專利名稱：具有增強(qiáng)美白作用的人參發(fā)酵提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人參發(fā)酵提取物的制備方法，以及該提取物用于化妝品的用途。
背景技術(shù)：
人參屬于五加科人參屬的多年生草本植物，全球約有11種，代表性的人參種有高 _ 參(/kaaz ginseng C. A. Meyer ) >(.Panax quinquefolium L.)、三七參(/ : notoginseng F. H.)、珠子參0 ^ japonicas C. A. Meyer)等。從中藥炮制學(xué)和功效而言，人參可分為生曬參、紅參、野山參和西洋參。人參喜陰涼、濕潤(rùn)的氣候，多生長(zhǎng)于晝夜溫差小的海拔500 1100米山地緩坡或斜坡地的針闊混交林或雜木林中。由于根部肥大，形若紡錘，常有分叉，全貌頗似人的頭、手、足和四肢，故而稱為人參。“神農(nóng)本草經(jīng)”中就被分類為高級(jí)品，一直作為貴重的滋補(bǔ)品延續(xù)到現(xiàn)在?！氨静菥V目”中提到，人參主治補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目開(kāi)心益智，久服輕身延年?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，很多藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)都表明人參加強(qiáng)了人體對(duì)壓力的非特異性抵抗力， 還有抗酸作用等其他藥理功效。在化妝品研究中，人參揮發(fā)油可通過(guò)皮膚的滲透作用為人體所吸收，從而促進(jìn)血液循環(huán)和新陳代謝，增進(jìn)肌膚細(xì)胞的發(fā)育營(yíng)養(yǎng)和光澤，具有防皺和抗寒冷與紫外線輻射作用。人參皂苷能顯著抑制肝組織和血液中過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)的形成， 并提高紅細(xì)胞中SOD的活性，以延緩細(xì)胞衰老，使容顏常駐。人體皮膚衰老的主要原因是血液循環(huán)不良，新陳代謝降低，皮膚彈性減弱。由于人參中含有多種人參皂苷、氨基酸、維生素及礦物質(zhì)，具有促進(jìn)皮下組織血管的血液循環(huán)，增加皮膚的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，調(diào)節(jié)皮膚水分平衡等作用。所以它能延緩皮膚衰老，防止皮膚干燥脫水，增加皮膚塔寧，從而起到保護(hù)皮膚光澤柔嫩，防止和減少皮膚皺紋的作用。人參成分還具有抑制黑色素還原性能，使皮膚潔白光滑。色素沉著性皮膚病如雀斑(遺傳性)、黃褐斑(內(nèi)分泌性)、曬斑(炎癥性)、瑞爾黑變病(代謝性)等因影響美觀，越來(lái)越多的患者迫切要求治療，因而產(chǎn)生大量的美白祛斑產(chǎn)品， 其中中藥美白產(chǎn)品以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(安全，刺激性小，副作用小)倍受歡迎。一直以來(lái)，美白祛斑都是人們所熱切關(guān)注的話題。東方人希望通過(guò)美白護(hù)理品的使用而得到白皙、光潔的皮膚，而歐美消費(fèi)者主要利用功能型美白化妝品來(lái)減輕老年斑、黃褐斑等色素沉積。美白祛斑化妝品的誕生不但解決了東西方人對(duì)美的追求，而且給美容業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，使得美白祛斑劑作為功能性原料普遍使用。近年來(lái)，皮膚美白類化妝品市場(chǎng)日趨活躍，產(chǎn)品銷售與日俱增，已成為護(hù)膚類化妝品的主流品種之一。