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葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列的制作方法

文檔序號(hào):400117閱讀:265來源:國(guó)知局
專利名稱:葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及植物抗病、抗逆基因鑒定及基因工程技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列。
背景技術(shù)
醛類物質(zhì)是生物體內(nèi)眾多重要生理生化代謝過程中存在的具有高度活性的分子。在高鹽、缺水、寒冷、熱刺激等環(huán)境脅迫下醛類物質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生。雖然不同的醛類在分子長(zhǎng)度和烷基鏈存在差異,但由于其化學(xué)活性,都會(huì)對(duì)生物體系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用。因此清除過多的醛對(duì)于維護(hù)生物體的功能具有重要作用。植物體中存在著很多代謝途徑能將醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為活性較低的分子。其中一個(gè)很重要的途徑就是在醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)的催化下醛不可逆的氧化為相應(yīng)的羧酸。醛脫氫酶在生物體內(nèi)是以一個(gè)超級(jí)家族存在。不同的ALDH之間差異很大。ALDH基因命名委員會(huì)(AGNC)已經(jīng)建立起特別的標(biāo)準(zhǔn)來對(duì)醛脫氫酶進(jìn)行分類。根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn),如果蛋白質(zhì)的序列與以前鑒定的序列有超過40%的相似性,那么將它們歸入一個(gè)家族;如果相似性超過60%,則將它們歸入一個(gè)亞家族;如果相似性低于40%,則重新建立一個(gè)家族。迄今為止,真核生物中的ALDHs已經(jīng)被劃分為超過M個(gè)家族。而植物中的 ALDHs 存在于 14 個(gè)家族ALDH2,ALDH3, ALDH5, ALDH6, ALDH7, ALDHlO, ALDHl 1,ALDHl2,ALDH18, ALDH19, ALDH21, ALDH22, ALDH23 和 ALDH24?;蛐酒夹g(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一門新型技術(shù),其匯集了分子生物學(xué)、微電子技術(shù)、高分子化學(xué)合成技術(shù)和計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)。1991年,Mfymatrix公司運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù),對(duì)原位合成制備的DNA芯片做了首次報(bào)道,這是世界上的第1塊基因芯片。1995年,Stanford大學(xué)Brown實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了第1塊以玻璃為載體的基因微矩陣芯片,標(biāo)志著基因芯片技術(shù)進(jìn)入了廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。目前基因芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥開發(fā)與研究、疾病診斷治療、農(nóng)作物良種選育及環(huán)境保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域。近年來,隨著植物抗逆機(jī)理研究的深入,研究植物抗逆的方法也趨于完善,基因芯片因其信息量大、操作簡(jiǎn)單、可靠性好、重復(fù)性強(qiáng)以及可以反復(fù)利用等諸多特點(diǎn)。在植物抗逆過程中發(fā)揮了重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于,提供葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù),本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列,其特征在于,包括葡萄黑比諾醛脫氫酶基因ALDH2B8的編碼區(qū)序列和啟動(dòng)子序列。葡萄黑比諾醛脫氫酶基因ALDH2B8的編碼區(qū)序列如下1ATGACTATTC CTAGGATCTC ATOGCTGCTC TCTCGCTCTT TCACTTCTTC TGCTTCTTCT61 GCTTTGCTTT CTTCCATAGG GAGGAATTCA TCCCGGAGGG GOGGGATCTT TAGATATAGC
