專利名稱：過山蕨的應(yīng)用以及一種肝功修正茶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及過山蕨的應(yīng)用以及一種肝功修正茶。
技術(shù)背景
肝損傷是臨床常見的危害人類健康的疾病。肝損傷就是肝臟受到外界因素的入侵，從而引起的肝臟受損。肝損傷分為病理性肝損傷和化學(xué)性肝損傷?；瘜W(xué)性肝損傷是指包括藥物、毒物在內(nèi)的多種因素引起的肝損傷；而病理性肝損傷主要包括甲、乙、丙、丁、戊五種病毒性肝炎引起的肝損傷和肝癌等引起的肝損傷；肝損傷發(fā)生通常會(huì)引發(fā)肝功能失常， 還會(huì)導(dǎo)致肝纖維化，甚至肝硬化、肝癌的發(fā)生。
肝損傷過程大多與氧化應(yīng)激和免疫有關(guān)，其能誘導(dǎo)肝細(xì)胞生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，干擾細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，活化細(xì)胞死亡程序等，最終以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高以及肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β KTGF-β 1)、組織金屬蛋白酶抑制物 (TIMP-I)、層粘蛋白(LN)、及1-3型膠原(Col-I、Col-II, Col-III)等的含量增高為表現(xiàn)， 形成不同程度的肝功能失常。
中藥具有明顯的保肝護(hù)肝作用，無論是中藥化學(xué)成分還是中藥復(fù)方多是通過調(diào)節(jié)免疫、提高抗氧化能力、降低組織細(xì)胞中自由基等維護(hù)肝細(xì)胞膜完整、減緩肝細(xì)胞凋亡， 從而保護(hù)肝臟免受損傷。過山蕨，又名馬蹬草、還陽草、過橋草，為鐵角蕨科植物過山蕨 (Camptosorus sibiricus Rupr)的地上全草，主產(chǎn)于東北、華北、西北、內(nèi)蒙古等地，歷代本草未見有關(guān)其藥用記載，民間用于治療外傷出血、子宮出血、血栓閉塞性脈管炎、神經(jīng)性皮炎、腦栓塞引起的偏癱以及糖尿病并發(fā)癥等?，F(xiàn)代藥理研究表明過山蕨水醇提取液對(duì)兔耳血管、蟾蜍后肢血管以及家兔肢體后肢血管有擴(kuò)張作用，其有效部位為總黃酮和有機(jī)酸。但是，對(duì)于過山蕨在預(yù)防和治療肝損傷方面并未見任何報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供過山蕨的一種新應(yīng)用以及一種肝功修正茶。
過山蕨在歷代本草中未見有關(guān)其藥用記載，其主要用于治療外傷出血、子宮出血、 血栓閉塞性脈管炎、神經(jīng)性皮炎、腦栓塞引起的偏癱以及糖尿病并發(fā)癥等。而經(jīng)本申請(qǐng)人對(duì)過山蕨的深入研究發(fā)現(xiàn)，過山蕨對(duì)各種原因引起的肝損傷以及肝功能失調(diào)具有明顯的修復(fù)和保護(hù)作用。
因此，本發(fā)明提出了過山蕨在制備預(yù)防和治療肝損傷以及由肝損傷引起的肝功能失常藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述肝損傷優(yōu)選為化學(xué)性肝損傷和病理性肝損傷。其中，作為優(yōu)選，所述化學(xué)性肝損傷為由四氯化碳引起的急性肝損傷、由四氯化碳引起的慢性肝損傷、由酒精引起的急性肝損傷、由撲熱息痛引起的急性肝損傷或由地塞米松聯(lián)合酒精引起的脂肪肝。所述病理性肝損傷為由刀豆蛋白A引起的免疫性肝損傷。
此外，本發(fā)明還提供一種肝功修正茶，由過山蕨全草經(jīng)烘干、粉碎后制得或由過山蕨全草經(jīng)烘干、粉碎后水煎，水煎提取液濃縮為原體積40-60%即得。由過山蕨全草經(jīng)烘干、 粉碎后制得的肝功修正茶以熱水浸泡飲用；由過山蕨全草經(jīng)烘干、水煎后，濃縮提取液制得的肝功修正茶可直接飲用濃縮提取液，作為優(yōu)選，所述濃縮百分比為50%。兩者口服、注射對(duì)各種原因引起的肝損傷的藥效顯著，能夠廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療肝損傷以及由肝損傷引起的肝功能失常中。
本發(fā)明所述肝功修正茶動(dòng)物有效劑量范圍按過山蕨全草干品折算為口服 0. l-10g/kg(體重)/日、皮下注射0. l_5g/kg(體重)/日、靜注0. l_5g/kg(體重)/日，優(yōu)選劑量為口服0. 25"5g/kg (體重)/日、皮下注射0. 25-2. 5g/kg (體重)/日、靜注0. 25-2. 5/ kg(體重)/日。人用有效劑量范圍為口服0.8-80g/日、皮下注射0.8-40g/日、靜注 0. 8-40g/日，優(yōu)選劑量為口服2-40g/日、皮下注射2-20g/日、靜注2_20g/日。
在研發(fā)預(yù)防和治療肝損傷的藥物過程中，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知由四氯化碳引起的肝損傷模型最能代表典型化學(xué)性肝損傷的病理特征，因此本發(fā)明將所述肝功修正茶以高、 中、低3個(gè)劑量組對(duì)由四氯化碳引起的小鼠急性肝損傷和小鼠慢性肝損傷進(jìn)行藥效試驗(yàn)， 結(jié)果顯示，本發(fā)明所述肝功修正茶對(duì)四氯化碳引起的急性肝損傷小鼠有降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作用，可以顯著阻止四氯化碳引起的急性肝損傷；
