專利名稱：一種以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，屬于食品酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低聚果糖(Fructooligosaccharides)，簡稱F0S，又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式為G-F-Fn，n=l 3 (G為葡萄糖，F(xiàn)為果糖)。它是由蔗糖和1 3個果糖基通過 β-2-1糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。工業(yè)上一般由蔗糖經(jīng)果糖基轉(zhuǎn)移酶(Fruetosyltransferase，EC 2.4. 1.9，F(xiàn)TS)的轉(zhuǎn)糖基作用而生成低聚果糖，其酶促反應(yīng)機理如下
低聚果糖(FOS)是一種功能性低聚糖，其特點是低熱量、低甜度，可以促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、 改善腸道菌群、抗齲齒、降血脂等，其作為功能性因子被廣泛應(yīng)用于食品中，如奶制品、飲料、糖果糕點、肉類加工品等。目前國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)FOS的技術(shù)多為液體深層發(fā)酵法，該法的缺點是產(chǎn)酶菌絲體只能利用一次，在FOS生產(chǎn)過程中，由于菌絲體及其培養(yǎng)基成分的存在并參與反應(yīng)，使整個工藝繁雜，成本高。將酶固定化以后可以提高酶的使用效率，降低生產(chǎn)成本，傳統(tǒng)的固定化方法有包埋法、吸附法、交聯(lián)法等，但這些方法都有一定的不足之處， 固定化效率低、酶分子容易泄漏、操作穩(wěn)定性低等。有序介孔分子篩是一種近年來研究比較多的分子材料，由于其孔道規(guī)則，結(jié)構(gòu)有序，熱穩(wěn)定性好，且擁有較高的比表面積以及較強的吸附能力，其孔道中可組裝多種物質(zhì)而改變理化性能。因此，有序介孔材料在多相催化、大分子吸附及酶的固定化方面上應(yīng)用廣泛。近年來，MCM-41，MCM-48和SBA-15等有序材料在生物化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。 已有文獻(xiàn)報道了以介孔分子篩作為生物大分子固定的新型載體，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、 脂肪酶、過氧化物酶等，獲得了較好的固定化效果。并其中SBA-15是一種孔道結(jié)構(gòu)的分子篩，其孔道直徑在5-30nm可調(diào)，無生理毒性，穩(wěn)定性好，其表面有大量的羥基，可以吸附酶蛋白，可應(yīng)用于酶的固定化，但是單獨依靠吸附作用結(jié)合的酶容易泄漏，穩(wěn)定性差，因此還需其他步驟改進(jìn)。殼聚糖(chitosan)是甲殼素(chitin)脫乙?；漠a(chǎn)物，是一種天然高分子生物材料，生物相容性較好、易生物降解，且無毒、廉價易得。其結(jié)構(gòu)由大部分2-氨基-2-脫氧-β -D葡萄糖單元和少量N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-β -D-葡萄糖單元以β -1，4糖苷鍵連接形成，相對分子質(zhì)量為幾十萬到上百萬左右。殼聚糖分子中的羥基和氨基可以通過離子鍵、氫鍵及范德華力而吸附蛋白質(zhì)，通過殼聚糖吸附法固定化酶應(yīng)用廣泛。殼聚糖本身也是一種多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此可以將吸附了蛋白質(zhì)的SBA-15再與殼聚糖結(jié)合，使固定化顆粒再次吸附在殼聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，達(dá)到雙重吸附固定化酶。但是僅靠吸附作用固定化酶蛋白，酶分子容易脫落，因此可以加入雙功能基團試劑，如戊二醛等，進(jìn)一步交聯(lián)。由于殼聚糖分子中含有游離的氨基，通過化學(xué)交聯(lián)劑很容易與酶發(fā)生間接共價結(jié)合，此外酶與酶之間也可以通過這種雙功能試劑進(jìn)一步交聯(lián)，使酶分子更穩(wěn)固地固定在載體上。本發(fā)明即通過上述雙重吸附-交聯(lián)法固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶得到固定化顆粒，經(jīng)研究證明該方法步驟簡單易操作，條件溫和，且可以獲得較高的酶活回收率、蛋白吸附率、重復(fù)利用率以及穩(wěn)定性，可用于高純度低聚果糖的生產(chǎn)，具有一定的實際應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種以介孔分子篩為載體材料固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法， 該方法操作簡單，所得蛋白吸附率和酶活回收率較高，酶活回收率可達(dá)75%以上，蛋白吸附量可超過350mg蛋白/g SBA-15，其pH穩(wěn)定性與溫度穩(wěn)定性都優(yōu)于游離酶，固定化酶重復(fù)利用10次后酶活仍保留70%以上，該固定化酶在4°C條件下儲存60天后酶活仍保持的85% 以上。本發(fā)明的技術(shù)方案一種以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，先以介孔分子篩SBA-15為載體，將酶蛋白吸附于該載體上，再加入殼聚糖以及雙功能試劑戊二醛進(jìn)一步吸附并交聯(lián)，通過兩步吸附-交聯(lián)法進(jìn)行了果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化，使酶分子牢固地固定于載體上，步驟如下
