專利名稱：一種獲得神經(jīng)白細(xì)胞素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞分泌的新生化物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、檢測(cè)及鑒定的方法。
背景技術(shù)：
睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell, SCs)是由意大利人Enricol Sertoli于1865年在油鏡下首次發(fā)現(xiàn)，并以其名字命名。Sertoli認(rèn)為支持細(xì)胞是圍繞著生精細(xì)胞生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞，而這些上皮細(xì)胞具有保護(hù)生精細(xì)胞的功能(Griswold M.D, Morales C, SylvesterS.R.Molecular biology of the Sertoli cell[J].0xford Reviews of ReproductiveBiology,1988，10:124-161)。Sertoli還建立了支持細(xì)胞的染色方法，即通過(guò)用硝酸和乙酸甚至碘液進(jìn)行組織顯色觀察，獲得了較清晰的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。在Sertoli發(fā)現(xiàn)了支持細(xì)胞后，學(xué)者們展開了大量關(guān)于支持細(xì)胞的研究。在電子顯微鏡問(wèn)世以前，SCs —直被認(rèn)為是生精細(xì)胞的支架結(jié)構(gòu)，并作用于生精發(fā)生的各個(gè)階段從而促進(jìn)精子細(xì)胞的生成。近年來(lái)，研究表明了 SCs不僅為生精細(xì)胞提供合適的生理發(fā)育的微環(huán)境，還能提供促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和保護(hù)細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)攻擊的活性物質(zhì)和信號(hào)分子。至今，SCs的功能與調(diào)控作用還不完全清楚。神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell, NSCs)能在體外合適的生長(zhǎng)環(huán)境中增殖形成神經(jīng)球，同時(shí)保持高度未分化 的特性。1992年Reynolds等首次從成年鼠腦紋狀體中分離出神經(jīng)干細(xì)胞，并成功進(jìn)行體外培養(yǎng)。體外擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞克隆具有多分化潛能，并可以被誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)元(neuron),星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)及少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte)。神經(jīng)干細(xì)胞體外分化的技術(shù)為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、神經(jīng)系統(tǒng)病變及神經(jīng)退行性疾病的治療帶來(lái)希望。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化主要通過(guò)以下三個(gè)方面進(jìn)行:(I)將攜帶治療作用的目的基因的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植；(2)在神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境中添加特殊的細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)；(3)通過(guò)與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)定向分化至功能神經(jīng)元細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元等神經(jīng)終末端細(xì)胞的分化受控于基因的調(diào)節(jié)，即神經(jīng)干細(xì)胞向不同功能的神經(jīng)細(xì)胞定向分化時(shí)需要不同的基因進(jìn)行調(diào)控。NSCs 一直被利用來(lái)進(jìn)行外源移植治療神經(jīng)退行性疾病(NeurodegenerativeDiseases)，但是直接移植胚胎NSCs會(huì)有產(chǎn)生畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)。為保證移植安全，NSCs常在體外被誘導(dǎo)形成分化終末端的神經(jīng)細(xì)胞以后再進(jìn)行移植。SCs能夠提供多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和信號(hào)分子，在和NSCs共移植能促進(jìn)發(fā)育和干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。同時(shí)，SCs還能為共移植物提供局部免疫豁免效應(yīng)從而提聞了移植的效率。但是，目前現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于支持細(xì)胞是否能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)等方面還鮮有報(bào)道，也不清楚這種促進(jìn)作用是由哪些活性物質(zhì)所致。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素(NLK)的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的方法、本發(fā)明的另一目的還在于提供神經(jīng)白細(xì)胞素的一種新用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素(NLK)的方法，所述方法包括:培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞，從而分泌產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素。 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法包括:(I)采用含10±1% (v/v)血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞；(2)細(xì)胞貼壁(較佳地，70%以上細(xì)胞貼壁；更佳地，75%以上細(xì)胞貼壁；更佳地，80%或80%以上細(xì)胞貼壁)后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入無(wú)血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；和(3)步驟(2)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物取上清懸濁液，其中含有神經(jīng)白細(xì)胞素。在另一優(yōu)選例中，所述的血清是胎牛血清。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中，無(wú)血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)2-10天；較佳地2-8天；更佳地2.5-6天，如5天、4天、3天。在另一優(yōu)選例中，步驟⑴中，培養(yǎng)基中睪丸支持細(xì)胞的密度是IX IO4 IXlO6細(xì)胞/ml。在另一優(yōu)選例中，步驟(I)中，培養(yǎng)基中睪丸支持細(xì)胞的密度是2X IO4 8X IO5細(xì)胞/ml ;更佳地為4X IO4 6X IO5細(xì)胞/ml。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括:從睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)物中分離分泌產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素。