專利名稱：一種兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于雙歧桿菌制品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高雙歧桿菌凍干存活率的凍干復(fù)合保護(hù)劑及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌屬革蘭氏陽性、厭氧、不運(yùn)動(dòng)、無芽孢的桿菌，其染色不規(guī)則，過氧化氫酶呈陰性，形態(tài)多變，常因菌齡及生長(zhǎng)環(huán)境不同而呈現(xiàn)彎曲桿形、F或G形等多種形態(tài)，菌落光滑，凸圓，邊緣完整。目前已發(fā)現(xiàn)的約有30種，包括兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、嬰兒雙歧桿菌(B. infant is)、青春雙歧桿菌(B. adolescentis)、長(zhǎng)雙歧桿菌(B. Iongum)和短雙歧桿菌 (B. breve)等。雙歧桿菌是乳制品及其制劑中常用的益生菌之一，其具有緩解乳糖不耐癥及腸易激綜合癥，預(yù)防腹瀉或便秘，調(diào)解人提腸道菌群平衡，降低血膽固醇，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤產(chǎn)生等功能，目前已廣泛用于功能性乳制品、保健食品及微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)，因此制備雙歧桿菌菌粉做為發(fā)酵劑或者保健食品的原料很有必要。雙歧桿菌菌粉的制備方法主要有噴霧干燥技術(shù)，真空干燥技術(shù)及真空冷凍干燥技術(shù)。其中噴霧干燥技術(shù)單位產(chǎn)品耗熱量大，設(shè)備的熱效率低；進(jìn)風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度高，導(dǎo)致菌體存活率低，若降低溫度，則容易出潮粉；對(duì)于菌粉的分離裝置要求較高，易使產(chǎn)品損失和污染；但噴霧干燥的處理量大，成本低。而真空干燥技術(shù)需要配置真空系統(tǒng)，在大型連續(xù)化生產(chǎn)設(shè)備上還需要在進(jìn)出口處設(shè)置傳動(dòng)部件的真空動(dòng)密封結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)元件易造成泄漏，此外最大的問題是處理量小，成本高，僅適用于高附加值的產(chǎn)品。這兩種方法得到的活菌的存活率很低，達(dá)不到冷凍干燥的水平，同時(shí)得到的菌粉復(fù)水性較低。相比之下，真空冷凍干燥技術(shù)具有其他干燥方法無可比擬的優(yōu)點(diǎn)菌種在低溫下干燥，各種成分、酶的活性喪失少；可以保持菌種的形態(tài)、色澤；復(fù)水性好，能很快地吸水還原成干燥前的鮮活狀態(tài)；保存期長(zhǎng)，儲(chǔ)存運(yùn)輸、銷售方便。但在真空冷凍干燥過程中，雙歧桿菌要經(jīng)受冷凍和干燥兩種激烈因素的作用，導(dǎo)致菌體死亡，影響其凍干存活率及菌粉活菌數(shù)的因素中，凍干保護(hù)劑是最為復(fù)雜、最難選擇的關(guān)鍵因素，它不僅影響雙歧桿菌在凍干過程中的細(xì)胞存活率，也影響保藏期間的細(xì)胞穩(wěn)定性。ZL200610012689. 5中公開了一種高活性雙歧桿菌干粉制劑的復(fù)合保護(hù)劑，其配方組成為β -環(huán)糊精log、乳糖2-5g、海藻糖0. 5-2. 0g、酵母膏0. 5-2. Og,維生素E0. 05-0. Ig 及蒸餾水IOOml ；ZL200610012690. 8中也公開了一種直投式雙歧桿菌純種凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑，其配方組成為脫脂乳粉10g、乳糖3-6g、海藻糖1. 0-2. 0g、吐溫80 0. 05-1. 0g、酵母膏 0. 5-1. 0g，血清 0. 5-lg、維生素 E0. 05-0. 2g 及蒸餾水 IOOrnl ；ZL200710006529. 4 中也公開了一種雙歧桿菌活菌制劑及其專用保護(hù)劑，其配方組成為甘油0. 01-5. 0份，聚乙烯吡咯烷酮0. 1-6. 0份、聚乙二醇0. 1-5. 0份、脫脂奶粉1. 0-10. 0份、海藻糖0. 5-15. 0份、谷氨酸鈉0. 1-5. 0份、L-天冬氨酸0. 1-5. 0份、維生素C鈉0. 1-5. 0份、鳥氨酸鹽酸鹽0. 1-5. 