(1)載體吸附酶蛋白將總酶活300-400U果糖基轉(zhuǎn)移酶用18mL50mM、pH 5. 0-7. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液稀釋，再與30-50mg的介孔分子篩SBA-15混合后，置于恒溫振蕩器中， 室溫下以恒定轉(zhuǎn)速振蕩吸附2- ；
(2)吸附-交聯(lián)取ImL質(zhì)量濃度為1.0%-3. 0%的殼聚糖1%冰醋酸溶液，加入到步驟 (1)所得固定化酶體系中；隨后再加入ImL質(zhì)量濃度為0. 5%-2. 5%的雙功能試劑戊二醛水溶液，置于恒溫振蕩器中震蕩2-6h，取出，高速離心機離心5-lOmin，除去未固定化部分，轉(zhuǎn)移上清液，用50mM pH5. 0-7. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液洗滌沉淀，再次離心，用上述檸檬酸-磷酸緩沖液重復(fù)洗滌3次，即制得產(chǎn)品以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，儲藏于4°C冰箱中備用。所述的介孔分子篩SBA-15，其孔徑大小為6-lOnm。所得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活回收率達(dá)75%以上，蛋白吸附量超過350mg蛋白 /g載體，固定化酶重復(fù)利用10次后酶活仍保留70%以上，在4°c條件下儲存60天后酶活仍保持85%以上。果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活及蛋白含量的測定
游離果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的測定方法取一定體積、底物濃度為10%(W/v)的0.05M、 pH5. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液于直徑50mm、體積IOOmL的恒溫夾套酶反應(yīng)器中，50°C下恒溫攪拌反應(yīng)60min，于沸水中煮沸IOmin后終止反應(yīng)。一個酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 ymol蔗果三糖(1-kestose)。糖組分測定的方法HPLC(高效液相色譜)法HPLC，AgilentllOO系列，配有Siodex RI-101示差折光檢測器和M 740數(shù)據(jù)處理器；色譜柱，Shodex Asahipak NH2P_50 ；流動相為乙睛/水65/；35 (v/v)，流速lmL/min ；溫度30°C ；進(jìn)樣量10 μ L。
固定化酶活測定方法同游離果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測定方法。固定化酶活回收率(%)=[固定化酶活力/加入酶總活力]X 100%。蛋白含量測定方法
考馬斯亮藍(lán)染色法將待測溶液稀釋一定倍數(shù)后，加6mL 10%的考馬斯亮藍(lán)染色劑，放置aiiin后在595納米處測定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出蛋白質(zhì)濃度，并計算吸附的蛋白量。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以介孔分子篩SBA-15為基礎(chǔ)的固定化載體，設(shè)計了一種適合果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化方法，固定化過程簡單，條件溫和，成本較低，相對于傳統(tǒng)的固定化方法，酶活回收率以及蛋白吸附量已經(jīng)達(dá)到較高的水平，可重復(fù)利用次數(shù)較多，酶的穩(wěn)定性也較好，可應(yīng)用于低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，本發(fā)明的保護(hù)不限于此。實施例1
準(zhǔn)確稱取30mg介孔分子篩SBA-15，加入18mL用50mM pH5. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液稀釋的果糖基轉(zhuǎn)移酶(總酶活400U)，置于恒溫振蕩器(150rpm)中室溫(約15°C )振蕩濁， 加入ImL濃度1. 0%的殼聚糖(預(yù)先溶于1. 0%的冰醋酸)，再加入ImL濃度2. 5%的戊二醛水溶液，置于恒溫振蕩器中震蕩4h，4000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清液，用50mM pH5. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液洗滌沉淀，以除去殘余的戊二醛及未固定的酶蛋白，再次離心，重復(fù)洗滌3 次，即制得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。將離心所得上清液收集測定固定化酶酶活328U，回收率為 82. 0%，蛋白吸附量為382mg蛋白/g SBA-15 實施例2