在本發(fā)明的另一方面，提供一種促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞(作為飼養(yǎng)(層)細(xì)胞)，其分泌產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素；(b)在(a)的細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入神經(jīng)干細(xì)胞；使神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞混合，或使神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞不混合但發(fā)生胞間物質(zhì)交換；從而神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，所述的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)能力增強(qiáng)且軸突上突觸數(shù)目增加。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)包括:采用含10 ± I (v/v) %血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞；細(xì)胞貼壁(較佳地，70%以上細(xì)胞貼壁；更佳地，80%以上細(xì)胞貼壁；更佳地，90%以上細(xì)胞貼壁)后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中，睪丸支持細(xì)胞的密度是IXlO4 IX IO6細(xì)胞/ml (較佳地2X IO4 8X IO5細(xì)胞/ml ;更佳地為4X IO4 6X IO5細(xì)胞/ml);和/或步驟(b)中，神經(jīng)干細(xì)胞的密度是IX IO4 IX IO6細(xì)胞/ml (較佳地2X IO4 8 X IO5細(xì)胞/ml ;更佳地為4 X IO4 6 X IO5細(xì)胞/ml)。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中，通過(guò)滲透膜隔離神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞，使神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞不混合但發(fā)生胞間物質(zhì)交換。在另一優(yōu)選例中，所述的滲透膜是孔徑為0.m的膜。在另一優(yōu)選例中，所述的方法的步驟(b)之后還包括:分離所述的神經(jīng)干細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中，加入神經(jīng)干細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)2-10天(較佳地4-10天；更佳地5-9天，如6天、7天、8天)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種神經(jīng)白細(xì)胞素的用途，用于制備促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述組合物還用于增加神經(jīng)元上突觸數(shù)目。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、睪丸支持細(xì)胞鑒定。A:HE染色鑒定；B =DAPI熒光染色鑒定；C:掃描電子顯微鏡下10000倍放大效果圖。圖2A、神經(jīng)干細(xì)胞聚集體的形成。圖2B、熒光顯微鏡下觀察在第72h時(shí)形成的神經(jīng)球。圖3、神經(jīng)干細(xì)胞及其分化后神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定圖。A圖為分離培養(yǎng)第3代后NESTIN陽(yáng)性單細(xì)胞；B圖為DAPI細(xì)胞核熒染；C圖為A，B的合成圖；D圖為神經(jīng)干細(xì)胞分化成的神經(jīng)元(標(biāo)記beta TujIII) ;E圖由神經(jīng)干細(xì)胞分化而成的星形膠質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)記GFAP) ；F圖為神經(jīng)干細(xì)胞接種后培養(yǎng)第3天時(shí)形成的神經(jīng)球的NESTIN熒光照片(比例尺:30 u m) o圖4、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)至第一、三、五天時(shí)的形態(tài)變化(比例尺:30 U m)。A、B:第一天時(shí)為單細(xì)胞形態(tài)；C:第三天時(shí)的神經(jīng)球；D:第五天時(shí)的神經(jīng)球。圖5、在不同接種密度條件下神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)變化曲線。圖6、通過(guò)免疫熒光染色分析神經(jīng)干細(xì)胞分別在第I (A-C)，2 (D-F)，3 (G-1)代時(shí)的細(xì)胞純度變化。(A，D，G ):Nestin陽(yáng)性細(xì)胞；(B，E，H):DAPI核熒光染色；(C，F(xiàn)，I):復(fù)合圖。圖7、神經(jīng)干細(xì)胞在第一、二、三代時(shí)的純度變化。圖8、皮層神經(jīng)干細(xì)胞在分化培養(yǎng)基(DM)、條件培養(yǎng)基(CM)和支持細(xì)胞飼養(yǎng)層(Sertoli)培養(yǎng)時(shí)的存活率。當(dāng)培養(yǎng)至第7天時(shí)，存活率由臺(tái)盼藍(lán)染液染液檢測(cè)。圖9、SDS-PAGE檢測(cè)支持細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白條帶。圖10、UPLC-ES1-MS/MS分析結(jié)果中神經(jīng)白細(xì)胞素的鑒定結(jié)果(SEQ IDNO:19)。圖11、瓊脂糖凝膠電泳圖分析了在SCs中mRNA表達(dá)情況。圖12、三種培養(yǎng)模式在一、三、七天時(shí)軸突生長(zhǎng)狀態(tài)比較。圖13、在三種培養(yǎng)模式下第7天時(shí)的軸突生長(zhǎng)狀態(tài)。圖14、在三種培養(yǎng)模式下第7天時(shí)的軸突上突觸數(shù)目。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人致力于尋找新的在促進(jìn)神經(jīng)元分化過(guò)程中起作用的支持細(xì)胞活性物質(zhì)，通過(guò)將支持細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)這種培養(yǎng)促進(jìn)了神經(jīng)元分化，并且發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞分泌神經(jīng)白細(xì)胞素與這種神經(jīng)元分化的促進(jìn)具有關(guān)聯(lián)。產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素的方法由于過(guò)去并未在睪丸支持細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)白細(xì)胞素，本發(fā)明第一次揭示并驗(yàn)證了神經(jīng)白細(xì)胞素的存在。在鑒定、分析支持細(xì)胞分泌物時(shí)，采用將超濾管離心濃縮后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、洗脫后分辨出各區(qū)間的蛋白條帶。在將切下的蛋白條帶通過(guò)高效液相串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜分析方法初步得到胞外分泌蛋白種類的結(jié)果后，再利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)鑒定細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)白細(xì)胞素的mRNA表達(dá)。在確定該物質(zhì)在蛋白質(zhì)和核酸水平上均有表達(dá)后，分別在誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元培養(yǎng)環(huán)境中外源添加與拮抗該活性物質(zhì)后，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色分析法分析神經(jīng)元的生長(zhǎng)狀況。