0份。上述三個(gè)保護(hù)劑中都添加了海藻糖，海藻糖的吸水性很強(qiáng)，菌粉易吸潮，導(dǎo)致貯存過程中死亡速度快，后面兩個(gè)保護(hù)劑還添加了脫脂乳粉，生產(chǎn)的菌粉在非乳制品中如藥劑等方面的應(yīng)用受到了限制，此外，三個(gè)保護(hù)劑中均沒有添加益生元成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能顯著提高兩歧雙歧桿菌凍干存活率及菌粉活菌數(shù)的凍干復(fù)合保護(hù)劑及其應(yīng)用方法，解決了兩歧雙歧桿菌菌粉在凍干過程中存在的凍干存活率低，活菌數(shù)少，易吸水變潮等問題，提高了菌粉的保健功能。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑，該復(fù)合保護(hù)劑的配方組成包括3. 0-5. Og低聚木糖、6. 0-8. Og菊糖、5. 0-7. Og水蘇糖、2. 0-4. Og甘氨酸、2. 0-4. Og精氨酸、0. 4-0. 6g碳酸氫鈉和0. 7-1. 2g抗壞血酸鈉。所述復(fù)合保護(hù)劑的配方組成包括3. 5g低聚木糖、6. 5g菊糖、5. 5g水蘇糖、2. 8g甘氨酸、2. 2g精氨酸、0. 4g碳酸氫鈉和1. 2g抗壞血酸鈉。所述復(fù)合保護(hù)劑的配方組成包括5. Og低聚木糖、8. Og菊糖、6. Og水蘇糖、3. Og甘氨酸、4. Og精氨酸、0. 5g碳酸氫鈉和0. Sg抗壞血酸鈉。所述復(fù)合保護(hù)劑采用以下步驟制備(1)將稱取的甘氨酸、精氨酸及抗壞血酸鈉溶解于20mL 0. 85%無菌生理鹽水中， 然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌得溶液A ；(2)將低聚木糖、菊糖、水蘇糖和碳酸氫鈉溶解于SOmL蒸餾水中，然后于 100-115°C滅菌10-20min，滅菌后冷卻至室溫得溶液B ；(3)將溶液A與溶液B混勻備用。上述兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑的應(yīng)用方法包括以下步驟將離心收集的兩歧雙歧桿菌菌泥與所述復(fù)合保護(hù)劑等體積混合均勻，然后在低溫冰箱中于-40°C預(yù)凍3-12h， 然后放入凍干機(jī)于溫度-50--60°C，真空度為4-6 下冷凍干燥18-Mh，即得雙歧桿菌菌粉。所述兩歧雙歧桿菌菌泥的制備方法為將兩歧雙歧桿菌活化三次后按3% (V/V) 的接種量接入含0. 5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，然后7000r/min離心 IOmin得兩歧雙歧桿菌菌泥，用0. 85%無菌生理鹽水將兩歧雙歧桿菌菌泥活菌數(shù)調(diào)整至 (0. 8-2. 0) X 10ncfu/mL。本發(fā)明所述兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑是將低聚木糖、菊糖、水蘇糖、甘氨酸、 精氨酸、碳酸氫鈉和抗壞血酸鈉按照比例有機(jī)組合而成，利用該復(fù)合保護(hù)劑對(duì)兩歧雙歧桿菌進(jìn)行冷凍干燥，凍干存活率達(dá)85%以上，菌粉活菌數(shù)大于2. 0 X lO^cfu/g，解決了在開發(fā)高活性兩歧雙歧桿菌凍干菌粉過程中的重大關(guān)鍵技術(shù)問題，制備的高活性菌粉可作為添加劑、發(fā)酵劑用于開發(fā)兩歧雙歧桿菌功能性食品和醫(yī)藥制劑，本發(fā)明所述兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑不含脫脂乳粉和海藻糖，并添加了低聚木糖、菊糖和水蘇糖等益生元，解決了兩歧雙歧桿菌菌粉在凍干過程中存在的易吸水變潮等問題，同時(shí)益生元的添加進(jìn)一步提高了菌粉的保健功能。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1準(zhǔn)確稱取3. 5g低聚木糖、6. 5g菊糖、5. 5g水蘇糖和0. 4g碳酸氫鈉，加入SOmL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻后于110°C滅菌15min，冷卻至室溫。再準(zhǔn)確稱取2. Sg甘氨酸、 2. 2g精氨酸和1. 2g抗壞血酸鈉溶解于20ml 0. 85%無菌生理鹽水中，再用0. 22 μ m無菌濾膜進(jìn)行過濾除菌，最后在超凈工作臺(tái)中無菌操作將兩者混合均勻，即得凍干復(fù)合保護(hù)劑。