專利名稱：一種在畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法。
背景技術(shù)：
過敏性疾病是人類重大疾病之一。其發(fā)病率目前估計約占世界人口的30 40 %， 而且正以每年大于的速度增加，以兒童患者的發(fā)病率上升最為明顯。在過去幾十年，過敏性疾病的發(fā)生率在全球有顯著和迅速的增加，西方國家比發(fā)展中國家多，城市比農(nóng)村地區(qū)多。目前治療過敏性疾病的方法主要體現(xiàn)在減輕癥狀?；颊呓?jīng)常服用一些抗組胺類以及類固醇藥物以緩解癥狀，然后這些藥物并不能抑制IgE抗體的產(chǎn)生并經(jīng)常帶來副作用。近年來特異性免疫治療(脫敏治療)在過敏性疾病中的作用得到了肯定，被認為是當前過敏性疾病唯一的對因治療方法。該療法是在確定患者的過敏原后，對患者給予由低到高劑量的過敏原治療。通過反復給藥誘導其對此過敏原的耐受性，當再次接觸此類過敏原時就不產(chǎn)生或減輕過敏反應。然而，用于治療的過敏原提取物是從天然來源分離得到的蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)成分的粗混合物，過敏原提取物或者含有大量與過敏原無關(guān)的成分，或者幾乎不含有造成患者高敏感性的過敏原。所有對一種特定的過敏反應提取物敏感的患者接受含全部提取物成分相同的復雜混合物的治療，有可能導致副作用的產(chǎn)生。同樣對過敏診斷而言，這種使用整個過敏反應提取物來進行皮膚測試和血清檢測妨礙了導致患者敏感的特殊過敏原的檢測。針對這些缺點，許多研究人員采用生物化學分離和純化技術(shù)的方法得到單獨的過敏原。然而， 盡管這個方法對于過敏原的鑒定可能有效，但卻不足以制備工業(yè)規(guī)模上的過敏原。因為這個過程極其耗費人力，并且從昂貴的自然資源中純化出過敏原產(chǎn)量通常情況下都很低?；谶@些原因，用于合成過敏原蛋白質(zhì)的重組DNA技術(shù)引起了人們的注意。利用可生長在大發(fā)酵罐的微生物表達系統(tǒng)可以大規(guī)模獲得重組過敏原。因此，這些技術(shù)使得重組過敏原以一致純度大量生產(chǎn)。除此以外，使用重組DNA技術(shù)可以表達抗原表位片斷或修飾的過敏原以方便應用于過敏性疾病的診斷或處理。早在上世紀60年代，就有蟑螂引起哮喘的報道。但直到近年來，蟑螂在哮喘發(fā)病中的作用才逐漸受到人們的關(guān)注。資料顯示，美國哮喘患者中蟑螂過敏的發(fā)生率達到 27. 5 42 %，歐洲為3. 9 5 %，非洲為30 44. 6 %，在我國，北京、上海等大城市中兒童哮喘患者的蟑螂過敏率也高達27. 8 43. 8 %。哮喘發(fā)病率的不斷升高，在很大程度上與蟑螂污染加劇有關(guān)，蟑螂已經(jīng)成為僅次于塵螨的第二大室內(nèi)過敏源。目前常見的美洲大蠊和德國小蠊過敏原已經(jīng)被鑒定出來。德國小蠊為我國長江中下游地區(qū)主要的過敏源。近年來研究表明德國小蠊提取物1)可直接誘導支氣管上皮細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9和IL-8 的表達和釋放，導致支氣管哮喘的發(fā)生；2)可誘導嗜酸性粒細胞活化，使其釋放細胞毒性炎癥介質(zhì)，引起組織過敏反應，介導氣道炎癥；3)可增加人氣道上皮細胞中TNF-α誘導的IL-8表達。然而德國小蠊提取物成分復雜，包含多種蛋白成分和非蛋白成分，進一步研究發(fā)現(xiàn)德國小蠊提取物中的絲氨酸蛋白酶成分引起上述參與上述哮喘癥狀的產(chǎn)生。而且這些絲氨酸蛋白酶成分是通過蛋白酶激活受體介導的。然而目前德國小蠊中這些蛋白酶成分還沒有被鑒定出來。面前美洲大蠊中的蛋白酶成分已經(jīng)鑒定出來，為一種激肽釋放酶。美洲大蠊中激肽釋放酶過敏原蛋白已經(jīng)在大腸桿菌和昆蟲細胞表達系統(tǒng)中得到表達。研究表明它是美洲大蠊過敏病人中的主要過敏原蛋白。然后在大腸桿菌中的表達的激肽釋放酶過敏原蛋白因為不能完全實現(xiàn)蛋白質(zhì)的正確折疊，活性非常差，不能用于臨床診斷和治療的要求。 昆蟲細胞表達系統(tǒng)能實現(xiàn)蛋白的正確折疊和糖基化修飾，與天然蛋白相似。然后昆蟲表達系統(tǒng)成本巨大，不適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，限制它在臨床上的進一步應用。在本專利中我們根據(jù)genbank登錄的德國小蠊激肽釋放酶的基因序列設計引物，從德國小蠊中克隆出一個激肽釋放酶基因，通過大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)表達并純化出該蛋白，應用于德國小蠊過敏病人，鑒定出該激肽釋放酶為德國小蠊中主要過敏原蛋白。