專利名稱：大約克豬乳腺組織的microRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物和農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大約克豬乳腺組織通過測序分析新發(fā)現(xiàn)的microRNA序列。
背景技術(shù)：
microRNA (miRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，長度約為21 25 個核苷酸。miRNA最初于1993年在秀麗線蟲中被發(fā)現(xiàn),當(dāng)時Lee等在研究線蟲發(fā)育缺陷時發(fā)現(xiàn)7i/ -4基因不編碼蛋白質(zhì)，但能時序調(diào)控秀麗線蟲胚胎后期發(fā)育的基因。然而7i/ -4 的發(fā)現(xiàn)沒能引起太大的關(guān)注，直至2000年Reinhart等在線蟲中又發(fā)現(xiàn)了第2個類似功能的miRNA hi-7基因，才漸漸掀起一股miRNA的研究熱潮。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA通過與靶基因特異性的堿基配對，抑制靶mRNA翻譯或是啟動靶mRNA降解，具有控制基因表達(dá)及細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種功能，已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)是一種重要的基因表達(dá)調(diào)控因子。豬是重要的肉品提供者，而且豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)和藥理學(xué)等方面與人類相似性極高，因此在人類健康研究中有著重要的作用，近年來已逐漸被公認(rèn)為生物醫(yī)學(xué)研究重要的模式系統(tǒng)，被廣泛地應(yīng)用于傳染病研究、藥物測試、新手術(shù)方式的練習(xí)、異體器官移植嘗試以及一些如心血管疾病和肥胖癥等的生活方式病的探索等。現(xiàn)在已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)證明miRNA在動物(包括人類)的生化活動中起著多種重要的作用。但是在豬上發(fā)現(xiàn)的miRNA還比較少,在miRBASE數(shù)據(jù)庫中收錄有人的pre_miRNA (miRNA前體)1424 條，小鼠有720條，大鼠有408條，而豬只有228條。miRNA具有物種和組織特異性，因此最近幾年豬各類組織的miRNA的研究報(bào)道越來越多，如骨骼肌、心臟、肝臟、胸腺、脂肪、腸等， 但是鮮有與豬乳腺相關(guān)miRNA的研究報(bào)道。對豬乳腺miRNA的研究不僅可以代替人類乳腺進(jìn)行乳腺研究，而且也是開發(fā)乳腺生物反應(yīng)器的理想材料。而且對豬乳腺miRNA的研究還可以幫助揭示乳腺泌乳的分子機(jī)理，從而為增加母豬泌乳量和提高仔豬生長速度提供幫助，有助于提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。大約克豬在全國各地被廣泛飼養(yǎng)和利用，在眾多外來引進(jìn)豬種中占有較大的比例，且與其他外來豬種相比泌乳力較強(qiáng)、生產(chǎn)性能較優(yōu)，所以本發(fā)明以大約克豬為研究對象，對乳腺組織進(jìn)行了 miRNA測序，并且發(fā)現(xiàn)了新的miRNA序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種大約克豬乳腺組織的 microRNAο本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明構(gòu)建大約克豬的乳腺組織 cDNA庫，通過測序技術(shù)對其進(jìn)行深度測序來獲得乳腺small RNA的序列，利用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行分析，得到大約克豬miRNA的種類和拷貝數(shù)，與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)了一些在哺乳動物未被收錄的預(yù)測miRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-90所示。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明提供的miRNA可以單獨(dú)取其中幾個進(jìn)行豬乳腺泌乳、退乳等系列活動的研究，為增加母豬泌乳量和提高仔豬生長速度提供幫助，也可與目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA—起用于定制芯片，用于乳腺活動或乳腺疾病的研究。


圖I是大約克豬乳腺組織總RNA凝膠電泳圖中Y1、Y2是大約克豬，Control是鼠總RNA。
具體實(shí)施例方式一、新 miRNA 的發(fā)現(xiàn)
I、乳腺組織采集和總RNA提取鑒定
在相同的飼養(yǎng)條件下，挑選健康的產(chǎn)后21天的大約克母豬(浙江省金華市種豬場)3頭進(jìn)行屠宰，用75%酒精對其乳房進(jìn)行消毒，取乳腺組織各3管，然后迅速投入液氮，回到實(shí)驗(yàn)室后_80°C保存。按照Animal Tissue RNA Purification Kit (LC Sciences, USA)說明提取總 RNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測其完整性(圖1)，可以看到28S和18S兩條rRNA條帶，取2yL RNA水溶液在紫外可見分光光度計(jì)上測定0D260和0D280值，比值在2. (Γ2. 2范圍內(nèi)，說明提取的RNA質(zhì)量較好。2、小RNA cDNA文庫構(gòu)建
按照 Small RNA Sample Prep Kit 說明(Illumina,protocol version 1004239_RevA, March 2008)，取10 μ g的總RNA混樣來構(gòu)建文庫，過程具體如下從15% TBE-尿素-聚丙烯酰胺凝膠中分離含有15-50 bp RNA的凝膠小塊，再經(jīng)洗脫液洗脫和酒精沉淀得到純化的小RNA片段；用T4 RNA連接酶(Promega )在純化好的15-50 bp的小RNA片段5’和 3’端分別加上SRA 5，adapter和SRA 3，adapter (Illumina),再經(jīng)洗脫和酒精沉淀得到 64-99 bp的小RNA片段；使用M-MLV ( Invitrogen )逆轉(zhuǎn)錄酶將上步中的小RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用DNA聚合酶(Invitrogen )將cDNA進(jìn)行20個循環(huán)的PCR擴(kuò)增。