專利名稱：三種芒果象甲快速鑒定的特異性引物及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于應用生物技術領域，具體地說涉及應用于危害芒果果實的三種象甲的分子鑒定的特異引物及其快速鑒定方法。
背景技術：
芒果在我國種植已有幾百年的歷史，近年來，芒果種植業(yè)迅速發(fā)展，已在云南、海南、廣西、廣東、福建等地大面積種植，成為熱帶的主要水果之一，同時也可作為城市綠化的主要樹種。芒果象甲類Mernochetus spp.是芒果生產(chǎn)栽培中危險性的害蟲。芒果象甲隸屬于鞘翅目Coleoptera，象蟲科Curculionidae,隱喙象亞科Cryptorhynchinae, 洞腹象屬Mernochetus。該屬有3種象甲可危害果，其中危害果核的有芒果果核象甲 (S. mangiferae Fabricius)和芒果果實象甲(S. olivieri Faust)；危害果肉的有芒果果肉象甲(S. frigidus Fabricius)，它們都是芒果的主要害蟲，已被我國列為對外進境植物檢疫二類危險性的害蟲，能使芒果被害率達30-80%，嚴重影響了芒果的產(chǎn)量和品質。隨著我國對外貿易交往日益頻繁，芒果象甲隨水果進入的機率大大增加，為防止其對芒果產(chǎn)業(yè)再次造成巨大的經(jīng)濟損失，有效地避免芒果象甲隨入境果進入傳播、擴散和危害，加強對三種象甲的識別鑒定與檢疫尤為重要。目前，對芒果象甲的鑒定主要從體形大小、觸角形態(tài)及構造、前胸背板中隆線的明顯與否、鞘翅斜帶的寬窄、奇數(shù)行間鱗片瘤的大小和有無等特征為依據(jù)。但傳統(tǒng)的方法很難對芒果象甲的幼蟲或殘缺個體進行鑒別。近年來分子生物學技術發(fā)展迅速，基于PCR技術的分子鑒定為物種的鑒定提供了新的手段，彌補了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的諸多不足。利用分子標記鑒定物種已有不少的嘗試，如Ward等Q005)完成了對澳大利亞207種魚類的分子編碼，同年，Ball和Hebert Q005)嘗試用分子條碼鑒定70多種水生昆蟲蜉蝣(蜉蝣目， Ephemeroptera)。PCR技術以生物基因組DNA為檢測依據(jù)，具有檢測周期短和不受靶物種的形態(tài)、性狀等方面影響的優(yōu)點，非常適合芒果象甲等一些檢疫性害蟲未成熟蟲態(tài)的快速檢疫鑒定。本文通過對三種芒果象甲基因序列的分析，設計并篩選出了能特異性擴增三種芒果象甲基因片段的引物，完成了對三種芒果象甲的PCR快速準確鑒定。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對從形態(tài)上難以鑒定的三種芒果象甲，利用分子標記手段，分別設計三種象甲的特異性引物，創(chuàng)建了高度準確可靠、易于操作的芒果象甲的檢測和快速鑒定方法。該方法可以直接應用于生產(chǎn)實踐，對于芒果象甲的鑒定和檢疫具有十分重要的
眉、ο本發(fā)明的技術方案如下1.提取三種芒果象甲的基因組DNA，利用 hternal Transcribed Spacer Regions I(ITSl)通用引物進行PCR擴增，通過克隆測序得到三種芒果象甲的ITSl序列。2.對獲得的三種芒果象甲的序列進行比對分析，分別找到三種芒果象甲的特異區(qū)域，利用Oligo 6.0軟件，在這些區(qū)域設計三種芒果象甲的特異引物。3.對新設計的特異引物進行溫度、Mg2+等條件的優(yōu)化，使之能更加準確的擴增出目的片段。從而達到快速，準確鑒定三種芒果象甲的目的。4.對擴增出的目的片段進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNA Marker-DL2000檢測 PCR片段大小。5.鑒定結果的判斷根據(jù)電泳顯示的PCR擴增片段的大小來判斷，若有明顯清晰的370bp左右的條帶，則可判斷為是芒果果肉象甲，若條帶為790bp左右的為芒果果核象甲，若條帶為210bp左右的則為芒果果實象甲。本發(fā)明的效果是結合PCR技術手段的鑒定方法，可以給非傳統(tǒng)分類的專業(yè)人士， 提供準確快速鑒定三種芒果象甲的技術，從而為芒果象甲的防治以及檢疫做出貢獻。


圖1為用SF-F/SF-R特異性引物鑒別芒果果肉象甲結果，其中M為DNA Marker, XI，X2，X3 為芒果果肉象甲 S. frigidus X4，X5，X6 為芒果果核象甲 S. mangiferae ；X7, X8， X9為芒果果實象甲S. Olivieri0圖2為用S0-F/S0-R特異性引物鑒別芒果果實象甲結果，其中M為DNA Marker, XI，X2，X3 為芒果果肉象甲 S. frigidus ；X4, X5，X6 為芒果果核象甲 S. mangi ferae ；X7, X8， X9為芒果果實象甲S. Olivieri0圖3為用SM-F/SM-R特異性引物鑒別芒果果核象甲結果，其中M為DNA Marker, XI，X2，X3 為芒果果肉象甲 S. frigidus ；X4, X5，X6 為芒果果核象甲 S. mangi ferae ；X7, X8， X9為芒果果實象甲S. Olivieri0