然而，汞、 砷、鉛等重金屬在化妝品中的長(zhǎng)期濫用也給化妝品行業(yè)乃至人類帶來(lái)了諸多負(fù)面效應(yīng)，如神經(jīng)衰弱、乏力、失眠、煩躁(汞)，或者色素沉著、疼痛(砷)和便秘、貧血(鉛)等癥狀，均極大地危害著人類健康。隨著人們生活水平和審美標(biāo)準(zhǔn)的提高，化妝品安全問(wèn)題已經(jīng)在全球范圍得到廣泛關(guān)注，禁止在化妝品生產(chǎn)中使用重金屬的呼聲越來(lái)越高。美白祛斑劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究不斷深入，市場(chǎng)上新的功效高、易于配伍的原料不斷推出。古代人民在長(zhǎng)期的生活實(shí)踐中總結(jié)出大量利用植物進(jìn)行美容的知識(shí)[1]。利用植物的根、莖、皮、葉、花、果等物質(zhì)作用于皮膚組織后，通過(guò)新陳代謝，產(chǎn)生維生素等物質(zhì)參與色素代謝，達(dá)到美白目的。各國(guó)對(duì)皮膚美白劑作用、新的美白劑的開(kāi)發(fā)和美白劑的應(yīng)用投入了大量的人力、物力，并取得了明顯的進(jìn)展。 目前已有許多皮膚美白劑問(wèn)世，如早期的純化學(xué)物氯化氨基汞、過(guò)氧化氫及氫醌，中期的果酸和近期的天然植物提取物，如熊果苷、VitC衍生物、甘草提取物、曲酸及其衍生物以及內(nèi)皮素拮抗劑等。美容業(yè)發(fā)達(dá)的美、法兩國(guó)都不敢放松對(duì)化妝品的監(jiān)管，我國(guó)同樣不能掉以輕心，對(duì)化妝品的監(jiān)管措施也逐步嚴(yán)格起來(lái)。因此，尋求開(kāi)發(fā)天然、綠色和環(huán)保的美白祛斑劑， 成為美容業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)。黑素由黑素細(xì)胞產(chǎn)生，是決定人體膚色的主要色素。研究表明，不同種族的人群皮膚組織中黑素細(xì)胞的數(shù)目大體上相同，但黑素小體的數(shù)量、大小、分布及黑素化程度存在明顯差異[4]。天然植物美白的機(jī)理主要是通過(guò)抑制黑素合成、成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解、排出等多個(gè)環(huán)節(jié)，如抑制黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑素，減少表皮內(nèi)的黑素顆粒，到達(dá)美白祛斑的效果。具體地講就是抑制黑素生成所需的酶(主要是酪氨酸酶)、破壞黑素細(xì)胞、還原多巴醌等方式。如中藥烏梅、桂皮、蔓荊子、山茱萸、夏枯草、白頭翁、附子、黃連、益母草、皂莢等。桑白皮、地榆、苦參、 金銀花、甘草、川芎、車前子、茯苓、蘆薈、熟地黃、五倍子、蟬衣、牡丹皮、苦參、珍珠繡線菊、 蒼耳子、桑樹(shù)根皮(鮮)、大黃(生)、六月雪、泥湖菜、地骨皮、炒川斷、天麻、連翹、茶條槭、敗醬草、黃楊、雙花、桑葉、蘆薈等對(duì)酪氨酸酶活性有抑制作用]。日本學(xué)者Akazawa研究發(fā)現(xiàn)， 槭樹(shù)科(Aceraceae)樹(shù)皮提取物具有潛在的抑制黑素形成和清除自由基功效。壬二酸及其衍生物能選擇性對(duì)異常活躍的黑素細(xì)胞有抗增殖作用，阻滯酪氨酸酶蛋白的合成，但對(duì)功能正常的黑素細(xì)胞作用較小。郭樹(shù)忠等[14]觀察川芎嗪對(duì)體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞的抑制作用， 發(fā)現(xiàn)川芎嗪對(duì)黑素細(xì)胞的增殖有抑制作用，能使細(xì)胞數(shù)明顯減少，黑素合成顯著下降，酪氨酸酶活性逐漸減弱；黑素小體明顯減少，揭示川芎嗪抑制黑素細(xì)胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性。