將兩歧雙歧桿菌經(jīng)活化三次后，將其按3% (V/V)的接種量接入含0. 5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，然后7000r/min離心lOmin，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥，用 0. 85%無菌生理鹽水將兩歧雙歧桿菌菌泥活菌數(shù)調(diào)整至2. OX IO11CfuAiL,等體積加入上述凍干復(fù)合保護(hù)劑，在低溫冰箱中于_40°C預(yù)凍9h，然后放入凍干機(jī)于_52°C，真空度為4-6Pa 下進(jìn)行冷凍干燥20h，即得兩歧雙歧桿菌菌粉，其凍干存活率可達(dá)85. 15%，菌粉活菌數(shù)為 2. 87X10ncfu/g。實(shí)施例2準(zhǔn)確稱取5. Og低聚木糖、8. Og菊糖、6. Og水蘇糖和0. 5g碳酸氫鈉，加入80mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻后于110°C滅菌15min，冷卻至室溫。再準(zhǔn)確稱取3. Og甘氨酸、 4. Og精氨酸和0. 8g抗壞血酸鈉溶解于20ml 0. 85%無菌生理鹽水中，再用0. 22 μ m無菌濾膜進(jìn)行過濾除菌，最后在超凈工作臺(tái)中無菌操作將兩者混合均勻，即得凍干復(fù)合保護(hù)劑。將兩歧雙歧桿菌經(jīng)活化三次后，將其按3% (V/V)的接種量接入含0. 5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，然后7000r/min離心lOmin，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥， 用0. 85%無菌生理鹽水將兩歧雙歧桿菌菌泥活菌數(shù)調(diào)整至1.2X IO11CfuAiL,等體積加入上述凍干復(fù)合保護(hù)劑，在低溫冰箱中于-40°C預(yù)凍6h，然后放入凍干機(jī)于-60°C，真空度為 6Pa下進(jìn)行冷凍干燥18h，即得兩歧雙歧桿菌菌粉，其凍干存活率為89. 70%，菌粉活菌數(shù)為 2. ASXlO^cfu/g。實(shí)施例3準(zhǔn)確稱取3. Og低聚木糖、6. Og菊糖、7. Og水蘇糖和0. 6g碳酸氫鈉，加入80mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻后于100°C滅菌20min，冷卻至室溫。再準(zhǔn)確稱取2. Og甘氨酸、 2. Og精氨酸和0. 7g抗壞血酸鈉溶解于20ml 0. 85%無菌生理鹽水中，再用0. 22 μ m無菌濾膜進(jìn)行過濾除菌，最后在超凈工作臺(tái)中無菌操作將兩者混合均勻，即得凍干復(fù)合保護(hù)劑。將兩歧雙歧桿菌經(jīng)活化三次后，將其按3% (V/V)的接種量接入含0. 5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，然后7000r/min離心lOmin，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥，用 0. 85%無菌生理鹽水將兩歧雙歧桿菌菌泥活菌數(shù)調(diào)整至1. OX IO11CfuAiL,等體積加入上述凍干復(fù)合保護(hù)劑，在低溫冰箱中于-40°C預(yù)凍3h，然后放入凍干機(jī)于-50°C，真空度為4Pa 下進(jìn)行冷凍干燥24h，即得兩歧雙歧桿菌菌粉，其凍干存活率達(dá)85%以上，菌粉活菌數(shù)大于 Z-OxiO11CfVg0實(shí)施例4準(zhǔn)確稱取3. Og低聚木糖、6. Og菊糖、5. Og水蘇糖和0. 6g碳酸氫鈉，加入80mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻后于115°C滅菌lOmin，冷卻至室溫。再準(zhǔn)確稱取4. Og甘氨酸、 2. Og精氨酸和0. 7g抗壞血酸鈉溶解于20ml 0. 85%無菌生理鹽水中，再用0. 22 μ m無菌濾膜進(jìn)行過濾除菌，最后在超凈工作臺(tái)中無菌操作將兩者混合均勻，即得凍干復(fù)合保護(hù)劑。
