專利名稱：牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)lamp檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
折光馬爾太蟲(chóng)(Marteilia refringens)對(duì)牡蠣養(yǎng)殖的危害較大，可引起貝類消瘦、消化道變色、停止生長(zhǎng)并死亡，大洋洲和歐洲等國(guó)家其感染現(xiàn)象普遍存在。折光馬爾太蟲(chóng)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有電鏡觀察、組織細(xì)胞學(xué)檢查、原位雜交等，這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，缺乏專一性，在實(shí)際工作中具有一定的局限性。目前，雖已建立起折光馬爾太蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法和熒光定量PCR檢測(cè)方法，其檢測(cè)敏感性也比較高，但是常規(guī)PCR需要使用 PCR儀和進(jìn)行凝膠電泳，熒光定量PCR則需要使用更加昂貴的熒光定量PCR儀和試劑等，，因而難以適應(yīng)基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高、儀器要求低、操作快速簡(jiǎn)便且成本低的牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒，以滿足基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)的需要。為解決上述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有以下試劑反應(yīng)液A 含有IOX等溫反應(yīng)緩存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸鎂、20uM的內(nèi)引物l、20uM的內(nèi)引物2、20uM的外引物l、20uM的外引物2、20uM的環(huán)引物 1、20碰的環(huán)引物2、511甜菜堿、6251^鈣黃綠素和12. 5mM氯化錳；IOX等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ；內(nèi)引物 1 序列為 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA，內(nèi)引物 2 序列為 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT，外引物1 序列為 GTCCGAGTGATCTTGTCAGC，外引物2 序列為 CGAGTAAGTGCATGCACAAC，環(huán)引物1 序列為 TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG，環(huán)引物2 序列為 ACCCACAACTTCGATAGCCCC。反應(yīng)液A每管M μ L，其組成為2. 5ul 10 X等溫反應(yīng)緩存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物2，lul 5M甜菜堿、Iul 625μΜ鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和2. 5ul雙蒸水。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)折光馬爾太蟲(chóng)共有的基因保守區(qū)(見(jiàn)序列表SEQ. ID. No. 1)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物、兩個(gè)特異性外引物和兩個(gè)特異性環(huán)引物，由此發(fā)明了用于快速檢測(cè)牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)的牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒。 應(yīng)用本發(fā)明的LAMP檢測(cè)試劑盒建立牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)檢測(cè)方法，僅需通過(guò)對(duì)組織樣品進(jìn)行DNA提取并進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，即可檢測(cè)出牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)。該法無(wú)需昂貴的PCR 儀只需普通水浴鍋，卻比PCR檢測(cè)有更高的靈敏度，且不必通過(guò)凝膠電泳觀察結(jié)果，操作簡(jiǎn)單而快速，特別適用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。另外，常規(guī)的LAMP方法，需要在反應(yīng)結(jié)束后開(kāi)蓋加入STOR Green I或Gene Finder染料來(lái)顯色，容易造成假陽(yáng)性一方面，反應(yīng)產(chǎn)物易形成氣溶膠而污染周圍環(huán)境造成假陽(yáng)性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料還會(huì)由于引物二聚體而引起假陽(yáng)性。因此，本發(fā)明使用內(nèi)加鈣黃綠素+氯化錳替代了外加的STOR Green I和Gene Finder 染料，即在配置LAMP反應(yīng)液時(shí)就加入反應(yīng)液中而無(wú)需LAMP反應(yīng)后再開(kāi)蓋加入；而且，鈣黃綠素+氯化錳僅在發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)才出現(xiàn)綠色，避免了 STOR Green I和Gene Finder染料帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題，所以具有更好的特異性。


圖1是應(yīng)用本發(fā)明牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果圖。圖1中1折光馬爾太蟲(chóng)，2單孢子蟲(chóng)，3副溶血弧菌，4溶藻弧菌，5派琴蟲(chóng)，6河弧菌，7貝類組織。圖2是應(yīng)用本發(fā)明牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。圖2中1-8分別為以下不同濃度的牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)DNA 20ng/管，2ng/管， 200pg/ 管，20pg/ 管，2pg/ 管，200fg/ 管，20fg/ 管，2fg/ 管。圖3是PCR方法檢測(cè)牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。圖3中M為IOObp DNA ladder, 1-8分別為以下不同濃度的牡蠣折光馬爾太蟲(chóng) DNA20ng/ 管，2ng/ 管，200pg/ 管，20pg/ 管，2pg/ 管，200fg/ 管，20fg/ 管，2fg/ 管。
具體實(shí)施例方式一、牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒的配制反應(yīng)液A 每管M μ L，其組成為2. 5ul 10 X等溫反應(yīng)緩存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM的內(nèi)引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物2，lul 5M甜菜堿、Iul 625μΜ鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和2. 5ul雙蒸水。其中，IOX等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1 %曲拉通X-100。內(nèi)引物 1 序列為 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA (見(jiàn)序列表 SEQ. ID. No. 2)，內(nèi)引物 2 序列為 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT (見(jiàn)序列表 SEQ. ID. No. 3)，外引物1 序列為 GTCCGAGTGATCTTGTCAGC(見(jiàn)序列表 SEQ. ID. No. 4)，