過(guò)量紫外線照射是造成皮膚變黑，引發(fā)、加重色素沉著的主要原因。因?yàn)樽贤饩€引起的應(yīng)激反應(yīng)使活性黑素細(xì)胞數(shù)量增加，并激活酪氨酸酶活性和內(nèi)皮素，促進(jìn)黑素的形成， 皮膚由此變黑，局部黑素又經(jīng)由細(xì)胞代謝的層層移動(dòng)，到了肌膚表皮層會(huì)形成雀斑、曬斑、 黑斑等。長(zhǎng)期日曬促使皮膚衰老退化和導(dǎo)致產(chǎn)生皮膚癌，故防UVA光段傷害的重要性也越來(lái)越受到重視。近年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)天然植物蘆薈具有吸收紫外線作用，它的有效成分蘆薈苷可強(qiáng)烈吸收范圍(290 320 nm)內(nèi)紫外光，并有保濕、調(diào)理皮膚的功能。研究結(jié)果表明，蘆薈汁、凝膠和皮，均有一定的防曬作用，它們的防曬效果是凝膠〉汁〉皮，是一種較好的天然防曬劑。黑素細(xì)胞分泌的呈現(xiàn)氧化狀態(tài)的黑素稱為氧化型黑素，它具有明顯的黑色，如果將黑素加以還原，則變?yōu)闊o(wú)色的還原型色素。還原劑主要指草藥中含有的維生素C、維生素E及其衍生物等。Jones等]報(bào)道蘆薈苦素是酪氨酸酶的混合性抑制劑，并可抑制多巴的自身氧化，對(duì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)影響，防止或減少黑素的生成及沉著，所以具有一定的美白效果。目前，已明確的草藥中具有美白效果的活性成分主要有①氫醌具有抑制酪氨酸酶的作用?？梢匀斯ず铣桑部梢詮奶烊恢参镏刑崛?，據(jù)報(bào)道，天然萃取的產(chǎn)品更具生物活性，祛斑美白的效果更為明顯。但由于氫醌的不穩(wěn)定性(易氧化)及對(duì)皮膚較大的毒性(如形成永久性白斑等)，這種皮膚刺激作用與氫醌濃度相關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外均傾向于用低濃度氫醌或復(fù)方制劑治療黃褐斑；②熊果苷可從厚葉巖白菜、人參、烏飯樹(shù)、越橘、熊果和梨樹(shù)的葉中萃取。熊果苷是酪氨酸酶抑制劑，低濃度即可抑制酪氨酸酶的活性，阻斷多巴及多巴醌的合成，從而抑制黑素的生成。其具體機(jī)理是與L-酪氨酸在酪氨酸酶活性部位的競(jìng)爭(zhēng)， 從而抑制酪氨酸酶的活性；③甘草提取物人們從甘草中不斷提取出有效的美白成分，主要是甘草酸、甘草亭酸、甘草黃酮等。具有抑制黑素細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制酪氨酸酶、還原多巴醌多個(gè)環(huán)節(jié)的美白作用；④根皮素根皮素及其苷是國(guó)外新近研究開(kāi)發(fā)得較多的一種新型皮膚美白劑，根皮素存在于蘋果、梨等水果和多種蔬菜汁液中，在植物的根莖或根皮中含量較為集中。能抑制黑素細(xì)胞活性，對(duì)各種皮膚色斑有淡化作用；⑤原花青素可從葡萄籽、松樹(shù)皮、大黃、山楂等植物中提取，可抑制酪氨酸酶的活性，將黑素的鄰苯二醌結(jié)構(gòu)還原成酚型結(jié)構(gòu)，使色素褪色，還可抑制蛋白質(zhì)氨基與核酸氨基間的美拉德反應(yīng)，從而抑制脂褐素、老年斑的形成，與維生素C、維生素E間有協(xié)同作用；⑥內(nèi)皮素拮抗劑內(nèi)皮素拮抗劑可從德甘菊等天然植物中提取，可與表皮黑素細(xì)胞上的受體結(jié)合，阻斷內(nèi)皮素的促增殖