而對(duì)慢性肝損傷小鼠也有降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作用，還可以顯著降低肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子i3 1(TGF_i3 1)、組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP-I)、層粘蛋白(LN)、及1-3型膠原(Col-I，Col-II，Col-III)含量等含量，改善小鼠慢性肝損傷肝纖維化病理狀態(tài)。
除此之外，本發(fā)明同樣以高、中、低3個(gè)劑量組對(duì)由酒精引起的急性肝損傷、由撲熱息痛引起的急性肝損傷和由地塞米松聯(lián)合酒精引起的脂肪肝進(jìn)行了藥效試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述肝功修正茶能夠有效阻止各種上述原因引起的肝損傷。
病理性肝損傷主要發(fā)病原因是甲肝病毒、乙肝病毒等分泌出類似于刀豆蛋白A — 樣的免疫原物質(zhì)，從而與肝細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，損害肝細(xì)胞。因此，本發(fā)明同樣將所述肝功修正茶以高、中、低3個(gè)劑量組由刀豆蛋白A引起的免疫性肝損傷進(jìn)行藥效試驗(yàn)，結(jié)果顯示本發(fā)明所述肝功修正茶試驗(yàn)組和模型組具有顯著差異，能夠有效防止免疫性肝損傷，表明本發(fā)明所述肝功修正茶能夠預(yù)防和治療病理性肝損傷。
由于本發(fā)明所述肝功修正茶能夠有效阻止多種原因引起的肝損傷，故其對(duì)由肝損傷引起的肝功能失常也具有顯著療效。
由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述以過山蕨為活性物質(zhì)制成的肝功修正茶對(duì)由多種原因引起的化學(xué)性肝損傷和病理性肝損傷均有顯著療效，表明過山蕨能夠應(yīng)用于制備預(yù)防和治療肝損傷以及由肝損傷引起的肝功能失常藥物中。


圖1所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)CCl4引起的急性肝損傷小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為CCl4模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組； **表示肝功修正茶中劑量組與CCl4模型組具有顯著性差異，P <0.01；
圖2所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)CCl4引起的慢性肝損傷小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為CCl4模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組； **表示肝功修正茶中劑量組與CCl4模型組具有顯著性差異，P <0.01；
圖3所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)CCl4引起的慢性肝損傷小鼠肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β KTGF-β 1)、組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP-I)及層粘蛋白(LN)含量的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為CCl4模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組； ”表示肝功修正茶中劑量組與CCl4模型組具有顯著性差異，P < 0. 01 ；*表示肝功修正茶中劑量組與CCl4模型組具有顯著性差異，P < 0. 05 ；
圖4所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)CCl4引起的急性肝損傷小鼠肝組織中1-3型膠原(Col-Ι，Col-II，Col-III)含量的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為CCl4模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組廣表示肝功修正茶中劑量組與CCl4模型組具有顯著性差異，P < 0. 05 ；
圖5所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)撲熱息痛引起的急性肝損傷小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為撲熱息痛模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組廣表示肝功修正茶中劑量組與撲熱息痛模型組具有顯著性差異，P < 0. 01 ；
圖6所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)酒精引起的急性肝損傷小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為酒精模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組廣表示肝功修正茶中劑量組與酒精模型組具有顯著性差異，P < 0.01 ；