具體實施例方式1.三種芒果象甲基因組DNA的提取，按經(jīng)典的酚氯仿方法提取，最后加50μ L滅菌的去離子水稀釋DNA。2. PCR反應體系與擴增條件芒果果肉象甲15yL體系IyLDNA 溶液，1.5yL 10 X Buffer, 0. 7 μ L Mg2+(25mmol/L)，1· 2 μ L 10mmol/L dNTP 混合液，引物(10 μ mol/L)各 0. 2 μ L，Pfu DNA 聚合酶(5U/y L, TaKaRa) 0. 15 μ L, DdH209. 65 μ L。反應條件為95°C 變性 5min ；95 °C 20s, 50. 9V 40s, 72°C 40s, 35 個循環(huán)后 72°C保溫 7min。芒果果實象甲15yL體系2 μ LDNA 溶液，1.5yL 10 X Buffer, 0. 9 μ L Mg2+(25mmol/L)，1· 2 μ L 10mmol/L dNTP 混合液，引物(10 μ mol/L)各 0. 25 μ L, Pfu DNA 聚合酶(5U/y L, TaKaRa) 0· 2 μ L，DdH208. 7 μ L。反應條件為；95°C 變性 5min ；95 °C 20s, 55. 6°C 40s, 72°C 40s, 40 個循環(huán)后 72°C保溫 7min。芒果果核象甲15yL體系IyLDNA 溶液，1.5yL 10XBuffer, 1. 2 μ LMg2+ (25mmol/L), 1. 6 μ L lOmmol/L dNTP 混合液，引物(10 μ mol/L)各 0.4yL，Pfu DNA 聚合酶(5U/ μ L, TaKaRa) 0. 5 μ L, BSA 0. 5 μ L，DdH2O 7. 9 μ L。PCR 擴增反應條件95°C變性 5min ；95°C 30s, 45. 2°C 40s, 72°C lmin, 31 個循環(huán)后 72°C保溫 IOmin。
3. PCR反應的電泳檢測取上述反應液5 μ 1與1 μ 1載樣緩沖液混合，用1. 2%的瓊脂糖進行電泳，EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)進行拍攝檢測。4.鑒定結果的判斷根據(jù)電泳顯示的PCR擴增片段的大小來判斷，若有明顯清晰的370bp左右的條帶，則可判斷為是芒果果肉象甲，若條帶為790bp左右的為芒果果核象甲，若條帶為210bp左右的則為芒果果實象甲。
權利要求
1.用于芒果果肉象甲、芒果果核象甲和芒果果實象甲快速鑒定的三對特異性引物分別為SF-F :TACCCGTGTGTTCGTCGT 和 SF-R :GCTGTCGTATTATGTGTG ； SM-F :GCGGTGGCTAATGGATAA 和 SM-R :GGTTGGTCGTAAAGAGGC ； SO-F :CGGCGGCGTAAACGGCAA 和 SO-R :TTCTCCCTCTCACACACA ； 三對特異性引物，其預擴增片段大小分別為375bp、796bp和210bp。
2.三種芒果象甲的鑒定方法，步驟包括(1)三種芒果象甲基因組DNA的提取，按經(jīng)典的酚氯仿方法提取，最后用50μ L滅菌的去離子水稀釋DNA ；(2)用引物SF-F/SF-R、SM-F/SM-R和S0-F/S0-R分別進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；(3)將PCR反應產(chǎn)物進行電泳分析；(4)鑒定結果的判斷根據(jù)電泳顯示的PCR擴增片段的大小米判斷，若有明顯清晰的 370bp左右的條帶，則可判斷為是芒果果肉象甲，若條帶為790bp左右的為芒果果核象甲， 若條帶為210bp左右的則為芒果果實象甲。
全文摘要
本發(fā)明屬于應用生物技術領域，本發(fā)明針對三種形態(tài)相似的危險性害蟲-芒果象甲，提供了一套快速鑒定的專用引物及其使用方法。本發(fā)明設計的三對特異性引物可以分別用來鑒定三種芒果象甲，本發(fā)明針對于不同的芒果象甲設計不同的特異性引物，能準確而快速地鑒別三種芒果象甲，該方法操作簡便快捷，具有廣泛的適用性。本發(fā)明為芒果象甲的防治與檢疫提供了重要的參考依據(jù)，具有重要的理論意義和實用價值。
文檔編號C12N15/11GK102409097SQ20111037913
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權日2011年11月25日
發(fā)明者張方平, 彭正強, 牛黎明, 符悅冠, 胡好遠, 韓冬銀, 馬叢林, 馬光昌, 黃武仁 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所