在神經(jīng)元培養(yǎng)物中單獨(dú)添加神經(jīng)白細(xì)胞素可以使得其存活率達(dá)到60%，顯著高于未添加的對(duì)照組。由于神經(jīng)白細(xì)胞素在胞外呈單體結(jié)構(gòu)并具有保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)及抗凋亡等作用，該物質(zhì)主要可作為外源添加劑用于神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)或神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病等過(guò)程中。本發(fā)明首先提供了一種產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素(NLK)的方法，所述方法包括:培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞，從而分泌產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，先將睪丸支持細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其良好地貼壁，然后再去除血清后(可通過(guò)采用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌來(lái)去除血清)，使用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)的時(shí)間通常在2-10天(較佳地2-8天；更佳地2.5-6天，如5天、4天)，從而獲得的培養(yǎng)物的上清中存在有神經(jīng)白細(xì)胞素。培養(yǎng)基中睪丸支持細(xì)胞的密度決定了其是否可以實(shí)現(xiàn)良好的貼壁，因此，本發(fā)明人優(yōu)化了接種細(xì)胞的密度，較佳地，培養(yǎng)基中睪丸支持細(xì)胞的密度是I X IO4 I X IO6細(xì)胞/ml ;更佳地，培養(yǎng)基中睪丸支持細(xì)胞的密度是2X IO4 8X IO5細(xì)胞/ml ;更佳地為4X IO4 6X IO5 細(xì)胞/ml。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括:從睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)物中分離分泌產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素。神經(jīng)白細(xì)胞素作為一種蛋白，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的或公知的許多技術(shù)來(lái)將之分離。例如但不限于:硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose離子交換、UltrogelAcA34凝膠過(guò)濾三步法純化；或采 用N1-1DA親和層析一步法純化。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是商業(yè)化的培養(yǎng)基，其中的成分可確保睪丸支持細(xì)胞良好地生長(zhǎng)。例如，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為已完全商業(yè)化的，例如是購(gòu)自Gibco公司的產(chǎn)品。本發(fā)明的方法產(chǎn)生的神經(jīng)白細(xì)胞素是產(chǎn)生自細(xì)胞的，因此其是一種天然的蛋白，保留了其原有的天然活性。促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞(作為飼養(yǎng)(層)細(xì)胞)，其分泌產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素；(b)在(a)的細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入神經(jīng)干細(xì)胞；使神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞混合，或使神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞不混合但發(fā)生胞間物質(zhì)交換；從而神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，所述的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)能力增強(qiáng)且軸突上突觸數(shù)目增加。由于促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的活性物質(zhì)是神經(jīng)白細(xì)胞素，其可被分泌表達(dá)于培養(yǎng)基中，因此所述的神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞之間可以隔離培養(yǎng)，兩者之間通過(guò)設(shè)置滲透膜來(lái)實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的交換，這種培養(yǎng)方式對(duì)于后續(xù)兩種細(xì)胞的分離是非常有利的。所述的滲透膜具有合適的微孔，從而使得兩種細(xì)胞不會(huì)穿透而它們所分泌產(chǎn)生的分子能夠穿透。例如，所述的滲透膜是孔徑約0.4 的膜。本發(fā)明首次揭示神經(jīng)白細(xì)胞素(neuroleukin)是支持細(xì)胞分泌的促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的活性物質(zhì)之一。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，為了驗(yàn)證支持細(xì)胞分泌的促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，通過(guò)總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄PCR驗(yàn)證了支持細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)白細(xì)胞素(NLK)的mRNA，并通過(guò)超高效液相串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜驗(yàn)證NLK存在于支持細(xì)胞上清液中。在支持細(xì)胞飼養(yǎng)層中外源添加抗神經(jīng)白細(xì)胞素抗體后，培養(yǎng)到第7天時(shí)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度減少到了 108 ym，與外源添加NLK的支持細(xì)胞直接共培養(yǎng)條件達(dá)到的176 ii m相比較要少得多，所以NLK對(duì)促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和提高神經(jīng)元存活率有很大的貢獻(xiàn)，是支持細(xì)胞分泌的一種重要活性物質(zhì)。因此，分化自皮層神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活率的提高都能夠由支持細(xì)胞所調(diào)節(jié)，并且發(fā)現(xiàn)由支持細(xì)胞分泌的神經(jīng)白細(xì)胞素(neuroleukin)起到了重要作用。這不僅能夠提供大量的可供移植治療用的神經(jīng)元來(lái)源，還能強(qiáng)化神經(jīng)元之間的相互作用，從而提高移植的效率。本發(fā)明的揭示為支持細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共移植治療神經(jīng)退行性疾病的方法奠定了理論基礎(chǔ)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、支持細(xì)胞的體外分離、傳代和鑒定1.睪丸組織支持細(xì)胞(SCs)的體外分離

