希爾斯山羊草1SS染色體特異分子標(biāo)記分別對模板和 對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果使用凝膠電泳進(jìn)行檢測； (2) 如果待測模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中含有與陽性對照相同的特異DNA條帶而陰 性對照無該帶，則說明待測小麥背景系的基因組中含有希爾斯山羊草1^染色體；如果待測 模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中不含有與對照相同的特異多態(tài)性DNA條帶，則說明待測小麥 背景系的基因組中不含有希爾斯山羊草1SS染色體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于步驟（1)中使用希爾斯山羊草、中國春-希 爾斯山羊草1SS附加系為陽性對照，以中國春小麥和/或其他不同小麥品種/品系為陰性 對照。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于BG606586-EST-STS、BF604958-EST-STS和 BF474878-EST-STS引物對擴(kuò)增特征在于15 ii L PCR反應(yīng)體系為：25 ng/ ii L的模板DNA 1 u L, 5 U/uL Taq DNA polymerase 0? 15 ii L，200 ii M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1.5 iiL, 10iiM的上、下游引物各1 iiL,用無菌雙蒸饋水補(bǔ)充反應(yīng)體系至15iiL; PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94°C變性45 S，57°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于MAG2137-EST-SSR引物對擴(kuò)增特征在 于 15 iiL PCR 反應(yīng)體系為：25 ng/iiL 的模板 DNA liiL，5 U/iiL Taq DNA polymerase 0.15iiL，200 iiM 的 dNTPs，含 Mg2+的 10X PCRbuffer 1.5iiL，10iiM 的上、下游引物各 1 U L，用無菌雙蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至15 y L ; PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94°C變性45 S，52°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于Xgwml35-SSR引物對擴(kuò)增特征在于15 yL PCR 反應(yīng)體系為：25 ng/uL 的模板 DNA In L，5 U/uL Taq DNA polymerase 0.15 uL， 200 iiM 的 dNTPs，含 Mg2+的 10X PCRbuffer 1.5iiL，10iiM 的上、下游引物各 liiL，用無 菌雙蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至15 y L ; PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94°C變性45S，55°C退火 45S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于步驟（1)中使用2%瓊脂糖凝膠或8%的交 聯(lián)度為2. 5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104371996SQ201410666237
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】劉成, 宮文英, 劉建軍, 李根英, 宋健民, 李豪圣, 劉愛峰, 曹新有, 程敦公, 王燦國, 趙振東 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所