圖7所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)酒精引起的急性肝損傷小鼠肝組織過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為酒精模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組廣表示肝功修正茶中劑量組與酒精模型組具有顯著性差異，P < 0. 05 ；
圖8所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)刀豆蛋白A(ConA)引起的免疫性肝損傷小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為ConA模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組； **表示肝功修正茶中劑量組與ConA模型組具有顯著性差異，P < 0. 01 ；
圖9所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)地塞米松聯(lián)合酒精引起的脂肪肝小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為地塞米松-酒精模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組廣表示肝功修正茶中劑量組與地塞米松-酒精模型組具有顯著性差異，P < 0. 01 ；
圖10所示為肝功修正茶中劑量組對(duì)地塞米松聯(lián)合酒精引起的脂肪肝小鼠血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的影響的柱形其中，1所示為正常對(duì)照組，2所示為地塞米松-酒精模型組，3所示為肝功修正茶中劑量組；*表示肝功修正茶中劑量組與地塞米松-酒精模型組具有顯著性差異，P具體實(shí)施方式
本發(fā)明公開了過山蕨的應(yīng)用以及一種肝功修正茶，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
下面就本發(fā)明提供的過山蕨的應(yīng)用以及一種肝功修正茶做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1 本發(fā)明所述肝功修正茶對(duì)四氯化碳小鼠急性肝損傷的影響
1、試驗(yàn)方法
將50只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為 正常對(duì)照組、四氯化碳模型組、肝功修正茶低劑量、中劑量、高劑量組。
將過山蕨全草地上部分洗凈、烘干、粉碎后過40目篩得粗粉備用。每30g粗粉加新制沸開水IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為高劑量組藥液；每15g粗粉加新制沸開水 IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為中劑量組藥液；每7. 5g粗粉加新制沸開水IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為低劑量組藥液；三組加水的體積、溫度以及浸泡時(shí)間均一致。
正常對(duì)照組和四氯化碳模型組灌胃10ml/kg的生理鹽水，其它各劑量組灌胃同等容量的相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)10天。第9次給藥后lh，各組小鼠腹腔注射10%的CCl4 橄欖油溶液0. ani/只(正常組只注射同容量橄欖油)。CCI4注射后，禁食不禁水Mh (末次給藥后Ih)。將小鼠摘除眼球取血，制備血清，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒檢測(cè)血清ALT、AST活性，結(jié)果見圖 1。處死小鼠，隨即取部分肝組織，置于10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定，制備病理組織切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。
2、結(jié)果
腹腔注射CCl4可引起小鼠急性肝損傷，肝臟中的細(xì)胞色素P450可將CCl4激活為· CCl3* · Cl，這些自由基經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)，可以破壞肝臟細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其通透性增加，導(dǎo)致ALT、AST等轉(zhuǎn)氨酶滲入血液，使血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性顯著升高。灌胃不同劑量的肝功修正茶后，急性肝損傷小鼠ALT和AST活性明顯降低(見圖1，圖中僅以1. 5g/kg劑量治療組做代表)，其余各劑量與1. 5g/kg劑量治療組間無顯著差異。
病理檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟色澤暗紅，被膜光滑，肝邊緣輪廓清晰，表面無任何斑點(diǎn)；鏡下觀察可見肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞未見變性、壞死。