準(zhǔn)確稱取30mg介孔分子篩SBA-15，加入18mL用50mM pH7. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液稀釋的果糖基轉(zhuǎn)移酶(總酶活300U)，置于恒溫振蕩器(150rpm)中振蕩池，加入ImL濃度2. 0% 的殼聚糖(預(yù)先溶于1. 0%的冰醋酸中)，再加入ImL濃度1. 5%的戊二醛水溶液，置于恒溫振蕩器中震蕩4h，4000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清液，用50mM pH 7. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液洗滌沉淀，以除去殘余的戊二醛及未固定的酶蛋白，再次離心，重復(fù)洗滌3次，即制得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。將離心所得上清液收集測定固定化酶酶活235U，酶活回收率為78. 3%，蛋白吸附量為356mg蛋白/g SBA-15。應(yīng)用實施例1固定化酶的熱穩(wěn)定性研究
準(zhǔn)確稱取按照實施例2的制得的固定化酶30mg，加0. 05M pH5. 0的緩沖溶液，分別在 35、40、45、50、55、60°C保溫處理60min，取出后測其酶活，以最高酶活為100%，用相對酶活來表示酶活力變化的情況，固定化酶在60°C條件下放置Ih后酶活保留86%，而游離酶只剩余 62%。應(yīng)用實施例2固定化酶的分批反應(yīng)
準(zhǔn)確稱取按照實施例2制得的固定化酶30mg，加入到20mL的10%(w/v)的蔗糖溶液中， 在恒溫夾套酶反應(yīng)器中，50°C下恒溫攪拌反應(yīng)60min，停止反應(yīng)，得產(chǎn)品低聚果糖，4000rpm 離心除去固定化酶，并用緩沖溶液沖洗固定化酶三次并離心，然后用于下一批反應(yīng)，如此重復(fù)10次，測定殘余酶活，結(jié)果酶活仍保留72%。
應(yīng)用實施例3固定化酶的貯存穩(wěn)定性
將固定化酶和游離酶置于4°C冰箱內(nèi)保存，每隔10天分別測定其酶活力，以各自初始酶活為100%，計算其殘余酶活，，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放置60天后，固定化酶的殘余酶活仍有86%，而游離酶只剩余32%的酶活。
權(quán)利要求
1.一種以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于先以介孔分子篩SBA-15為載體，將酶蛋白吸附于該載體上，再加入殼聚糖以及雙功能試劑戊二醛進(jìn)一步吸附并交聯(lián)，通過兩步吸附-交聯(lián)法進(jìn)行了果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化，使酶分子牢固地固定于載體上，步驟如下(1)載體吸附酶蛋白將總酶活300-400U果糖基轉(zhuǎn)移酶用18mL50mM、pH 5. 0-7. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液稀釋，再與30-50mg的介孔分子篩SBA-15混合后，置于恒溫振蕩器中， 室溫下以恒定轉(zhuǎn)速振蕩吸附2- ；(2)吸附-交聯(lián)取ImL質(zhì)量濃度為1.0%-3. 0%的殼聚糖的1%冰醋酸溶液，加入到步驟 (1)所得固定化酶體系中；隨后再加入ImL質(zhì)量濃度為0. 5%-2. 5%的雙功能試劑戊二醛水溶液，置于恒溫振蕩器中震蕩2-6h，取出，高速離心機離心5-lOmin，除去未固定化部分，轉(zhuǎn)移上清液，用50mM pH5. 0-7. 0的檸檬酸-磷酸緩沖液洗滌沉淀，再次離心，用上述檸檬酸-磷酸緩沖液重復(fù)洗滌3次，即制得產(chǎn)品以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，儲藏于4°C冰箱中備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所述的介孔分子篩SBA-15，其孔徑大小為6-lOnm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于所得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活回收率達(dá)75%以上，蛋白吸附量超過350mg 蛋白/g載體，固定化酶重復(fù)利用10次后酶活仍保留70%以上，在4°C條件下儲存60天后酶活仍保持85%以上。
全文摘要
一種以介孔分子篩-殼聚糖為載體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，屬于食品酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明先以介孔分子篩SBA-15為載體，將酶蛋白吸附于該載體上，再加入殼聚糖以及雙功能試劑戊二醛進(jìn)一步吸附并交聯(lián)，通過兩步吸附-交聯(lián)法進(jìn)行了果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化，使酶分子牢固地固定于載體上。固定化酶的酶活回收率可達(dá)75%以上，熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都優(yōu)于游離酶。本發(fā)明相對其他固定化方法操作簡單，條件溫和，成本較低，酶分子不易泄漏，固定化效果好；產(chǎn)品固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶可應(yīng)用于高純度低聚果糖的生產(chǎn)。
文檔編號C12N11/14GK102321605SQ20111032191
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者吳保承, 張濤, 李曉卉, 楊春霞, 江波, 繆銘 申請人:江南大學(xué), 江蘇省江大綠康生物工程技術(shù)研究有限公司