支持細(xì)胞分離主要參照Welsh和Wiebe的方法(Welsh M.J, Wiebe J.P.Sertoli細(xì)胞 from immature rats:1n vitro stimulation of steroid metabolism by FSH[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 1976,69 (4):936-941),力口以改進(jìn)并在無(wú)菌條件下進(jìn)行，描述如下:首先將10-15天ICR雄鼠(中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，上海)拉頸處死，分離雄性ICR小鼠的雙側(cè)睪丸組織，在解剖鏡下操作剝?nèi)ブ窘M織與組織白膜，然后將生精小管剪碎成Imm3的小塊。用質(zhì)量體積比為0.2% I型膠原酶和0.2% (w/v)胰蛋白酶等體積混合在36.5°C恒溫水浴鍋內(nèi)消化30min，之后吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)過(guò)200目細(xì)胞篩過(guò)濾后靜置3min，棄上清液。用含10%% (v/v)FCS的DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(GIBC0，美國(guó)；除非另外說(shuō)明，該培養(yǎng)基中含有葡萄糖4.5g/L)重懸細(xì)胞，原代培養(yǎng)以5X IO5細(xì)胞/ml的高細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37°C，5% (v/v)CO2的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。同時(shí)，進(jìn)行差速貼壁lOmin，以除去培養(yǎng)液中的雜細(xì)胞，然后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并作PO代細(xì)胞，之后傳代細(xì)胞稱為Pl，P2......代。2.支持細(xì)胞的傳代觀察培養(yǎng)48h的細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞生長(zhǎng)接近80%覆蓋瓶底時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代培養(yǎng)。首先將細(xì)胞培養(yǎng)液吸取棄掉，用0.1M PBS溶液清洗2遍，加入0.2% (w/v)的胰蛋白酶液進(jìn)行消化3min，當(dāng)觀察細(xì)胞基本懸浮后，立即補(bǔ)充2ml培養(yǎng)液(含10% (v/v)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行緩慢吹打瓶底，將全部細(xì)胞吹起后收集進(jìn)行800rpm離心3min。去上清液后再次補(bǔ)加培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞重懸，計(jì)數(shù)后在CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
3.支持細(xì)胞的鑒定方法(1)蘇木精伊紅(Hematoxylin-Eosine, HE)染色支持細(xì)胞鑒定采用HE染色方法。即將細(xì)胞放入二甲苯液中10min、95% (v/v)乙醇溶液2min、80% (v/v)乙醇2min、75% (v/v)乙醇2min，然后在完全脫水后用蘇木精染液染色lOmin，流水稍微清洗3s洗掉表面殘留大量的蘇木精染色液。將細(xì)胞放入I % (v/v)鹽酸乙醇3s后再次用清水漂洗30s,然后在伊紅染液中浸泡3min,依次浸入75% (v/v) >80%(v/v) >95% (v/v)和無(wú)水乙醇中浸泡各5min,再在二甲苯中脫水5min后用中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。(2)掃描電子顯微鏡觀察將玻片上游離細(xì)胞用0.1M PBS清洗I遍，用0.1M PBS配制的2.5% (w/v)戊二醒固定液在4°C條件下預(yù)固定。1% (w/v)鋨酸在4°C條件下固定Ih,之后用0.1MPBS漂洗3次，5min/次。后采用梯度乙醇(按照體積分?jǐn)?shù)分別為:30%、50%、70%、85%和100% )進(jìn)行逐步脫水，在4°C條件下晾干。噴鍍金后在掃描電子顯微鏡下觀察。4.細(xì)胞生長(zhǎng)參數(shù)分析活細(xì)胞計(jì)數(shù):胎盤藍(lán)染色液染色鑒定細(xì)胞活性，同時(shí)由血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))X 100% ；支持細(xì)胞純度=支持細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)X100%。生長(zhǎng)曲線分析:將傳代至P2代的細(xì)胞以3種不同細(xì)胞密度(0.5X IO5細(xì)胞/ml，2 X IO5細(xì)胞/ml，5 X IO5細(xì)胞/ml)接種于25mm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每隔6h取每組3孔的細(xì)胞分別計(jì)數(shù)。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后通過(guò)EXCEL軟件作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。5.統(tǒng)計(jì)分析方法數(shù)據(jù)用平均數(shù)(X—)表示，應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析的多重比較。6.結(jié)果睪丸支持細(xì)胞顯著結(jié)構(gòu)特征是雙核仁結(jié)構(gòu)。分離自小鼠睪丸組織的支持細(xì)胞在體外培養(yǎng)后分別通過(guò)蘇木精伊紅染色、DAPI核熒光染色和電子顯微鏡進(jìn)行觀察鑒定。蘇木精伊紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見分離的支持細(xì)胞胞體為寬大的柱狀及典型的雙核仁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核呈卵圓或不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)有可見透明的小空泡結(jié)構(gòu)(圖1A);同時(shí)，通過(guò)DAPI進(jìn)行細(xì)胞核熒光核染后，同樣能夠清晰看到雙核仁典型結(jié)構(gòu)(圖1B)。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察支持細(xì)胞的外形結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在支持細(xì)胞表面有大量粗大的突觸(圖1C)，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，該大量的突觸可能與支持細(xì)胞吞噬細(xì)胞殘片和貼壁生長(zhǎng)等生理作用有關(guān)。在新制備的支持細(xì)胞懸液經(jīng)胎盤藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)后得到的細(xì)胞存活率達(dá)93%以上，每只睪丸組織大約可獲得支持細(xì)胞I X IO6-1 X IO7個(gè)。培養(yǎng)24小時(shí)后，小鼠睪丸支持細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)體積不斷增大呈不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)呈現(xiàn)梭狀胞體。綜上，成功分離和鑒定了小鼠睪丸支持細(xì)胞。通過(guò)HE染色和DAPI核熒光染色進(jìn)行觀察，表明分離的細(xì)胞具有典型雙核結(jié)構(gòu)，即鑒定為支持細(xì)胞。實(shí)施例2、胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定1.胚胎皮層神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分離方法孕齡14天ICR孕鼠1只，在其腹部用75% (v/v)乙醇噴灑消毒，剪開腹部皮膚肌肉后暴露其腹腔及子宮，迅速分離出胎鼠，放入盛有加入I % (w/v)青霉素和鏈霉素的0.1MPBS溶液中，移入超凈臺(tái)，將胎鼠在新皿內(nèi)清洗后再轉(zhuǎn)入另一皿內(nèi)浸泡5min。按以下操作在無(wú)菌條件下完成取出胎鼠皮層腦組織的一系列操作:a.從腦前額邊緣揭腦膜；b.挑取一側(cè)腦皮層放置在裝有0.1M PBS溶液中；c.用鑷子撕碎組織；d.加入等量胰蛋白酶液在37 °C條件下消化30min。