本發(fā)明采用現(xiàn)代生物技術(shù)，選擇畢赤酵母表達系統(tǒng)，其表達產(chǎn)物的生物學特性與天然產(chǎn)物相似，具有可糖基化、磷酸化、酰胺化和蛋白切割等后加工修飾功能，而且具有很高的克隆容量，表達產(chǎn)量高，培養(yǎng)簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，從德國小蠊中克隆出激肽釋放酶基因，構(gòu)建表達載體轉(zhuǎn)化到表達量高，易于純化以及容易適應大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的畢赤酵母中，應用德國小蠊過敏的診斷和特異性免疫治療中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種在畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法。未解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種在畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法，包括如下步驟(1)從德國小蠊組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR方法獲得德國小蠊過敏原Blagarg編碼基因；(2)將該編碼基因克隆到PGAPaA載體中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115以表達 Blagarg 胃自；(3)采用親和層析方法對Blagarg蛋白進行純化，從而到德國小蠊過敏原Blagarg 蛋白。步驟(1)中，所述的Blagarg編碼基因如SEQ ID No 1所示。步驟(1)中，所述的Blagarg編碼基因，其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No :2所示。與基因數(shù)據(jù)庫(Genbank)中收錄的德國大蠊精氨酸酯酶序列有3個位點氨基酸差異， 分別是第26位為Lys而不是數(shù)據(jù)庫的Arg。第284位為His而不是數(shù)據(jù)庫的Arg。第341 位為Glu而不是數(shù)據(jù)庫的Gly。與我們先前表達的美洲大蠊精氨酸酯酶過敏原Per a9有6 個位點的差異，分別為第45位為Thr，而不是kr。第75位為Gly，而不是Ala。第197位為His，而不是Ala。第257位為Val，而不是lie。第258位為ft~o，而不是kr。第294位為Lys，而不是Ala。步驟O)中，所述的畢赤酵母表達載體為pGAPaA。
步驟O)中，所述的畢赤酵母表達菌株為GS115。步驟(3)中，所述的親和層析方法為Nickel親和層析法。含有Blagarg編碼基因的表達菌株在10毫升YPD培養(yǎng)基中30攝氏度震蕩Q50轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)18小時，加入600毫升YPD中，30攝氏度震蕩O50轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)5天。收集上清，在20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中透析。上Nickel親和柱，用20mM Tris-HCl洗去非特異性結(jié)合蛋白，該1Tris-HCl含有 500mM NaCl 和 20mM 咪唑，之后改用 20mM Tris-HCl 洗脫，該 Tris-HCl 含有 500mM NaCl、 250mM咪唑，洗脫下的蛋白即為Blagarg蛋白。有益效果盡管genbank登記有德國小蠊精氨酸酯酶序列，但是沒有任何德國小蠊精氨酸酯酶蛋白的生產(chǎn)和活性的表達。本發(fā)明通過不同表達系統(tǒng)生產(chǎn)德國小蠊精氨酸酯酶蛋白，并鑒定出它為過敏原蛋白。并發(fā)現(xiàn)畢赤酵母表達的蛋白具有更高的特異性Ig E結(jié)合活性，并適應用于德國小蠊過敏的診斷和脫敏治療的應用。本發(fā)明方法通過畢赤酵母生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白，從而避免在大腸桿菌表達系統(tǒng)中活性不好的問題，和昆蟲細胞中表達工藝復雜，不能大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)和成本很高的缺點，并提供一種親和層析的方法，解決天然Blagarg過敏原純化工藝復雜的問題。