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1921AACTCAGA0GGAAGCTCCTTGTATGCTTATATAAGTAGAATCACACAAGAGAAAGAGAAA1981 GAGAAGAATT GTTTGCAGTG本發(fā)明首次研究了葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因25個(gè)序列在各種病原菌侵染,干旱、高鹽、低溫、高溫等非生物脅迫和激素誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況,從而鑒定了在幾乎各種逆境脅迫下都上調(diào)表達(dá)的ALDH2B8基因。以該核苷酸序列為基礎(chǔ),通過挖掘葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋ALDH2B8基因的上游啟動(dòng)子區(qū)域,獲得了啟動(dòng)子區(qū)域21Λ的葡萄黑比諾醛脫氫酶基因ALDH2B8的啟動(dòng)子序列,并在啟動(dòng)子區(qū)域鑒定了抗病順式作用元件box-wl,逆境脅迫元件TC-rich repearts和冷脅迫元件LTR。表明ALDH2B8基因和其啟動(dòng)子在葡萄抗病和非生物脅迫中起著重要作用。通過申請(qǐng)人的研究表明,本發(fā)明的葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列能把對(duì)生物體有毒性作用的醛類氧化成相應(yīng)的羧酸,對(duì)生物體抵抗病原菌侵染和非生物脅迫有重要作用??梢詫⑵咸押诒戎Z醛脫氫酶基因ALDH2B8的編碼區(qū)序列和啟動(dòng)子序列結(jié)合其他抗病和抗逆基因通過基因聚合技術(shù)轉(zhuǎn)入感病的葡萄品種、蘋果、小麥、番茄、水稻、玉米、大豆或油菜等植物,來提高抗病、抗干旱、抗鹽堿和抗寒等脅迫的能力。


圖1是通過分析公共葡萄芯片數(shù)據(jù)庫(kù)ArrayExpress和PLEXdb研究的葡萄醛脫氫酶在病原菌誘導(dǎo)、非生物脅迫和激素處理等條件下的表達(dá)分析圖。圖2是葡萄醛脫氫酶基因ALDH2B8的啟動(dòng)子區(qū)域的順勢(shì)元件分析圖。圖3通過分析公共葡萄芯片數(shù)據(jù)庫(kù)ArrayExpress和PLEXdb研究的葡萄醛脫氫酶基因的病原菌誘導(dǎo)表達(dá)分析圖。
圖4通過分析公共葡萄芯片數(shù)據(jù)庫(kù)ArrayExpress和PLEXdb研究的葡萄醛脫氫酶基因的非生物脅迫下表達(dá)分析圖。圖5總結(jié)葡萄醛脫氫酶基因的生物脅迫、非生物脅迫和激素處理?xiàng)l件下對(duì)葡萄醛脫氫酶基因具有明顯調(diào)節(jié)作用的處理。以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明獲得的抗病和抗各種非生物脅迫的葡萄品種黑比諾的ALDH2B8基因的編碼區(qū)和啟動(dòng)子序列的具體操作步驟如下A、以擬南芥的醛脫氫酶序列和醛脫氫酶的保守結(jié)構(gòu)域Pfam結(jié)構(gòu)域PF00171,PS00070, PS00687, K0G2450, K0G2451, K0G2453 和 K0G2456 查詢 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)和葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://WWW. genoscope. ens. fr),找到了 23個(gè)葡萄醛脫氫酶基因。然后根據(jù)醛脫氫酶國(guó)際命名組織(AGNC)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)葡萄醛脫氫酶基因進(jìn)行了命名。根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn),如果蛋白質(zhì)的序列與以前鑒定的序列有超過40%的相似性,那么將它們歸入一個(gè)家族;如果相似性超過60%,則將它們歸入一個(gè)亞家族;如果相似性低于40%,則重新建立一個(gè)家族。葡萄的醛脫氫酶基因被歸入10個(gè)家族。B、申請(qǐng)人從ArrayExpress和PLEXdb數(shù)據(jù)庫(kù)下載了葡萄Affymetrix微列陣數(shù)據(jù)。總共有17個(gè)實(shí)驗(yàn)可用于葡萄ALDH基因在各種病原菌侵染和非生物脅迫下的表達(dá)分析。圖1就是葡萄ALDH基因在各種處理下表達(dá)的Heatmap聚類分析圖。C、參見圖2,申請(qǐng)人鑒定了在幾乎所有病原菌侵染和非生物脅迫下都上調(diào)表達(dá)的ALDH2B8 基因。為了揭示其表達(dá)特性的機(jī)理,申請(qǐng)人鑒定并研究了 ALDH2B8的啟動(dòng)子。從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://WWW. genoscope. ens. fr)確定了 ALDH2B8基因的位置,然后找到了從起始密碼子開始上游21Λ的啟動(dòng)子序列。φ if A 禾1J ffi PlantCARE(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)在線程序?qū)Λ@得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了順式作用元件分析,發(fā)現(xiàn)在該序列上有很多跟植物抗逆、抗病相關(guān)的順式作用元件(圖幻,例如LTR(冷脅迫誘導(dǎo)響應(yīng)元件),TC-rich repeats (防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件),MBS (干旱脅迫響應(yīng)元件)和Boxil (病原菌侵染和損傷響應(yīng)元件)。另外啟動(dòng)子區(qū)還發(fā)現(xiàn)了大量光誘導(dǎo)響應(yīng)元件,如Β0Χ-Ι,Β0Χ4,I-box和ACE等。這些元件表明ALDH2B8基因在病原菌侵染、干旱和低溫等逆境條件下都會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá),極有可能對(duì)植物的抗病、抗逆性具有重要作用。以下是申請(qǐng)人給出的具體實(shí)施例。實(shí)施例1 葡萄醛脫氫酶基因家族基因的克隆及序列分析表1 葡萄品種黑比諾的ALDH家族基因的統(tǒng)計(jì)分析