準(zhǔn)備15ml無(wú)菌離心管,加4ml洗液與I滴FCS準(zhǔn)備終止消化，吸出皿內(nèi)組織后在800rpm條件下離心3min。上清做廢液處理后再加7ml洗液清洗(期間準(zhǔn)備血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))，離心完后按分離細(xì)胞數(shù)量加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。以1父105細(xì)胞/1111密度接種細(xì)胞在371:，5% (v/v)CO2恒溫培養(yǎng)箱中`培養(yǎng)。2.皮層神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)觀察皮層神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，神經(jīng)球邊緣清晰且懸浮生長(zhǎng)。吸出細(xì)胞懸液以800rpm離心3min。棄上清后，以Iml 0.2% (w/v)胰蛋白酶液吸出細(xì)胞后置于37°C CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育消化3min。吸出細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至終止液內(nèi)輕柔吹打后繼續(xù)以800rpm離心3min。再次棄上清后以2ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。3.免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色方法將神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)以合適的密度接種在涂有多聚賴氨酸的12孔板內(nèi)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈圓形或有1-2個(gè)觸角伸出。按以下步驟進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色操作:在每孔中補(bǔ)加適量0.1M PBS清洗，搖床上搖勻IOmin ;吸取PBS棄掉，補(bǔ)加4%多聚甲醛在4°C條件下固定Ih ;吸取多聚甲醛溶液補(bǔ)加PBS適量清洗IOmin ;補(bǔ)加500iUl%的PBST常溫孵育，搖勻30min;0.0lMPBS清洗后用含5% (v/v)山羊血清(BIOffEST)溶液封閉30min。用稀釋液稀釋一抗鼠源Nestin (I: 200, SANTA CRUZ)在4°C條件下孵育細(xì)胞過(guò)夜，回收一抗后用0.1M PBS清洗，同樣由0.3% (v/v) PBST配制含3%(v/v)山羊血清溶液避光按1: 100稀釋羊抗鼠熒光二抗(Jackson，美國(guó))，每孔加200 ill在4°C條件下孵育lh。用PBS清洗后避光保存，同時(shí)也可以在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。對(duì)于成熟神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光染色步驟基本同上，不同之處在于用鼠源一抗PTujIIId: 2000，Sigma)孵育成熟神經(jīng)元細(xì)胞，用鼠源一抗GFAP (I: 1000，Sigma)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞。4.統(tǒng)計(jì)分析方法數(shù)據(jù)用平均數(shù)(x")表示，應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析的多重比較。5.結(jié)果(I)皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離及鑒定如上方法對(duì)ICR孕鼠進(jìn)行皮層神經(jīng)干細(xì)胞的分離。體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)單純機(jī)械吹打和加0.2%胰蛋白酶消化得到的單細(xì)胞懸液含有較多的未完全消化的組織塊，如經(jīng)培養(yǎng)后會(huì)聚集周圍單細(xì)胞形成聚集體(Aggregation),而并非由單細(xì)胞增殖形成的神經(jīng)球(圖2A)。由于聚集體會(huì)導(dǎo)致團(tuán)塊內(nèi)部的細(xì)胞因無(wú)法取得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而逐漸衰老死亡，因此聚集體越少越好。如果利用較高濃度的胰酶液進(jìn)行消化細(xì)胞或者時(shí)間延長(zhǎng)后得到的單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)則容易在培養(yǎng)3天后出現(xiàn)成片的絮狀物，可能是細(xì)胞因消化程度過(guò)度而死亡引起的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:0.2% (w/v)胰蛋白酶消化液消化3min為最佳，傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在36h可觀察二分裂細(xì)胞形態(tài)，在72h后會(huì)出現(xiàn)多于10個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)球(圖2B)。細(xì)胞鑒定以其生物標(biāo)記物鑒定是一種高效方法之一，如Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的特征物質(zhì)之一(丁道芳，邢三麗，周鳴鳴，宋后燕.大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞單克隆化及單層化培養(yǎng)和鑒定[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36 (I):72-76)，P TujIII是神經(jīng)元細(xì)胞重要生物標(biāo)記物之一 (Hill E.Jjffoehrling E.K,Prince M,Coleman M.D.Differentiatinghuman NT2/D1 neurospheres as a versatile in vitro3D model system fordevelopmental neurotoxicity testing[J].Toxicology,2008, 249:243-250), GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞生物標(biāo)記物之一(Sakuragawa N, ThangavelR, Mizuguchi M, Hirasawa M,Kamo 1.Expression of markers for both neuronal and glial 細(xì)胞 in human amnioticepithelial 細(xì)胞[J].Neuroscience Letters, 1996, 209:9_12)。因此，皮層神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定可以形成的神經(jīng)球或分散的神經(jīng)單細(xì)胞通過(guò)Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色來(lái)實(shí)現(xiàn)。取分化培養(yǎng)液中孵育3天后的混合細(xì)胞經(jīng)NestiruGFAP和P -TujIII等特征生物標(biāo)記物的免疫熒光染色分析對(duì)分化細(xì)胞中星形膠質(zhì)細(xì)胞和成熟神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定。由圖3可知:神經(jīng)干細(xì)胞不論在單細(xì)胞形態(tài)還是處在神經(jīng)球形態(tài)都會(huì)大量表達(dá)Nestin特征蛋白，并在熒光二抗的作用下顯 示出綠色熒光。在分化培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化作用下，這些細(xì)胞失去了原先的干細(xì)胞特性不再表達(dá)Nestin，并且向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞方向開始分化。結(jié)果顯示了干細(xì)胞的多分化潛能的特性。因此，本實(shí)施例中分離獲得的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞，并可分化為神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。