圖1為重組Blagarg誘導表達及其純化的SDS-PAGE圖譜。其中M 蛋白分子量標準；S 酵母誘導表達后上清。F 上Nickel柱后穿透峰；E 用20mM Tris-HCl (含有500mM NaCl，250mM咪唑，pH8. 0)洗脫下的蛋白。圖2為純化后的蛋白(Blagarg)與德國小蠊過敏病人血清和非過敏病人混合血清免疫印跡(Western blot)鑒定圖。其中1為Blagarg德國小蠊過敏病人血清免疫印跡鑒定圖。其中2為Blagarg與非過敏病人混合血清印跡鑒定圖。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 德國小蠊總RNA的提取。取人工飼養(yǎng)的凍存德國小蠊(來自江蘇省疾病控制中心)，液氮研磨，按照IOOmg/ mLTrizol試劑加入Trizol試劑。提取德國小蠊總RNA。實施例2 =PCR擴增出德國小蠊過敏原Blagarg的基因并克隆。將提取出來的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)genbank登記德國小蠊過敏原Blagarg 基因序列設計引物 5，-ATGGTGGATGCCGCAGTTCT-3 ’和 5 ’ -CAGGGAGCTCTCAATCTTGAT-3 ’，用 PCR方法(94°C預變性10分鐘后，94°C 30秒，50°C 45秒，72°C 1分鐘共35個循環(huán))擴增出 Blagarg基因，并克隆到pMD18_T載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中。涂板過夜培養(yǎng)。篩選陽性菌，抽提質(zhì)粒PCR和測序鑒定。得到德國小蠊過敏原Blagarg基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。實施例3 德國小蠊過敏原Blagarg表達質(zhì)粒的構(gòu)建。將得到的Blagarg基因通過BioI和Not I酶切位點克隆到質(zhì)粒pGAPaA中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109。篩選出陽性克隆。實施例4 酵母菌誘導表達和純化含有Blagarg編碼基因的表達菌株(陽性克隆)在10毫升酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)中30攝氏度震蕩Q50轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)18小時，加入600毫升YPD中，30攝氏度震蕩O50轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)5天。收集上清，在20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中透析。上 Nickel親和柱，用20mM iTris-HCl洗去非特異性結(jié)合蛋白，該iTris-HCl含有500mM NaCl和 20mM咪唑，之后改用20mM Tris-HCl洗脫，該Tris-HCl含有500mMNaCl、250mM咪唑，洗脫下的蛋白即為Blagarg蛋白(圖1)。實施例5 =Blagarg蛋白過敏原活性鑒定德國小蠊過敏病人血清來自于江蘇省人民醫(yī)院過敏門診，德國小蠊過敏病人通過臨床診斷，過敏原皮膚點刺實驗和過敏原血清學實驗室檢測確定。非過敏病人為臨床診斷， 過敏原皮膚點刺實驗和過敏原血清學實驗室檢測均沒有發(fā)現(xiàn)德國小蠊過敏的病人。分離到的Blagarg蛋白通過SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。與德國小蠊過敏病人(血清學實驗診斷為德國小蠊過敏III級)和6個德國小蠊過敏陰性混合血清混合血清孵育90分鐘。PBS洗膜后，再與抗人IgE (辣根過氧化物酶偶聯(lián))孵育顯色。德國小蠊過敏混合血清有染色帶出現(xiàn)。非過敏病人無信號(圖幻。這說明德國小蠊Blagarg蛋白能與德國小蠊過敏病人特異性IgE結(jié)合，而與非過敏病人IgE結(jié)合，從而鑒定出德國小蠊Blagarg蛋白為過敏原蛋白。實施例6 不同表達系統(tǒng)表達出的Blagarg蛋白的特異性IgE結(jié)合活性的比較采用直接ELISA方法分別測定畢赤酵母和大腸桿菌生產(chǎn)的Blagarg蛋白的特異性 IgE結(jié)合活性。將2種蛋白稀釋成lug/mi，高親和板每孔加入每種蛋白50ul，37度保溫1小時，洗滌3遍。用小牛血清蛋白溶液封閉池后，洗滌3遍。加入稀釋10倍后的6個德國小蠊過敏病人混合血清和6個非德國小蠊過敏病人混合血清50ul，保溫lh，洗滌3遍。每孔加1 150000的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗人IgE 50ul，37度保溫40分鐘，洗板5遍。 加入50ul四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和過氧化氫。閉光反應5分鐘，加入50ullM硫酸終止反應。 在450nm處測定OD值。德國小蠊過敏陽性混合血清和德國小蠊過敏陰性混合血清450nm 處測定OD值得差值可表示為各種蛋白的特異性IgE結(jié)合活性。結(jié)果顯示畢赤酵母表達的 Blagarg蛋白為大腸桿菌表達的Blagarg蛋白的1. 4倍。說明畢赤酵母表達的Blagarg特異性IgE結(jié)合活性優(yōu)于大腸桿菌生產(chǎn)的Blagarg蛋白，比較合適用于德國小蠊過敏的診斷和脫敏治療的應用。