權(quán)利要求
1.葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列,其特征在于,包括葡萄黑比諾醛脫氫酶基因ALDH2B8的編碼區(qū)序列和啟動(dòng)子序列。
2.如權(quán)利要求1所述的葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列,其特征在于,所述的葡萄黑比諾醛脫氫酶基因ALDH2B8的編碼區(qū)序列是1ATGACTATTCCTAGGATCTCATCGCTGCTCTCTCGCTCTTTCACTTCTTCTGCTTCTTCT61GCTTTGCTTTCTTCCATAGGGAGGAATTCATCCCGGAGGGGCGGGATCTTTAGATATAGC121ACTGCTGCAGTTGTTGAAGAACCAATCAATCCTTCTGTTAATGTCAATTATACTCAGCTT181TTAATCAATGGACAATTTGTGGATGCCGCAACGGGGAAAACTTTTGAGACATTGGACCCC241AGGACAGGGAATGTGATTGCCAGTGTTGCTGAAGGTGACGCAGAAGATGTTAATCGAGCT301GTCTCGGCTGCTCGCAAGGCGTTTGATGAGGGACCATGGCCTAGGATGAGTCCTTATGAG361AGATCCAAGATACTCTTGCGTTTTGCTGATTTGCTTGAAAAGCACAATGATGAGATTGCA421GCACTCGAGACTTGGGATAATGGGAAACCATTTGAACAGGCTGCAAAGGCTGAAGTACCA481TTGGTGATACGTTTGATGCGGTACTATGCGGGTTGGGCAGATAAGATTCATGGTCTCACG541GTTCCTGCTGATGGATTGCATCAAGTGCAAACCTTGCATGAACCCATTGGCGTTGCTGGA601CAGATTATCCCCTGGAATTTCCCACTTCTCATGTATGCTTGGAAGATTGGACCTGCATTA661GCATGTGGTAACACTATCGTTCTAAAGACAGCAGAGCAGACACCATTGTCTGCTTTATAT721GCATCGAAGTTATTGCATGAGGCCGGGCTTCCTCCAGGTGTTCTAAATGTGGTTTCTGGT781TATGGTCCAACTGCTGGTGCAGCACTTGCCAGCCATATGGATGTGGACAAGCTTGCTTTC841ACTGGATCAACTGCAACTGGAAAAATTGTACTTCAATTGGCTGCAAGGAGCAATCTTAAG901CCAGTGACTTTAGAGCTTGGAGGGAAATCCCCTTTCATTGTGTGTGAGGATGCTAATGTA961GATGAGGCTGTTGAGCTAGCCCACTTTGCTTTATTCTTTAATCAGGGGCAATGTTGTTGT1021GCTGGCTCCCGTACATTTGTACATGAAAGTATATACGATGAGTTTGTAGAGAAGGCGAAA1081GCACGTGCTTTAAGACGCACCGTTGGTGATCCATTCAAGGCAGGCATTGAGCAAGGCCCC1141CAGATTGATTCAGATCAATTTGAGAAGATCCTGAGATACATAAGATCTGGTGTCGAAAAT1201GGAGCCACCCTTGAAACCGGAGGTGAGAGATTTGGCAAAGAGGGCTTCTTCATTAAGCCT1261ACAGTTTTCTCTAATGTTCAGGACGGCATGTTGATAGCACAGGACGAGATATTTGGACCA1321GTGCAGTCCATCCTGAAATTCAAGGACCTTGGTGAGGTGATAAGAAGGGCAAACGCCACT1381AGTTATGGGCTGGCCGCAGGAGTCTTTACCCAGAACTTAGACACAGCCAACACCTTGACC1441CGCGCACTAAAGGTGGGCACAGTATGGATTAACTGCTTTGATGTGTTTGATGCAGCGATT1501CCTTTTGGTGGGTACAAGATGAGTGGGCATGGCAGAGAAAAGGGTATTTACAGTCTTCAA1561AACTACCTGCAAGTGAAGGCTGTTATTACTCCCTTGAAGAACCCCGCGTGGTTATAAo