分化作用，使黑素的合成速度降低，與其他活性成分相比，內(nèi)皮素拮抗劑用量少，見(jiàn)效快，且可使色素分布均勻一致；⑦綠茶提取物含有多酚，是一類有效的抗氧化生物類黃酮，多含有活性五倍子酸基團(tuán)的兒茶酚，可作用酪氨酸酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，還可有效抑制成熟的黑素顆粒從黑素細(xì)胞至角質(zhì)形成細(xì)胞的傳遞；⑧果酸天然果酸中有乳酸、蘋果酸、水楊酶及其衍生物，可軟化角質(zhì)層，脫去死皮，促進(jìn)含有黑素的角質(zhì)形成細(xì)胞脫落；⑨鞣花酸是從石榴果皮和樹(shù)皮中提取的針狀結(jié)晶物，在整個(gè)紫外線區(qū)域均有較強(qiáng)的吸收作用，通過(guò)吸收紫外線起防曬或清除自由基的作用。 酪氨酸酶是黑素形成過(guò)程中的一個(gè)主要的限速酶，該酶的活性大小決定著黑素形成的數(shù)量。黑素細(xì)胞以酪氨酸為原料，主要在限速酶酪氨酸酶的氧化作用下生成黑素。首先，酪氨酸在酪氨酸酶作用下被氧化成多巴，多巴又在酪氨酸酶作用下被氧化成多巴醌，多巴醌經(jīng)過(guò)多巴色素-二羥基吲哚-酮式吲哚等一系列反應(yīng)，最終形成黑素(優(yōu)黑素或真黑素)。黑色素形成是決定哺乳動(dòng)物皮膚顏色的最重要因素，抑制黑色素的形成可減少皮膚黑暗。因此，酪氨酸酶抑制劑具有潛在的治療異常色素紊亂作用，廣泛用于皮膚美白劑，其中包括熊果苷和曲酸。 紅參中的酪氨酸酶抑制活性較弱。為了提高其活性，通過(guò)發(fā)酵方法制得發(fā)酵紅參， 使發(fā)酵紅參提取物具有較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性。

發(fā)明內(nèi)容
1.人參的發(fā)酵
申請(qǐng)人試圖利用微生物轉(zhuǎn)化方法，把不容易吸收的人參皂苷轉(zhuǎn)化成容易吸收的人參皂苷，并且提高有效成分compoimd-κ、RhU Rh2, Rg5等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用保加利亞乳酸菌進(jìn)行中高溫發(fā)酵后，有效成分含量提高幾倍甚至幾十倍。因此，本發(fā)明的目的是以人參，尤其是紅參為原料，利用環(huán)保方式大量工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵紅參用于人參化妝品中。1)選取人參材料
本發(fā)明對(duì)原料無(wú)特殊限制，可以使用天然形成或人工種植人參，諸如花旗參、三七參、 高麗參、珠子參等。更進(jìn)一步、可以使用人參葉、人參莖等目前無(wú)法利用的人參其他部分。再則，本發(fā)明還可以把現(xiàn)有紅參、白參、參片、參粉等各種人參一次加工物發(fā)酵成發(fā)酵紅參來(lái)提高其中有效成分，以下以紅參為例進(jìn)行說(shuō)明。
2)制備人參發(fā)酵酶液
在配置培養(yǎng)液時(shí)，可利用各種蔬果當(dāng)作碳源，高溫殺毒后配水制成菌液培養(yǎng)基(一般情況下，2體積蔬果漿液加8體積蒸餾水)。利用專屬發(fā)酵菌株——保加利亞乳酸菌培養(yǎng)增殖接種菌液培養(yǎng)基(利用梯度培養(yǎng)方法進(jìn)行乳酸菌培養(yǎng)增殖，每個(gè)梯度培養(yǎng)環(huán)境為A. 1 100接種；B. 360C ；C. 6小時(shí)搖床培養(yǎng)；D. 4個(gè)梯度；E.最后取IL菌液接種于9L果蔬培養(yǎng)液中接種)、發(fā)酵廣2周后，過(guò)濾留清液并封口，保存于4°C冷藏庫(kù)備用即可。本發(fā)明利用保加利亞乳酸菌，乳酸菌屬在進(jìn)行增殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生和分泌具有抑制細(xì)菌和微生物生長(zhǎng)的光譜細(xì)菌素和乳酸，導(dǎo)致其生長(zhǎng)環(huán)境為酸性，所以無(wú)需任何化學(xué)防腐劑。3)人參發(fā)酵酶液的接種
