專利名稱：防治人參病害的生物菌劑的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種生物菌劑，即防治人參病害的生物菌劑的制備方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，人參為五加科，屬多年生草本植物，喜陰涼、濕潤的氣候，多生長于晝夜溫差小的海拔500 1100米山地緩坡或斜坡地的針闊混交林或雜木林中，是名貴中藥材。性味甘、微苦。具有微溫、補氣、生津安神、益氣等功能。我國人工栽種人參歷史悠久， 傳統(tǒng)的人參種植是在山坡上采取仿生態(tài)的伐林栽種，給生態(tài)環(huán)境帶來了嚴重的破壞，嚴重影響了生態(tài)和社會健康、有序、高效、和諧的可持續(xù)發(fā)展?，F(xiàn)在國家非常重視中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展， 積極推進中藥產(chǎn)業(yè)化、現(xiàn)代化建設，發(fā)展非林地人參種植得到推廣，由于田間病害嚴重，造成人參減產(chǎn)已引起人們的廣泛重視，盡管化學農(nóng)藥在防病有一定的效果，但長期使用不僅能使作物產(chǎn)生耐藥性，而且還留有殘毒污染。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，是芽孢桿菌屬的一種。單個細胞0.7 0.8X2 3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6 0. 9X 1. 0 1. 5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌。可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名?；罹鷶?shù)> 250億/克。枯草芽孢桿菌不僅在飼料中應該比較廣泛，在污水處理及生物肥發(fā)酵或發(fā)酵床制作中應用也相當廣泛，是一種多功能的微生物。日本于1998年登記了枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，主要用于防治茄子和番茄灰霉病；2001年制成混合生防藥劑，葉面施用可防治蔬菜和水果的細菌及真菌病害。英國研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對導致食品腐敗的細菌、霉菌和酵母菌有一定程度的抑制作用，其中對真菌和革蘭氏陽性菌的抑制作用更強，已經(jīng)被商業(yè)化生產(chǎn)。澳大利亞研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對土傳病害具有很好的防治和增產(chǎn)作用，隨著對枯草芽孢桿菌研究開發(fā)的深入，會有更多的枯草芽孢桿菌及制劑被廣泛應用。何紅等Q003)研究證實枯草芽孢桿菌對多種植物病原真菌具有較強拮抗作用， 對辣椒、白菜、香蕉等炭疽病和蔬菜苗期立枯病具有良好的防治效果。李晶等O004)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌水劑以浸種、灌根并用的方式可防治黃瓜枯萎病，此外，對黃瓜植株還具有一定的促生作用。陳莉等O004)研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對葡萄、草莓、辣椒、番茄灰霉病菌菌絲生長具有抑制作用。顧真榮等000 研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在土壤中，可抑制水稻紋枯病病菌菌核形成。畢陽等O008)研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對甜瓜采后黑斑病和粉霉病具有抑制效果。但是枯草芽孢桿菌生物菌劑在人參病害防治機理及田間防治效果的研究更是顯見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述情況而提供一種枯草芽孢桿菌制備方法，該菌劑可以防治人參病害。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是防治人參病害的生物菌劑的制備方法，其步驟如下(1)菌種培養(yǎng)將LB培養(yǎng)基分裝于試管中，每管裝入IOml培養(yǎng)基，常規(guī)方法滅菌， 制成斜面；將枯草芽孢桿菌(常規(guī)菌種)菌種接入斜面培養(yǎng)基，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24小時；(2)種子液制備將培養(yǎng)基分裝于IOOOml三角瓶中，每瓶裝液200ml，常規(guī)方法滅菌，無菌條件下將斜面培養(yǎng)菌種接入三角瓶進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C 士 1°C，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min，恒溫培養(yǎng)18- 小時；所述培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基+2%葡萄糖；(3)種子罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的搖瓶種子液接入種子罐中進行種子擴繁培養(yǎng)；培養(yǎng)基紅糖1%+葡萄糖1%+酵母粉1%;培養(yǎng)溫度37°C，通氣起始比為1 0.5，種子罐培養(yǎng)18-M小時后，移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的菌種接入發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵；培養(yǎng)基紅糖+葡萄糖+酵母粉；培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)40-50小時，通氣起始比為1 0. 