CCl4模型組肝臟體積增大，顏色發(fā)白，呈粉色，表面有明顯的斑點(diǎn)狀花紋和大量出血點(diǎn)，局部有淤血，無光澤，有的與鄰近器官輕度粘連；鏡下觀察可見肝小葉界限不清，肝細(xì)胞廣泛性的水樣變性，肝小葉內(nèi)有大片灶性壞死區(qū)。
肝功修正茶各劑量組小鼠肝臟均呈深粉紅色，表面有少量出血點(diǎn)，有光澤，肝葉輪廓清晰，斑點(diǎn)數(shù)量明顯少于CCl4模型組。鏡下觀察可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞輕度濁腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，灶狀壞死范圍明顯減小。
實(shí)施例2 本發(fā)明所述肝功修正茶對(duì)四氯化碳小鼠慢性肝損傷的影響
1、試驗(yàn)方法
將50只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為 正常對(duì)照組、四氯化碳模型組、肝功修正茶低劑量、中劑量、高劑量組(0. 75g/kg、l. 5g/kg、 3g/kg)ο
將過山蕨全草地上部分洗凈、烘干、粉碎后過40目篩得粗粉備用。高劑量組每30g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為高劑量組藥液；中劑量組每15g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為中劑量組藥液；低劑量組每7. 5g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為低劑量組藥液；三組加水的體積、水煎時(shí)間以及濃縮倍數(shù)均一致。
正常對(duì)照組和四氯化碳模型組灌胃10ml/kg的生理鹽水，其它各組灌胃同等容量的相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)4周。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均自試驗(yàn)開始之日起，給予40% CCl4橄欖油溶液0. 05ml/只皮下注射，每周2次(周一和周四各1次)，共4周。正常對(duì)照組皮下注射等量的橄欖油，次數(shù)相同。末次給藥后小鼠禁食不禁水Mh (全程給藥結(jié)束后Mh)，摘眼球取血，離心取血清，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒檢測(cè)血清ALT、AST活性，結(jié)果見圖2。
處死小鼠，取部分肝臟制備肝組織勻漿，用進(jìn)口分裝的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β I(TGF-M)、組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP-I)、層粘蛋白(LN)、及1、3、4型膠原(Col-I, Col-III, Col-IV)ELISA試劑盒檢測(cè)肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β KTGF-β 1)、組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP-I)、層粘蛋白(LN)、及1-3型膠原(Col-I，Col-II, Col-III)含量，結(jié)果見圖3、圖4。
另取部分肝組織，置于10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定，制備病理組織切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。
2、結(jié)果
多次注射CCl4可引起小鼠肝臟慢性損傷纖維化病變，同時(shí)伴隨血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性升高。灌胃不同劑量的肝功修正茶對(duì)CCl4引起的慢性肝損傷小鼠均有降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作用(見圖2，圖中僅以1. 5g/kg劑量治療組做代表)，可以顯著降低肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β KTGF-β 1)、組織金屬蛋白酶抑制物 (TIMP-I)、層粘蛋白(LN)、及 1-3 型膠原(Col-I，Col-II, Col-III)含量(見圖 3、圖 4，圖中僅以1.5g/kg劑量治療組做代表)，其余各劑量與1.5g/kg劑量治療組間無顯著差異。
病理檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，色暗紅，有光澤，質(zhì)軟；鏡下觀察可見肝小葉、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列呈索狀，無脂肪變、壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
CCl4模型組肝臟表面凹凸不平，見細(xì)小沙粒狀顆粒，質(zhì)脆，光澤度欠佳；鏡下觀察可見肝組織大量脂質(zhì)空泡形成，彌漫性大泡性脂肪變，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死匯管區(qū)及纖維間隔可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉間隔明顯增寬和大量膠原纖維沉積，肝內(nèi)有類假小葉樣結(jié)構(gòu)。