權(quán)利要求
1.一種在畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)從德國小蠊組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR方法獲得德國小蠊過敏原 Blagarg編碼基因；(2)將該編碼基因克隆到pGAPaA質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化酵母表達菌株GS115以表達；(3)采用親和層析方法對Blagarg蛋白進行純化，從而到德國小蠊過敏原Blagarg蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的Blagarg編碼基因如SEQ ID No :1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的Blagarg編碼基因，其所編碼的氨基酸序列如SEQID No 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法，其特征在于步驟(3)中，所述的親和層析方法為Nickel親和層析法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的在畢赤酵母表達系統(tǒng)中生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法，其特征在于所述的Nickel親和層析具體包括如下步驟含有Blagarg編碼基因的表達菌株在10毫升酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)中30攝氏度震蕩Q50轉(zhuǎn)/分) 培養(yǎng)18小時，加入600毫升YPD中，30攝氏度震蕩Q50轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)5天；收集上清，在 20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)中透析；上Nickel親和柱，用20mM Tris-HCl洗去非特異性結(jié)合蛋白，該iTris-HCl含有500mM NaCl和20mM咪唑，之后改用20mM iTris-HCl洗脫，該 Tris-HCl含有500mM NaCl、250mM咪唑，洗脫下的蛋白即為Blagarg蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一方法所生產(chǎn)的德國小蠊過敏原Blagarg蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的德國小蠊過敏原Blagarg蛋白，其氨基酸序列如SEQID No 2所示；與基因數(shù)據(jù)庫(Genbank)中收錄的德國大蠊精氨酸酯酶序列有3個位點氨基酸差異，分別是第26位為Lys而不是數(shù)據(jù)庫的Arg ；第284位為His而不是數(shù)據(jù)庫的Arg ；第341 位為Glu而不是數(shù)據(jù)庫的Gly ；與我們先前表達的美洲大蠊精氨酸酯酶過敏原Per a9有6 個位點的差異，分別為第45位為Thr，而不是kr ；第75位為Gly，而不是Ala ；第197位為 His,而不是Ala。第257位為Val，而不是Ile ；第258位為ft~o，而不是kr ；第294位為 Lys,而不是Ala。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的德國小蠊過敏原Blagarg蛋白，其編碼基因如SEQID No 1 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白的方法從德國小蠊組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR方法獲得德國小蠊過敏原Blagarg編碼基因；將該編碼基因克隆到pGAPaA質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化酵母表達菌株GS115以表達；采用親和層析方法進行純化，從而到德國小蠊過敏原Blagarg蛋白。本發(fā)明方法通過畢赤酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)德國小蠊過敏原Blagarg蛋白，并采用一種親和層析的方法，解決Blagarg過敏原生產(chǎn)的問題。
文檔編號C12N15/81GK102505020SQ20111037815
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者何韶衡, 魏繼福 申請人:蕪湖潤敏江生物科技有限公司