5 ；待芽孢形成率達到80%以上發(fā)酵完畢，得菌液(發(fā)酵液)。菌數(shù)濃度為2億左右/毫升的菌液。使用方法田間病害防治方法的施用濃度為107cfu/ml，施用量為1. 5L/m2，施用方式采用全株均勻噴施并配合地下灌施，在人參生長期每隔10-20天噴施一次，每個生長期 (6個月左右)至少施用3次。本發(fā)明的優(yōu)點是1、本方法生產(chǎn)操作簡單、成本低、菌體發(fā)酵完全、芽孢形成率高。 2、通過試驗研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌生物菌劑能夠抑制人參病原菌的生長，將該菌劑應用在人參種植中，起到有效防治人參病害，降低農(nóng)藥殘留的重要作用。3、本發(fā)明采用生物菌劑對生物拮抗的防病機理，實現(xiàn)枯草芽孢桿菌對人參病原菌的防治；形成與常規(guī)防治措施協(xié)調(diào)應用的病害生物防治技術(shù)，降低農(nóng)藥使用量，解決農(nóng)藥過量施用造成人參農(nóng)殘、重金屬超標問題，保護土壤及環(huán)境不受污染，實現(xiàn)人參產(chǎn)品的生態(tài)種植，無公害生產(chǎn)。4、本菌劑是一種低毒、污染小、效果明顯、易生產(chǎn)、使用方便的生物菌劑。5、試驗表明，枯草芽孢桿菌生物菌劑對人參的主要病害人參疫病、人參立枯病、人參黑斑病均具有一定的抑菌效果。試驗表明，枯草芽孢桿菌生物菌劑對人參的施用方式采用噴施加灌施的防治效果最好，單獨噴施的方式效果次之。下面將結(jié)合實施例、試驗例對本發(fā)明的實施方式作進一步詳細描述。
具體實施例方式實施例防治人參病害的生物菌劑的制備方法，其步驟如下1、菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。2、菌種活化培養(yǎng)(1)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基制備將LB培養(yǎng)基分裝于試管中，每管裝入IOml培養(yǎng)基，常規(guī)方法滅菌，制成斜面。將枯草芽孢桿菌菌種接入斜面培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中37°C，培養(yǎng)M小時。(2)種子液制備
將培養(yǎng)基分裝于IOOOml三角瓶中，每瓶裝液200ml，常規(guī)方法滅菌，無菌條件下將斜面培養(yǎng)菌種接入三角瓶進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，恒溫培養(yǎng)18 小時。3.種子罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的搖瓶種子液接入種子罐中進行種子擴繁培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度37°C，通氣起始比為1 0.5，種子罐培養(yǎng)18小時后，移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)。4.發(fā)酵罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的菌種接入發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵。培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)48小時，通氣起始比為1 0.5。待芽孢形成率達到80%以上發(fā)酵完畢。試驗例1枯草芽孢桿菌室內(nèi)抑菌效果測定1、本研究采用兩種實驗方法測定了枯草芽孢桿菌生物菌劑的菌懸液與發(fā)酵液對3 種人參病原菌的抑菌效果。結(jié)果證明，枯草芽孢桿菌生物菌劑對人參的主要病害人參疫病、 人參立枯病、人參黑斑病均具有一定的抑菌效果，且枯草芽孢桿菌菌懸液對人參疫病、人參黑斑病的抑菌效果強于枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，但是枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對立枯病的抑菌效果強于枯草芽孢桿菌菌懸液。取適量的菌種加入到無菌水中混勻，制成菌數(shù)濃度為IO7Cfu/ ml的菌懸液。2、實驗結(jié)果2. 1、濾紙片測定法抑菌結(jié)果從濾紙片法測定的不同處理的發(fā)酵液及菌懸液對人參3種病原菌抑菌圈結(jié)果看， 發(fā)酵液及菌懸液處理都表現(xiàn)出了對人參3種病原菌的抑制作用，但以菌懸液處理對人參疫病、人參黑斑病抑制作用強于發(fā)酵液，而發(fā)酵液對人參立枯病的抑菌效果強于菌懸液?？莶菅挎邨U菌菌懸液及發(fā)酵液的抑菌效果見表-ι表-1枯草芽孢桿菌菌懸液及發(fā)酵液對人參3種病原菌的抑菌作用