肝功修正茶各組小鼠肝臟表面尚光滑，沙粒狀顆粒明顯減少。鏡下觀察病變程度較模型組脂質(zhì)空泡明顯減少，肝小葉基本完整，殘存部分正常肝細(xì)胞纖維組織增生不明顯。
實(shí)施例3 本發(fā)明所述肝功修正茶對(duì)撲熱息痛致小鼠急性肝損傷的影響
1、試驗(yàn)方法
將50只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為 正常對(duì)照組、撲熱息痛模型組、肝功修正茶低劑量、中劑量、高劑量組(0. 75g/kg、l. 5g/kg、 3g/kg)ο
將過山蕨全草地上部分洗凈、烘干、粉碎后過40目篩得粗粉備用。每30g粗粉加新制沸開水IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為高劑量組藥液；每15g粗粉加新制沸開水 IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為中劑量組藥液；每7. 5g粗粉加新制沸開水IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為低劑量組藥液；三組加水的體積、溫度以及浸泡時(shí)間均一致。
正常對(duì)照組和撲熱息痛模型組灌胃10ml/kg的生理鹽水，其它各組灌胃同等容量的相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)10天。第9次給藥后lh，各組小鼠腹腔注射3%的撲熱息痛溶液0. 2ml/只(正常對(duì)照組除外)。撲熱息痛注射后，禁食不禁水24h (末次給藥后Ih)。將小鼠摘除眼球取血，制備血清，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT) 和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒檢測(cè)血清ALT、AST活性，結(jié)果見圖5。
處死小鼠，隨即取部分肝組織，置于10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定，制備病理組織切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。
2、結(jié)果
撲熱息痛進(jìn)入人體內(nèi)后，過量的有毒代謝產(chǎn)物與細(xì)胞膜結(jié)合，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，血清轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高。灌胃不同劑量的肝功修正茶對(duì)撲熱息痛引起的急性肝損傷小鼠均有降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作用(見圖5，圖中僅以1. 5g/kg劑量治療組做代表)， 其余各劑量與1. 5g/kg劑量治療組間無顯著差異。
病理檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，核大而清晰，胞質(zhì)豐富，含有團(tuán)塊嗜堿質(zhì)，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列整齊，肝竇正常，胞核結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無變性、壞死、充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)的病理現(xiàn)象。
撲熱息痛模型組小鼠，肝臟有明顯的充血及空泡樣變，嗜酸性變?cè)龆?，肝竇消失， 肝臟小葉中央靜脈周圍的肝細(xì)胞有不同程度的變性與壞死，胞核固縮或已溶解破碎，伴中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞索正常形態(tài)被破壞。
肝功修正茶各組小鼠肝臟充血不明顯，肝細(xì)胞濁腫明顯減輕，肝竇已變寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肝細(xì)胞再生明顯。
實(shí)施例4 本發(fā)明所述肝功修正茶對(duì)酒精致小鼠急性肝損傷的影響
1、試驗(yàn)方法
將50只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為 正常對(duì)照組、酒精模型組、肝功修正茶低劑量、中劑量、高劑量組(0. 75g/kg、l. 5g/kg、3g/ kg)。
將過山蕨全草地上部分洗凈、烘干、粉碎后過40目篩得粗粉備用。高劑量組每30g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為高劑量組藥液；中劑量組每15g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為中劑量組藥液；低劑量組每7. 5g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為低劑量組藥液；三組加水的體積、水煎時(shí)間以及濃縮倍數(shù)均一致。
正常對(duì)照組和酒精模型組灌胃10ml/kg的生理鹽水，其它各組灌胃同等容量的相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)10天。第9次給藥后lh，各組小鼠腹腔注射市售52°的瀘州老窖白酒O.aiil/只(正常組除外)。白酒注射后，禁食不禁水Mh (末次給藥后Ih)。將小鼠摘除眼球取血，制備血清，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒檢測(cè)血清ALT、AST活性，結(jié)果見圖6。