(2)皮層神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察在倒置相差顯微鏡下可見接種的單細(xì)胞形態(tài)圓潤(rùn)，折光性好，且胞體較小。培養(yǎng)至第3天結(jié)束時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞基本處于10個(gè)細(xì)胞克隆組成的神經(jīng)球和簡(jiǎn)單較小的神經(jīng)球。培養(yǎng)至第5天，活力不強(qiáng)的單細(xì)胞或神經(jīng)球在個(gè)體大小的指標(biāo)上會(huì)明顯小于活力較強(qiáng)的神經(jīng)球，正常的神經(jīng)球會(huì)有50個(gè)以上的神經(jīng)細(xì)胞組成并懸浮生長(zhǎng)于培養(yǎng)基中(圖4)。在原代PO傳代培養(yǎng)后，傳代周期可由原代PO的5天縮短至4天，因?yàn)殡S著細(xì)胞純度提高，獲得細(xì)胞的速率也隨之增加。(3)皮層神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與細(xì)胞純度分析原代胎鼠來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞接種密度以三種初始密度(5X IO5細(xì)胞/ml，IX IO5細(xì)胞/ml，0.5 X IO5細(xì)胞/ml)進(jìn)行接種，培養(yǎng)至第5天時(shí)的結(jié)果如圖5。IXlO5細(xì)胞/ml的接種密度培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)第5天時(shí)，每個(gè)神經(jīng)球所含神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目最高可達(dá)50個(gè)以上。如果以5 X IO5細(xì)胞/ml較高的密度接種，在第2天時(shí)培養(yǎng)液已經(jīng)變黃，需頻繁消化重懸培養(yǎng)，而過(guò)于頻繁的操作會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)活性下降。同時(shí)，已經(jīng)形成的神經(jīng)球老化速度也將增加，單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況也開始下降。若以衰老的神經(jīng)球進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到的細(xì)胞因增殖活力不佳開始逐漸死亡。因?yàn)闄C(jī)械吹打細(xì)胞不能保證神經(jīng)球分散均勻，所以加入胰酶消化后可減少傳代過(guò)程中神經(jīng)球的數(shù)目。因此，以IX IO5細(xì)胞/ml的接種密度培養(yǎng)為較佳。通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色法將Nestin陽(yáng)性的NSCs標(biāo)記后計(jì)數(shù)，接著利用DAPI核熒光染色標(biāo)記視野內(nèi)所有的細(xì)胞，并計(jì)細(xì)胞總數(shù)，最后利用公式(神經(jīng)干細(xì)胞純度=Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI熒光染色的細(xì)胞數(shù)X 100% )計(jì)算出神經(jīng)干細(xì)胞的純度。隨著傳代過(guò)程中，不斷收集生長(zhǎng)活性較強(qiáng)的神經(jīng)球，使得細(xì)胞碎片和活性低的神經(jīng)細(xì)胞所占比例越來(lái)越低，從而提高了高活性的神經(jīng)干細(xì)胞的比例。在第一和第二代時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞的比例分別是36%和74%，而最終神經(jīng)干細(xì)胞的比例在第3代時(shí)達(dá)到92% (圖6，圖7)。綜上，本實(shí)施例采用機(jī)械分離法和酶消化法分離NSCs，獲得的NSCs存活率為92%。剛分離得到的細(xì)胞呈圓形表面光滑無(wú)突起，體積較大，邊界清楚并且折光性強(qiáng)。接種3天后可形成較小的神經(jīng)球，培養(yǎng)至第5天時(shí)單個(gè)神經(jīng)球能達(dá)到50個(gè)以上的單細(xì)胞，此時(shí)開始進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后得到的單細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)再次形成神經(jīng)球的方式與形成時(shí)間及形態(tài)均與原代相似，并且在細(xì)胞表面特異性抗原蛋白Nestin檢測(cè)仍然呈陽(yáng)性，證明了神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中仍然保持干細(xì)胞特性并具有很強(qiáng)的增殖能力。實(shí)施例3、大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞與支持細(xì)胞共培養(yǎng)及活性物質(zhì)鑒定1.培養(yǎng)液配制神經(jīng)干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基(液):pH為7.4的IOOml高糖DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加終濃度為20ng/mlbFGF、20ng/ml EGF、 質(zhì)量體積比分別為I % N2、I % B27、I % Gln和I %青霉素/鏈霉素(P/S)。消化終止液:IOml高糖DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加I滴胎牛血清。0.3% (v/v) PBST 溶液:在97ml 0.1M PBS溶液中添加3ml TritonlOO，在40°C水浴條件下溶解3h?？贵w封閉液:在0.3% PBST溶液中添加5% (v/v)的山羊血清，混勻后在室溫條件下使用?？贵w稀釋液:在0.3% PBST溶液中添加3%的山羊血清后可用于稀釋一抗和二抗。分化培養(yǎng)基(DifferentiationMedia, DM):在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM: F12(l: I)高糖培養(yǎng)基；購(gòu)自Gibco)中添加1%FCS，1%B27,1% N2 和 1% Gln ；DEPC 水:在IL水中添加Iml DEPC進(jìn)行攪拌過(guò)夜，第二天將DEPC水進(jìn)行120°C條件下高溫高壓處理，可與4°C條件下保藏。支持細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)基(Conditioned Medium, CM),制備如下:正常條件下，支持細(xì)胞在含10 %胎牛血清(fetal calf serum, FCS)的DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中培養(yǎng)增殖，但在無(wú)血清的DMEM: F12(l: I)的培養(yǎng)條件下支持細(xì)胞是不能存活的，支持細(xì)胞貼壁稀疏的區(qū)域在24h后開始變形萎縮成細(xì)長(zhǎng)的竹葉狀，貼壁稠密區(qū)域整片細(xì)胞24h后開始有卷曲脫離培養(yǎng)瓶的現(xiàn)象。同樣只在神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)增殖液中的原代支持細(xì)胞也是無(wú)法存活的,但原代支持細(xì)胞可以在含0.1% “胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒”這個(gè)物質(zhì)的DMEM: F12(l: I)的培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)增殖[Yue F, Cui L, Johkura K, Ogiwara N, Sasaki K.1nduction ofmidbrain dopaminergic neurons from primate embryonic stem cells by coculturewith sertoli cells [J] Stem Cells，2006，24:1695-1706]。