權(quán)利要求
1.一種防治人參病害的生物菌劑的制備方法，其特征在于步驟如下(1)菌種培養(yǎng)將LB培養(yǎng)基分裝于試管中，每管裝入IOml培養(yǎng)基，常規(guī)方法滅菌，制成斜面；將枯草芽孢桿菌菌種接入斜面培養(yǎng)基，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-M小時；(2)種子液制備將培養(yǎng)基分裝于IOOOml三角瓶中，每瓶裝液200ml，常規(guī)方法滅菌，無菌條件下將斜面培養(yǎng)菌種接入三角瓶進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C 士 1°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/ min，恒溫培養(yǎng)18-M小時；所述培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基+2%葡萄糖；(3)種子罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的搖瓶種子液接入種子罐中進行種子擴繁培養(yǎng)；培養(yǎng)基紅糖1%+葡萄糖1%+酵母粉1%;培養(yǎng)溫度37°C，通氣起始比為1 0.5，種子罐培養(yǎng)18-24 小時后，移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的菌種接入發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵；培養(yǎng)基紅糖+葡萄糖 1%+酵母粉；培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)40-50小時，通氣起始比為1 0. 5 ；待芽孢形成率達到80%以上發(fā)酵完畢，得菌液。
2.按照權(quán)利要求1所述的防治人參病害的生物菌劑的制備方法，其特征在于步驟如下(1)菌種培養(yǎng)將LB培養(yǎng)基分裝于試管中，每管裝入IOml培養(yǎng)基，常規(guī)方法滅菌，制成斜面；將枯草芽孢桿菌菌種接入斜面培養(yǎng)基，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)M小時；(2)種子液制備將培養(yǎng)基分裝于IOOOml三角瓶中，每瓶裝液200ml，常規(guī)方法滅菌，無菌條件下將斜面培養(yǎng)菌種接入三角瓶進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C 士 1°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/ min，恒溫培養(yǎng)18小時；所述培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基+2%葡萄糖；(3)種子罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的搖瓶種子液接入種子罐中進行種子擴繁培養(yǎng)；培養(yǎng)基紅糖1%+葡萄糖1%+酵母粉1%;培養(yǎng)溫度37°C，通氣起始比為1 0.5，種子罐培養(yǎng)18小時后，移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的菌種接入發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵；培養(yǎng)基紅糖+葡萄糖 1%+酵母粉培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)48小時，通氣起始比為1 0.5;待芽孢形成率達到 80%以上發(fā)酵完畢，得菌液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物菌劑，即防治人參病害的生物菌劑的制備方法。其步驟如下(1)菌種培養(yǎng)；(2)種子液制備；(3)種子罐培養(yǎng)；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)。使用方法田間病害防治方法的施用濃度為107cfu/ml，施用量為1.5L/m2，施用方式采用全株均勻噴施并配合地下灌施，在人參生長期每隔10-20天噴施一次，每個生長期至少施用3次。本方法生產(chǎn)操作簡單、成本低、菌體發(fā)酵完全、芽孢形成率高。試驗表明，枯草芽孢桿菌生物菌劑對人參的主要病害人參疫病、人參立枯病、人參黑斑病均具有一定的抑菌效果。
文檔編號C12R1/125GK102391965SQ20111036422
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者吳長寶, 回云靜, 徐小明, 朱峰, 李國君 申請人:吉林省集韓生物肥有限公司