處死小鼠，取部分肝臟制備肝組織勻漿，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒檢測(cè)肝組織中過氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，結(jié)果見圖7。
另取部分肝組織，置于10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定，制備病理組織切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。
2、結(jié)果
小鼠酒精性肝損傷是模擬人體過量飲酒導(dǎo)致肝臟損害的動(dòng)物模型，以轉(zhuǎn)氨酶升高和抗氧化酶降低為表現(xiàn)形式。灌胃不同劑量的肝功修正茶對(duì)酒精引起的急性肝損傷小鼠均有降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作用(見圖6，圖中僅以 1. 5g/kg劑量治療組做代表)，可以增加肝組織過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)， 降低肝組織丙二醛(MDA)含量(見圖7，圖中僅以1.5g/kg劑量治療組做代表)，其余各劑量與1. 5g/kg劑量治療組間無顯著差異。
病理檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞無明顯病變。
酒精模型組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，小葉界限不清，肝竇變窄，肝細(xì)胞出現(xiàn)散在和片狀氣球樣變，可見肝細(xì)胞腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
肝功修正茶各組小鼠肝臟小葉界限基本清晰，肝細(xì)胞腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯減輕，肝竇已變寬，肝組織結(jié)構(gòu)排列接近正常。
實(shí)施例5 本發(fā)明所述肝功修正茶對(duì)刀豆蛋白A(ConA)致小鼠免疫性肝損傷的影響
1、試驗(yàn)方法
將50只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為 正常對(duì)照組、ConA模型組、肝功修正茶低劑量、中劑量、高劑量組(0. 75g/kg、l. 5g/kg、3g/ kg)。
將過山蕨全草地上部分洗凈、烘干、粉碎后過40目篩得粗粉備用。每30g粗粉加新制沸開水IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為高劑量組藥液；每15g粗粉加新制沸開水 IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為中劑量組藥液；每7. 5g粗粉加新制沸開水IOOml浸泡15min后過濾，所得溶液為低劑量組藥液；三組加水的體積、溫度以及浸泡時(shí)間均一致。
正常對(duì)照組和ConA模型組灌胃10ml/kg的生理鹽水，其它各組灌胃同等容量的相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)10天。末次給藥后lh，各組小鼠尾靜脈注射ConA 15mg/kg(正常組除外)。注射ConA他后小鼠摘眼球采血，分離血清，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒檢測(cè)血清ALT、AST活性，結(jié)果見圖8。
處死小鼠，隨即取部分肝組織，置于10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定，制備病理組織切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。
2、結(jié)果
ConA注射后通過活化T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致免疫性肝損傷，是適合研究人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病的病理機(jī)制和進(jìn)行抗肝損傷藥物篩選的動(dòng)物模型。灌胃不同劑量的肝功修正茶對(duì)刀豆蛋白A(ConA)引起的免疫性肝損傷小鼠均有降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作用(見圖8，圖中僅以1.5g/kg劑量治療組做代表)， 其余各劑量與1. 5g/kg劑量治療組間無顯著差異。
病理檢測(cè)結(jié)果顯示，正常小鼠，肝臟內(nèi)可見多個(gè)肝小葉，肝索排列規(guī)整，肝小葉的結(jié)構(gòu)清晰，門管區(qū)結(jié)構(gòu)清楚，無明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死。
ConA模型組小鼠，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有較多淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，可見小灶狀肝細(xì)胞壞死。
肝功修正茶各組小鼠，肝小葉結(jié)構(gòu)基本保留，肝索排列基本規(guī)整，門管區(qū)有少量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯肝細(xì)胞壞死，病變較模型對(duì)照組明顯減輕。