上游引物為MT GAT ACG GCG ACC ACC GAC AGG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA，下游引物為 CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA。反應(yīng)體系共 50 μ L，具體為ddH20 20. 5 μ L, 5 XPhusion H-F buffer 10 μ L，dNTP(各 2. 5mM) 5.0yL，引物(25 uM stock)各 2· 0 μ L，cDNA 10. O μ L, Phusion 酶(2U/μ I) O. 5 μ L。反應(yīng)條件為98 °C 30s, 98 °C 10s, 60 °C 30s, 72 °C 15s, 72°C 7min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，從12%的TBE-聚丙烯酰胺凝膠中分離純化出長度為 80-115 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物經(jīng)洗脫液洗脫和酒精沉淀得到純化的cDNA片段， 用 Picogreen dsDNA 定量試劑(Invitrogen)在 Nanodrop ( Thermo Scientific )和 TBS-380 mini-fluorometer ( Turner Biosystems )儀上檢測其質(zhì)量。最后調(diào)整 cDNA 濃度為IOnM,使用Illumina Genome Analyzer IIx分別對兩個cDNA文庫進(jìn)行高通量深度測序。3、miRNAs的生物信息學(xué)分析
通過高通量深度測序得到了初始序列19，898，648條，根據(jù)miRBase 16. O對哺乳動物 miRNA的定義標(biāo)準(zhǔn)，對這些初始序列進(jìn)行篩選，篩除序列接頭、單種核苷酸序列超過80%的、 含兩個及以上不確定核苷酸的、長度小于15個核苷酸的、拷貝數(shù)小于3的等不符合條件的，也篩除已知的RNA序列，如NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的mRNA、Rfam數(shù)據(jù)庫中收錄的其他非miRNA 的非編碼RNA和在Repbase數(shù)據(jù)庫中收錄的重復(fù)序列片段等。經(jīng)過這些標(biāo)準(zhǔn)篩選后，大約克豬12，951，743條初始序列(65%)被篩除，剩余9，946，905條(35%)比對序列。把篩選后的序列通過NCBI Local BLAST定位到豬基因組上，定位過程主要包括以下幾個步驟(I)將序列與miRBASE 16. O中的豬miRNA和pre-miRNA (miRNA前體)以及其他22種哺乳動物的miRNA和pre-miRNA進(jìn)行比對；(2)將第一步中能比對上的序列與 Ensembl豬基因組數(shù)據(jù)庫比對；(3)應(yīng)用UNAFold對第一步中不能比對上的序列進(jìn)行發(fā)夾結(jié)構(gòu)預(yù)測。最終得到90個尚未收錄于miRBASE數(shù)據(jù)庫的預(yù)測的miRNA，命名為SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 90。二、新發(fā)現(xiàn)miRNA的應(yīng)用
大約克豬上新發(fā)現(xiàn)的miRNA可與已發(fā)現(xiàn)的豬的miRNA —起構(gòu)建miRNA芯片,來研究豬發(fā)育、生長或疾病狀態(tài)下miRNA的表達(dá)變化，有助于理解其背后的分子機(jī)理，從而為豬的經(jīng)濟(jì)價值，節(jié)約養(yǎng)殖成本等提供幫助。對于在人和豬上都有檢測到的miRNA，可以將豬作為模式動物，來研究這些miRNA在人體內(nèi)的作用，從而為人類健康做出貢獻(xiàn)。預(yù)測的miRNA通過 RAKE檢測就可以證實(shí)為新的miRNA，并上傳miRBASE數(shù)據(jù)庫，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。就以下將結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例USEQ ID NO 90的靶標(biāo)預(yù)測
用TargetScan軟件對該序列進(jìn)行靶基因預(yù)測，由于該軟件中不含有豬的信息，所以用人類mRNA與miRNA之間的互作來預(yù)測相應(yīng)的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 111個靶點(diǎn)，分布在95個靶基因上?；贙EGG數(shù)據(jù)庫中基因的功能注釋，利用DAVID生物信息學(xué)資源對這些靶基因所參與的代謝途徑進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)靶基因主要參與了 fct信號通路、結(jié)腸直腸癌、基底細(xì)胞癌、腫瘤信號通路、B細(xì)胞受體信號通路、調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架、T細(xì)胞受體信號通路、軸突導(dǎo)向、天然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性、背腹軸的形成等過程。因此，可以將豬作為實(shí)驗(yàn)動物， 研究miRNA SEQ ID NO 90在人類癌癥發(fā)生和信號傳導(dǎo)過程中的作用，從而為人類健康服務(wù)。
權(quán)利要求
1.一種大約克豬乳腺組織的microRNA，其特征在于，它的核苷酸序列為SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 90中任意一個所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大約克豬乳腺組織的microRNA，本發(fā)明通過測序技術(shù)對大約克豬乳腺組織進(jìn)行深度測序來獲得乳腺smallRNA的序列，利用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行分析，得到大約克豬miRNA的種類和拷貝數(shù)，得到一些在哺乳動物未被收錄的預(yù)測miRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:1-90所示；本發(fā)明提供的miRNA可以單獨(dú)取其中幾個進(jìn)行豬乳腺泌乳、退乳等系列活動的研究，為增加母豬泌乳量和提高仔豬生長速度提供幫助，也可與目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA一起用于定制芯片，用于乳腺活動或乳腺疾病的研究。
文檔編號C12N15/113GK102586248SQ20111038581
公開日2012年7月18日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者張立凡, 徐寧迎, 沈一飛, 王穎 申請人:浙江大學(xué)