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將分離下來(lái)的傳代至第3代的支持細(xì)胞消化后重懸于含10% FCS的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并以5X IO5細(xì)胞/ml的密度接種5ml在25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48小時(shí)，待支持細(xì)胞鋪滿瓶底80%的面積(即80%貼壁)后，吸去含血清培養(yǎng)基，用DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，補(bǔ)加無(wú)血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基孵育3天，然后再取出上清懸濁液進(jìn)行離心，2000rpm離心IOmin后，去除細(xì)胞的上清液即為支持細(xì)胞條件培養(yǎng)基，可-20°C冷凍保存或用于分析其中的化學(xué)或生物學(xué)成分。2.支持細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞直接共培養(yǎng)支持細(xì)胞懸于含10%胎牛血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以5X IO4細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度在12孔板中按每孔500 u I接種SCs細(xì)胞，待培養(yǎng)I天后95%以上細(xì)胞貼壁良好，用無(wú)血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗以去除血清3次；同時(shí)，將神經(jīng)干細(xì)胞懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并以5 X IO4細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種500 ill至飼養(yǎng)層上進(jìn)行共培養(yǎng)。在第3天，第6天和第10天時(shí)取樣觀察樣品與陽(yáng)性對(duì)照樣品之間的差別。陽(yáng)性對(duì)照:將神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)方法同上。3.Transwell 孔板培養(yǎng)Transwell滲透膜的應(yīng)用能夠說(shuō)明支持誘導(dǎo)干細(xì)胞分化和促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)是因?yàn)镾Cs分泌的活性蛋白還是由于細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸導(dǎo)致的。用添加了質(zhì)量體積比為I %谷氨酰胺(Gln)和I %P/S的DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基，將懸浮的NSCs以5X IO4細(xì)胞/ml密度接種在涂有左旋多聚賴氨酸的12孔板底部，SCs以5 X IO5細(xì)胞/ml密度接種在有0.4 ii m膜的嵌套內(nèi)進(jìn)行37 °C、含5 % (v/v) C02_95 %(v/v)空氣的條件下培養(yǎng)。

4.條件培養(yǎng)基孵育神經(jīng)干細(xì)胞將在含10%胎牛血清(FCS)的DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的支持細(xì)胞以無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗后重懸于DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3天后收集培養(yǎng)液，迅速離心取上清作為支持細(xì)胞條件培養(yǎng)基，待用。以I X IO5細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度將重懸于條件培養(yǎng)基中的神經(jīng)干細(xì)胞接種5ml于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)3天可取樣觀察并檢測(cè)。5.分化培養(yǎng)基孵育神經(jīng)干細(xì)胞以IX IO5細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度將重懸于分化培養(yǎng)基中的神經(jīng)干細(xì)胞接種5ml于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。從第二天起可取樣觀察以及檢測(cè)。6.細(xì)胞免疫熒光染色分析為了檢測(cè)細(xì)胞中存在的特定蛋白的分布，皮層神經(jīng)干細(xì)胞以接種密度5X IO4細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在左旋多聚賴氨酸涂布的6孔板上再37°C、含5% C02-95%空氣的條件下，用無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在Transwell嵌套上接種SCs，然后于第2天將其放置在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，共培養(yǎng)系統(tǒng)中的培養(yǎng)液換成DMEM: F12(l: I)高糖培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)72h的誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程后，用4%多聚甲醛在4°C條件下固定分化的神經(jīng)細(xì)胞 30min后，用 0.0lM PBS (phosphate buffered saline)洗漆 5min,再用 1% (v/v)PBST孵育30min (在PBS中添加1% Triton-100)，接著PBS清洗3次，每次5min，再用含5%山羊血清的0.3%的PBST孵育30min，然后分別添加小鼠源單克隆抗體0TujIII(l: 2000稀釋；Sigma-Aldrich Inc.)和兔源單克隆抗體 GFAP (1: 300 稀釋；Santa Cruz BiotechnologyInc.)在4°C條件下進(jìn)行孵育過(guò)夜。第2天用0.01M PBS清洗細(xì)胞5分鐘后，進(jìn)行熒光二抗突染(抗小鼠 IgG, 1: 200 稀釋；抗兔 IgG, 1: 200 稀釋，Jackson Immuno-ResearchLaboratories Inc.)在室溫，避光條件下染色2h，然后用0.0lM PBS清洗細(xì)胞3次后(每次5分鐘),利用DAPI (I u g/ml, 4,6-diamidino-2-pheny I indole)在避光條件下進(jìn)行細(xì)胞核熒光染色?？贵w的特異性利用表達(dá)相關(guān)蛋白的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞克隆只包含已染色的細(xì)胞。為了檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比率，隨機(jī)選取不同分化階段的細(xì)胞克隆進(jìn)行免疫染色并在核染計(jì)數(shù)所有細(xì)胞后計(jì)算陽(yáng)性率。7.細(xì)胞存活率分析在不斷酶消化和傳代后，皮層神經(jīng)干細(xì)胞的存活率通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行染色分析。有形態(tài)缺陷的或者不完整的細(xì)胞膜的細(xì)胞不能抵御臺(tái)盼藍(lán)染液的侵染，從而胞體變成藍(lán)色。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。8.總 RNA 提取和 RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR)反應(yīng)細(xì)胞總RNA 通過(guò) TRIzol 試劑盒(Invitrogen,http://www.1nvitrogen.com)進(jìn)行提取。提取的RNA純度通過(guò)紫外光譜成像系統(tǒng)(UV-spectrophotometer)進(jìn)行分析。