將洗凈的原料(紅參或其他人參加工產(chǎn)品)打成粉，接種于步驟2)的人參發(fā)酵酶液稀釋液(Ikg粉料接種400 - 600ml人參發(fā)酵酶稀釋液，人參發(fā)酵酶稀釋液以1體積人參發(fā)酵酶液加200體積甘草大棗液配制，甘草大棗液的配制方法是在50L蒸餾水中加入4顆大棗和 50g甘草片)，得到接種的人參發(fā)酵酶混合物。本發(fā)明發(fā)酵人參用于化妝品原料，所以不需要保留完整的紅參根，打成粉使用即可。如果要保留根的完整性，需要加倍接種量。4)發(fā)酵
a.前處理(升溫階段)
將發(fā)酵室溫度調(diào)整為30°C，把接種的人參發(fā)酵酶混合物盛在容器內(nèi)放入發(fā)酵室，8小時(shí)后，將發(fā)酵室溫度調(diào)整為45°C，繼續(xù)放置8小時(shí)。最后將發(fā)酵室溫度調(diào)整為65°C，繼續(xù)放置8小時(shí)。b.蒸參(恒溫蒸參)
將步驟a的容器置于搖床上，把發(fā)酵室溫度調(diào)整為75 85°C，持續(xù)旋轉(zhuǎn)震蕩發(fā)酵72 120小時(shí)，使人參粉與人參發(fā)酵酶稀釋液充分發(fā)酵。5)濃縮上清液(人參發(fā)酵提取物)
把所有混合液收集，并進(jìn)行過(guò)濾，獲得上清液，濃縮至1/10-1/100。此濃縮液為人參發(fā)酵提取物，冷藏并在需要時(shí)取出使用即可。 整個(gè)過(guò)程無(wú)特殊要求，所使用的原料是純天然物質(zhì)，無(wú)化學(xué)合成物質(zhì)，所排放物質(zhì)也是無(wú)污染排放物，并且可用于飼料配料使用，是一種純天然，無(wú)公害，安全可靠的技術(shù)。2.比較皂苷含量
以紅參為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，發(fā)酵紅參為試驗(yàn)樣品，利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析比較發(fā)酵前后5種紅參和得到的人參發(fā)酵提取物中特有的幾種代表——人參皂苷Rg3、RhU Rg5, C-K、Rh2的含量。其結(jié)果如表1所示。1)實(shí)驗(yàn)儀器
液相色譜儀(LC-6A日本島津)
2)實(shí)驗(yàn)方法
HPLC法測(cè)定發(fā)酵人參成分
3)實(shí)驗(yàn)條件
色譜柱Hypersil BDS C18 4. 6 X 250mm 5ym 流動(dòng)相=CH3CN - 0. 1%HC00H 溶液流速0. 8mL/min5/6頁(yè)
柱溫室溫(25°C) 檢測(cè)波長(zhǎng)203nm 進(jìn)樣量:5μ L
4)實(shí)驗(yàn)樣品
紅參提取液樣品、發(fā)酵紅參提取液樣品
5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
如表1中表示，通過(guò)微生物發(fā)酵，原料(紅參)中Rg3、I hl、Rg5、C-K、I h2均有不同程度的提高(2倍 20多倍)。所以從此可推測(cè)發(fā)酵紅參的美白效果會(huì)有所提高。為了更進(jìn)一步確定發(fā)酵紅參的美白效果，我們進(jìn)行了下一個(gè)實(shí)驗(yàn)——酪氨酸酶的抑制活性實(shí)驗(yàn)。
表1發(fā)酵前后人參皂苷成分的變化
權(quán)利要求