將兩歧雙歧桿菌經(jīng)活化三次后，將其按3% (V/V)的接種量接入含0. 5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，然后7000r/min離心lOmin，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥，用 0. 85 %無菌生理鹽水將兩歧雙歧桿菌菌泥活菌數(shù)調(diào)整至0. 8 X 10ncfu/mL,等體積加入上述凍干復(fù)合保護(hù)劑，在低溫冰箱中于_40°C預(yù)凍12h，然后放入凍干機(jī)于_53°C，真空度為5 下進(jìn)行冷凍干燥Mh，即得兩歧雙歧桿菌菌粉，其凍干存活率達(dá)85 %以上，菌粉活菌數(shù)大于 Z-OxiO11CfVg0
權(quán)利要求
1.一種兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑，其特征在于該復(fù)合保護(hù)劑的配方組成包括 3. 0-5. Og低聚木糖、6. 0-8. Og菊糖、5. 0-7. Og水蘇糖、2. 0-4. Og甘氨酸、2. 0-4. Og精氨酸、 0. 4-0. 6g碳酸氫鈉和0. 7-1. 2g抗壞血酸鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑，其特征在于所述復(fù)合保護(hù)劑的配方組成包括3. 5g低聚木糖、6. 5g菊糖、5. 5g水蘇糖、2. Sg甘氨酸、2. 2g精氨酸、 0. 4g碳酸氫鈉和1. 2g抗壞血酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑，其特征在于所述復(fù)合保護(hù)劑的配方組成包括5. Og低聚木糖、8. Og菊糖、6. Og水蘇糖、3. Og甘氨酸、4. Og精氨酸、 0. 5g碳酸氫鈉和0. 8g抗壞血酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述一種兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑，其特征在于所述復(fù)合保護(hù)劑采用以下步驟制備(1)將甘氨酸、精氨酸及抗壞血酸鈉溶解于20mL無菌生理鹽水中，然后用0.22μπι濾膜過濾除菌得溶液A ；(2)將低聚木糖、菊糖、水蘇糖和碳酸氫鈉溶解于SOmL蒸餾水中，然后于100-115°C滅菌10-20min，滅菌后冷卻至室溫得溶液B ；(3)將溶液A與溶液B混勻備用。
5.一種如權(quán)利要求1所述兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟將兩歧雙歧桿菌菌泥與所述復(fù)合保護(hù)劑等體積混合均勻，然后在低溫冰箱中于-40°C預(yù)凍3-12h，然后放入凍干機(jī)于-50—60°C冷凍干燥18_24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑的應(yīng)用方法，其特征在于 所述兩歧雙歧桿菌菌泥的制備方法為將兩歧雙歧桿菌活化三次后按3%的接種量接入含 0. 5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，然后7000r/min離心IOmin得兩歧雙歧桿菌菌泥，用無菌生理鹽水將兩歧雙歧桿菌菌泥活菌數(shù)調(diào)整至(0. 8-2. 0) X lOncfu/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供一種兩歧雙歧桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑及其應(yīng)用方法，其配方組成為低聚木糖3.0-5.0g、菊糖6.0-8.0g、水蘇糖5.0-7.0g、甘氨酸2.0-4.0g、精氨酸2.0-4.0g、碳酸氫鈉0.4-0.6g、抗壞血酸鈉0.7-1.2g，利用該復(fù)合保護(hù)劑對(duì)兩歧雙歧桿進(jìn)行冷凍干燥，凍干存活率達(dá)85％以上，菌粉活菌數(shù)大于2.0×1011cfu/g，復(fù)合保護(hù)劑中低聚木糖、菊糖和水蘇糖等益生元的添加，進(jìn)一步提高了兩歧雙歧桿菌菌粉的保健功能。本發(fā)明解決了在開發(fā)高活性兩歧雙歧桿菌凍干菌粉過程中的重大技術(shù)關(guān)鍵問題，制備的高活性菌粉可作為添加劑、發(fā)酵劑用于開發(fā)兩歧雙歧桿菌功能性食品和醫(yī)藥制劑。
文檔編號(hào)C12N1/04GK102358884SQ20111031036
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者吳玉喜, 張華 , 秦濤, 胡曼, 舒國偉, 陳合, 馬齊 申請(qǐng)人:陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院