總RNA提取操作如下:(I)用1ml Trizol溶解細(xì)胞沉淀后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管內(nèi)靜置5min ；(2)向EP管內(nèi) 添加0.2ml氯仿，上下震蕩15s，靜置2min后在冷凍離心機(jī)中以12000rpm 速率離心 12min ；(3)分層后取出上清RNA水相層溶液并轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管內(nèi)，加入等體積異丙醇沉淀核酸，混勻后于室 溫下靜置lOmin，之后再在冷凍離心機(jī)中以12000rpm速率離心lOmin，離心結(jié)束可見側(cè)壁和底部有少許沉淀，去上清并以75%乙醇溶液洗滌I次；(4)洗滌后在冷凍離心機(jī)中以12000rpm速率離心5min，棄上清后室溫下晾干，最后視RNA提取量加入10-15 ill無(wú)RNase的DEPC水。溶解后可在紫外分光光度計(jì)下在260nm條件下測(cè)OD值。利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara Shuzo, Japan)將5u g RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。每份cDNA與設(shè)計(jì)的特定引物(表I)和Taq DNA聚合酶(Takara)混合后進(jìn)行RT-PCR分析，之后反應(yīng)產(chǎn)物在含1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。反轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)體系:25 ii I 體系中添加 5 ii I 5 X bufferUO u I dNTPU U RNase抑制液、Iu I反轉(zhuǎn)錄酶和8iU DEPC水。將樣品混勻后，在如下設(shè)定程序下進(jìn)行:42°C，90min，95°C IOmin然后4°C 5min。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液于_20°C保存。PCR反應(yīng):在25 ill反應(yīng)體系中，有4 ill dNTP、正反引物各2 yl、LA-TaqDNA聚合酶0.5 ii 1、反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)液3 ill和DEPC水13.5 ill。樣品混勻后，在如下設(shè)定程序下進(jìn)行:95V 5min、94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin、72°C 7min、4°C 5min，其中第 2 步到到第 4 步之間循環(huán)次數(shù)為30次。反應(yīng)結(jié)束后直接進(jìn)行核酸凝膠電泳分析。表1、基因和引物設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.種產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素的方法，其特征在于，所述方法包括:培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞，從而分泌產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)采用含10±1%(v/v)血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞； (2)細(xì)胞貼壁后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入無(wú)血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；和 (3)步驟(2)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物取上清懸濁液，其中含有神經(jīng)白細(xì)胞素。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，無(wú)血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)2-10天。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，培養(yǎng)基中睪丸支持細(xì)胞的密度是 I X IO4 I X IO6 細(xì)胞 /ml。
5.種促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的方法，其特征在于，所述方法包括: (a)培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞，其分泌產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素； (b)在(a)的細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入神經(jīng)干細(xì)胞；使神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞混合，或使神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞不混合但發(fā)生胞間物質(zhì)交換；從而神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，所述的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)能力增強(qiáng)且軸突上突觸數(shù)目增加。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于， 步驟(a)包括:采用含10 ± I (v/v) %血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞；細(xì)胞貼壁后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于， 步驟(a)中，睪丸支持細(xì)胞的密度是I X IO4 I X IO6細(xì)胞/ml ;和/或 步驟(b)中，神經(jīng)干細(xì)胞的密度是I X IO4 I X IO6細(xì)胞/ml。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，通過(guò)滲透膜隔離神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞，使神經(jīng)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞不混合但發(fā)生胞間物質(zhì)交換。
9.種神經(jīng)白細(xì)胞素的用途，用于制備促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的組合物。
10.權(quán)利要求9所述的用途，所述組合物還用于增加神經(jīng)元上突觸數(shù)目。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種獲得神經(jīng)白細(xì)胞素的方法。本發(fā)明人通過(guò)將支持細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)這種培養(yǎng)促進(jìn)了分化后神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)以及提高了神經(jīng)元的存活率，并且發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞分泌神經(jīng)白細(xì)胞素與這種對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)與存活的促進(jìn)具有關(guān)聯(lián)。因此，可應(yīng)用支持細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生神經(jīng)白細(xì)胞素，以及應(yīng)用支持細(xì)胞來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)與存活。
文檔編號(hào)C12N5/0793GK103088092SQ201110332380
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者郭美錦, 鄧?yán)? 張嗣良, 儲(chǔ)炬, 莊英萍 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)