3.如權(quán)利要求1所述的葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列,其特征在于,所述的葡萄黑比諾醛脫氫酶基因ALDH2B8的啟動(dòng)子序列是1CCACGCTAGGGTTATGAAAGAGGCACCTGTAATGATGTGACACTGAAACTGGGCCACGAA61ATATGACGTGGAACTGTTGTATAAATTGGAATTAGCCTTTTCCCAACTCATTCCTCCACT121TGAAGTAAGTGGGTATCTTTATCTTCTGTACCTGATGACCATTAAGAAAAAGCTTTTTTT181TTATAGCCACAGAGATTAGCAACAATTGATATTTGATATGAGGTGTCGGTCAAGCACGAG241GCAGCAGCTGCGTATAGTTTTTTCCATCTCACAAGTCCTCCTTCCCTCTTTGTCTTTTTT301ATATTCAGAAGTTAATCACACGGCACAAAATGTTAGAAGAAGAAAAAACTGATTTGATGG361TTGTTGGCAAAATGCGTGCGTTCGCAGAAAAATGGCAAGTTGCAGCATAAAAGGAAGCCT421CCCCATTGGGTAGGCCTTAGCAACTTGTCCTCGATTATAGCACCTCCTTGATTAAAGCTC481CTCCGCTCACCTTTTACTTTCTACTTCCACATTTTCCTTCGCTATCGCCGTCTGAATGGC541GACTCTTCTTTGAATTGGCTTTTATGCCAACAAAGCGCATACGTGTTAAAAAAGAAGTCA601AATTTATTAAATCCTAACTTTAATAAATATATTATTTAAAAATTATTGTCTTTGACCAAT661CGAGTATTACTTTTTTAATAAAATAATTCTTATCTTTAGTGCTGTCTTCAGATTCTTATT721TTCTGTTTTTGACATGCCTATAAAAACTTACTTTTCTAAATTTAAATTAACTTCAAATCA781TGTTTTAAATGAAGGAAACTCTTTTTGTTACACAATCATGTCACTCTAAAAATGGCAACT841CAATATGGATTATCCACTTACAACAATAAATAAGAAAAACTTTTATATTATATTATTTGA901ATATGATTACACGTGATTATATTGAGATGCCAATGAGACAGACTCACATCACTTACTTTC961ATTCAAATTTACATCAATTCTCATTCATTGTAACAAAAAAAATTAAACTATGGAATGAAC1021CCTTTATTTTATTTATTTTTAAAATATTAAATTCTATTAAAAATAAATATAATTTATTAT1081TAAATAAATATCATATATATTTATAATTTATTTTTATAAAAAATCCTATTTTGTATATAC1141ATTTAAAAAGTTAATAAAAAATCAATTAAAATAAATTTTCATTTGATATTATATATAATT1201TAGGTGGACAAGGTAAGAAAAAGTCATATCCAAACCTACCCGAAACTTATCCTAAATTTT1261AAAAGAATTTTCAAATTCATCCCAAACATGTTTATGTCCTTAAAAATTCATATCATTAAA1321CATATTTGGAAAAAAGGTTCAATATTGAATCTTTTCATATTTAATTTTTGATTTTTTTAA1381ATATAATGTTTTGATTCTTATTTAACAAAAGAAATAAACATTAAAGACTAAAAAATAATT1441GATGAATTTTAAAAAATAAAAATTAATACTTGAAAAAACTAAAAAACAAATTATTTTTTT1501TTTTGAAAGTTAGACAAAATGATGAATGAAGAAATTAGTTAAAATGAGAATAGGGATGGC1561AAATCACATTTTTAATATAAATTATTATTTAAAAAAAAAAGAAATAAAAAGTATATCCAA1621TCAATCCATTCGTGTTTTCCAAATTTGCATCCAAAAATCTCCACGAATCTCGTGCTGTCG1681ACATCTCTAGTGTGGATGACATCGCCATCATAACTTGAAAAGGAAAAAAAATACTATTAT1741TTTATTGATCGGGATAGGATTAGAATAAATAATACAGCCAGGTTGGAAAATGAATCCACA1801GTAGGAGGGGAAAAACGGATGATCCGTCGGGAAGTAGGTGGTGAATGCGTTTTCCTCTCT1861ATCGTTTTTTCAAACCGGAATGCTGAGGTGGCAGGTCAAGAGAGGGAATTCATATTCTGA1921AACTCAGACGGAAGCTCCTTGTATGCTTATATAAGTAGAATCACACAAGAGAAAGAGAAA1981GAGAAGAATTGTTTGCAGTGt)
全文摘要
本發(fā)明涉及葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列,包括葡萄黑比諾醛脫氫酶基因ALDH2B8的編碼區(qū)序列和啟動(dòng)子序列。通過申請(qǐng)人的研究表明,該葡萄品種黑比諾抗病、抗逆醛脫氫酶基因序列能把對(duì)生物體有毒性作用的醛類氧化成相應(yīng)的羧酸,對(duì)生物體抵抗病原菌侵染和非生物脅迫有重要作用??梢詫⑵咸押诒戎Z醛脫氫酶基因ALDH2B8的編碼區(qū)序列和啟動(dòng)子序列結(jié)合其他抗病和抗逆基因通過基因聚合技術(shù)轉(zhuǎn)入感病的葡萄品種、蘋果、小麥、番茄、水稻、玉米、大豆或油菜等植物,來提高抗病、抗干旱、抗鹽堿和抗寒等脅迫的能力。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102559712SQ201110368919
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者張玉成, 王西平 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)
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