1.人參發(fā)酵提取物的制備方法，包括人參發(fā)酵步驟和提取物的制備，其中人參發(fā)酵步驟包括選取人參材料，制備人參發(fā)酵酶液，制備人參發(fā)酵酶液稀釋液，接種和發(fā)酵，所說(shuō)的人參發(fā)酵酶液是利用各種蔬果高溫殺毒后配水制成菌液培養(yǎng)基，使用保加利亞乳酸菌進(jìn)行乳酸菌培養(yǎng)增殖接種至該菌液培養(yǎng)基，發(fā)酵廣2周后過(guò)濾留清液并封口，冷藏備用；接種是將選取的人參材料制成粉料，每Ikg粉料接種400 - 600ml人參發(fā)酵酶液稀釋液；發(fā)酵包括升溫，蒸參和濃縮上清液，獲得人參發(fā)酵提取物。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的人參包括花旗參、三七參、高麗參、珠子參以及它們的葉和莖。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的人參是紅參。
4.如權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的菌液培養(yǎng)基是由2體積蔬果漿液加8體積蒸餾水配制而成。
5.如權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的人參發(fā)酵酶液的制備是采用梯度培養(yǎng)法進(jìn)行乳酸菌培養(yǎng)增殖，每個(gè)梯度培養(yǎng)環(huán)境為A.1 100 接種；B.36 0C ；C.6小時(shí)搖床培養(yǎng)；D.4個(gè)梯度；E.最后取IL菌液接種于9L果蔬培養(yǎng)液中。
6.如權(quán)利要求1所述方法，其中人參發(fā)酵酶液的冷藏溫度是4°C，人參發(fā)酵酶液稀釋液是以1體積人參發(fā)酵酶液加200體積甘草大棗液配制而成，所說(shuō)的甘草大棗液是在50L蒸餾水中加入4顆大棗和50g甘草片配制而成。
7.如權(quán)利要求1所述方法，其中人參粉和人參發(fā)酵酶液稀釋液的發(fā)酵在發(fā)酵室進(jìn)行， 溫度30°C，發(fā)酵8小時(shí)后，升溫至45°C，繼續(xù)發(fā)酵8小時(shí)，再升溫至65°C，發(fā)酵8小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的蒸參在發(fā)酵室進(jìn)行，溫度為75 85°C，時(shí)間是 72 120小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1所述方法，其中所說(shuō)的濃縮上清液是將蒸參后所得到的上清液濃縮至 1/10-1/100。
10.權(quán)利要求1一 9任一項(xiàng)方法制備的人參發(fā)酵提取物，其用于化妝品中。
全文摘要
一種發(fā)酵人參提取物的制備方法，包括人參發(fā)酵和提取物的制備，其中人參發(fā)酵步驟包括選取人參材料、制備人參發(fā)酵酶液，制備人參發(fā)酵酶液稀釋液接種和發(fā)酵，所說(shuō)的人參發(fā)酵酶液是利用各種蔬果高溫殺毒后配水制成菌液培養(yǎng)基，使用保加利亞乳酸菌進(jìn)行乳酸菌培養(yǎng)增殖接種至該菌液培養(yǎng)基，發(fā)酵1~2周后過(guò)濾留清液并封口，冷藏備用；接種是將選取的人參材料制成粉料，每1kg粉料接種400－600ml人參發(fā)酵酶液稀釋液；發(fā)酵包括升溫，蒸參和濃縮上清液，獲得人參發(fā)酵提取物。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102366373SQ20111034449
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:撫松參美化妝品有限公司