實(shí)施例6 本發(fā)明所述肝功修正茶對(duì)地塞米松聯(lián)合酒精致小鼠脂肪肝的影響
1、試驗(yàn)方法
將50只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組、地塞米松-酒精模型組、肝功修正茶低劑量、中劑量、高劑量組(0. 75g/kg、 1.5g/kg、3g/kg)。
將過山蕨全草地上部分洗凈、烘干、粉碎后過40目篩得粗粉備用。高劑量組每30g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為高劑量組藥液；中劑量組每15g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為中劑量組藥液；低劑量組每7. 5g 粗粉加水200ml煮沸15min后過濾，濃縮為IOOml提取液為低劑量組藥液；三組加水的體積、水煎時(shí)間以及濃縮倍數(shù)均一致。
正常對(duì)照組和地塞米松-酒精模型組灌胃10ml/kg的生理鹽水，其它各組灌胃同等容量的相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)9天。從第1天起，除正常對(duì)照組外每組小鼠給藥后Ih 灌胃市售35°的瀘州老窖白酒O.aiil/只，每天1次，連續(xù)9天。第5天起，除正常對(duì)照組外每組小鼠灌胃市售35°的瀘州老窖白酒后腹腔注射地塞米松注射液10mg/kg，每天1次，連續(xù)4天。全程造模給藥結(jié)束后，禁食不禁水24h將小鼠摘除眼球取血，制備血清，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)試劑盒檢測(cè)血清ALT、AST活性和TC、TG含量，結(jié)果見圖9、圖10。
處死小鼠，隨即取部分肝組織，置于10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定，制備病理組織切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。
2、結(jié)果
地塞米松聯(lián)合酒精小鼠脂肪肝模型表現(xiàn)為血脂升高，同時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高的肝功能異常。灌胃不同劑量的肝功修正茶對(duì)地塞米松聯(lián)合酒精引起的脂肪肝小鼠均有降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)作用(見圖9、圖10，圖中僅以1. 5g/kg劑量治療組做代表)，其余各劑量與1. 5g/kg劑量治療組間無顯著差異。
病理檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組小鼠，肝小葉清晰可見，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，1肝細(xì)胞無脂肪變性，細(xì)胞形態(tài)無明顯異常。
地塞米松-酒精模型小鼠，肝臟出現(xiàn)大泡性的肝細(xì)胞脂肪變性，變性的肝細(xì)胞彌漫累及幾乎所有肝小葉，肝細(xì)胞腫脹呈圓形，細(xì)胞核被擠向一邊，胞漿內(nèi)充滿大量脂肪空泡，界限不清楚。
肝功修正茶各組小鼠，肝臟脂肪變性明顯改善，脂滴減少或消失，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.過山蕨在制備預(yù)防和治療肝損傷以及由肝損傷引起的肝功能失常藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述肝損傷為化學(xué)性肝損傷和病理性肝損傷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述化學(xué)性肝損傷為由四氯化碳引起的急性肝損傷、由四氯化碳引起的慢性肝損傷、由酒精引起的急性肝損傷、由撲熱息痛引起的急性肝損傷或由地塞米松聯(lián)合酒精引起的脂肪肝。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述病理性肝損傷為由刀豆蛋白A引起的免疫性肝損傷。
5.一種肝功修正茶，其特征在于，由過山蕨全草經(jīng)烘干、粉碎后制得或由過山蕨全草經(jīng)烘干、粉碎后水煎，水煎提取液濃縮為原體積40-60%即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述肝功修正茶，其特征在于，所述濃縮百分比為50%。
全文摘要
本發(fā)明試劑中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了過山蕨的應(yīng)用以及一種肝功修正茶。本發(fā)明所述以過山蕨為活性物質(zhì)制成的肝功修正茶對(duì)由酒精、四氯化碳、撲熱息痛、地塞米松聯(lián)合酒精、刀豆蛋白A等多種原因引起的化學(xué)性肝損傷和病理性肝損傷均有顯著療效，表明過山蕨能夠應(yīng)用于制備預(yù)防和治療多種原因引起的肝損傷以及由肝損傷引起的肝功能失常藥物中。
文檔編號(hào)A23F3/34GK102526130SQ20111034822
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者盧丹丹, 盧建立, 盧琳琳, 孫婷, 張亞平, 時(shí)小燕, 杜鋼軍, 林海紅, 黃秀曼 申請(qǐng)人:盧建立, 杜鋼軍