外引物2 序列為 CGAGTAAGTGCATGCACAAC(見(jiàn)序列表 SEQ. ID. No. 5)，環(huán)引物1 序列為 TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG(見(jiàn)序列表 SEQ. ID. No. 6)，環(huán)引物2 序列為 ACCCACAACTTCGATAGCCCC(見(jiàn)序列表 SEQ. ID. No. 7)。二、應(yīng)用本發(fā)明牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)的方法(以下簡(jiǎn)稱LAMP檢測(cè)法)1、組織樣品中DNA的提取使用北京天跟生物工程公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(商品名海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒，型號(hào)DP3M-0;3)提取組織DNA，濃度能達(dá)到20ng/ul。2、牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP反應(yīng)以提取的牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)DNA為模板，在裝有MyL反應(yīng)液A管中加入1 μ L待檢DNA構(gòu)成25ul反應(yīng)體系；LAMP反應(yīng)程序如下61°C 60min，然后80°C 5min。直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品中含有牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)；如果顏色為黃色， 說(shuō)明待檢樣品不含有牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)。三、LAMP檢測(cè)法的特異性和敏感性試驗(yàn)1.特異性試驗(yàn)分別以折光馬爾太蟲(chóng)、單孢子蟲(chóng)、副溶血弧菌、派琴蟲(chóng)、溶藻弧菌、河弧菌和貝類組織的核酸為模板，按照前述牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)圖1，對(duì)牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)的檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果(顯示綠色)，而對(duì)單孢子蟲(chóng)、 副溶血弧菌、派琴蟲(chóng)、溶藻弧菌、河弧菌和貝類組織的檢測(cè)均為陰性(顯示黃色)。2.敏感性試驗(yàn)將牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)DNA按10倍遞增稀釋成20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、 20fg、2fg。牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法檢出限與PCR對(duì)比牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)體系和條件按前述進(jìn)行。牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)PCR反應(yīng)組成如下在25ul的反應(yīng)體系中含10XPCR Buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/L dNTP 2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1，牡蠣樣品模板 DNA 1 μ L, 25 μ mol/L 的上、下游引物(上游引物為 Marteilia 1 5-TACGACCGTAGCCTTTCCAC-3 ；下游引物為 Marteilia 2 5-CGCCTCTACTCTTCTCCCAA-3)各 0. 5 μ LddH2O 補(bǔ)足 25 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性5分鐘，然后進(jìn)入94°C變性1分鐘，57°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘的循環(huán)， 共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再經(jīng)72°C延伸10分鐘。牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法通過(guò)肉眼直接觀察結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)圖2。將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行溴化乙錠染色，結(jié)果見(jiàn)圖3。牡蠣折光馬爾太蟲(chóng) LAMP檢測(cè)方法的檢測(cè)限為20fg，而常規(guī)PCR的檢測(cè)限為2pg，LAMP方法敏感性比常規(guī)PCR 高100倍。
權(quán)利要求
1.一種牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑 反應(yīng)液A 含有IOX等溫反應(yīng)緩存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸鎂、20uM的內(nèi)引物1、20uM的內(nèi)引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的環(huán)引物1、 20碰的環(huán)引物2、511甜菜堿、625 4 11鈣黃綠素和12. 5mM氯化錳；所述IOX等溫反應(yīng)緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM 硫酸鎂和曲拉通X-100 ；所述內(nèi)引物 1 序列為 CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA， 所述內(nèi)引物 2 序列為 AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT， 所述外引物1序列為GTCCGAGTGATCTTGTCAGC， 所述外引物2序列為CGAGTAAGTGCATGCACAAC， 所述環(huán)引物1序列為TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG， 所述環(huán)引物2序列為ACCCACAACTTCGATAGCCCC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)液 A每管M μ L，其組成為2. 5ul IOX等溫反應(yīng)緩存液、l.Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸鎂、0. 25ul 20uM 的內(nèi)引物 1、0. 25ul 20uM 的內(nèi)引物 2、2ul 20uM 的外引物l、2ul 2011] 的外引物2、1111 20uM的環(huán)引物1、Iul 20uM的環(huán)引物2，Iul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素和Iul 12. 5mM氯化錳和2. 5ul雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)LAMP檢測(cè)試劑盒，它采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)折光馬爾太蟲(chóng)共有的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物、兩個(gè)特異性外引物和兩個(gè)特異性環(huán)引物。應(yīng)用本發(fā)明的LAMP檢測(cè)試劑盒，僅需通過(guò)對(duì)組織樣品進(jìn)行DNA提取并進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，即可檢測(cè)出牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)，解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、交叉污染、操作復(fù)雜等缺陷，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速且成本低、操作方法更簡(jiǎn)單，特別適于基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)牡蠣折光馬爾太蟲(chóng)的需要。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559867SQ20111035651
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者劉加波, 龐耀珊, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所