專利名稱：柴胡皂苷α處理神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞及其試劑盒的研制、用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種柴胡皂苷α處理人神經(jīng)干細(xì)胞得到神經(jīng)元樣細(xì)胞(neuron-like cells, NLC)及其增殖的分化培養(yǎng)基，及其試劑盒研制的方法，以及包括前述方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞的用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明涉及一種柴胡皂苷 α分化人神經(jīng)干細(xì)胞得到神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，使用該培養(yǎng)基選擇性的獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法，以及包括前述方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞的用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞具有的自我復(fù)制和多分化潛能的特性，使之成為非常理想的細(xì)胞資源。但單純神經(jīng)干細(xì)胞移植存在很多問題困擾臨床治療，多種錯(cuò)綜復(fù)雜的因素影響干細(xì)胞移植效果，其中干細(xì)胞在體內(nèi)存活率低下，真正到達(dá)病灶位的干細(xì)胞分化成終端功能的細(xì)胞很少， 難以形成有效的治療效果。在干細(xì)胞移植前先將干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)成功能性的成神經(jīng)樣細(xì)胞，后移植到體內(nèi)進(jìn)行治療，可能達(dá)到比單獨(dú)干細(xì)胞移植更好的療效。神經(jīng)系統(tǒng)有大量神經(jīng)元。神經(jīng)元是腦的主要成分，神經(jīng)元群通過各個(gè)神經(jīng)元的信息交換，實(shí)現(xiàn)腦的分析功能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)樣本的交換產(chǎn)出；產(chǎn)出的樣本通過聯(lián)結(jié)路徑點(diǎn)亮丘覺產(chǎn)生意識。神經(jīng)元細(xì)胞的病變、變性或損傷等必能引起各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦卒中、腦性癱瘓、腦損傷、腦出血、骨髓側(cè)索硬化癥和帕金森病等。例如，CN 1923195Α公開的由香豆素類化合物誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化，可分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，其表明可作為誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的藥物，但并未公開其可以定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。已有文獻(xiàn)報(bào)道了中藥可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，例如三七總皂苷、丹參酮、硫代甘油和丹參注射液等。這些報(bào)告都表明中藥可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，而分化效率和增殖傳代能力并沒有確定。綜上，亟需一種操作簡單、成本低、分化純度高、增殖效率高且傳代細(xì)胞性質(zhì)穩(wěn)定的安全的獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的通過中藥高效地分化神經(jīng)干細(xì)胞成神經(jīng)元樣細(xì)胞，并增殖不分化， 克服現(xiàn)有的獲得和增殖神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法操作繁復(fù)、成本高，分化得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞純度低、增殖效率低、容易分化變性，并且在分化和增殖過程使用的培養(yǎng)基中含有很多對人體有害的藥物，使分化和增殖得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞在制備成藥物組合物時(shí)安全性差的缺點(diǎn)，提供一種神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，使用該培養(yǎng)基的分化和增殖得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法操作簡單、成本低、分化純度高、增殖效率高且傳代細(xì)胞性質(zhì)穩(wěn)定。本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基包括液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有l(wèi)_500ug/mL的柴胡皂苷α、1_20體積％的胎牛血清、5-200ng/mL的人表皮生長因子和5-200ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。本發(fā)明還提供了一種柴胡皂苷α分化神經(jīng)干細(xì)胞成神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的方法，其中，所述方法使用本發(fā)明所述的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種柴胡皂苷α分化神經(jīng)干細(xì)胞成神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的試劑盒研制的方法，其中，所述的試劑盒包括1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2)柴胡皂苷α ；3)細(xì)胞因子(人表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子)；4)消化細(xì)胞的酶以及；5)使用說明書；本發(fā)明還提供了一種用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發(fā)明所述從神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞，以及和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。使用本發(fā)明的選擇培養(yǎng)基的本發(fā)明的從神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的方法，能夠高效分化和大量增殖神經(jīng)元樣細(xì)胞，并經(jīng)傳代增殖的神經(jīng)元樣細(xì)胞仍然保持與原有的性狀。由于本發(fā)明的選擇培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，傳代培養(yǎng)得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞純度可達(dá)到85%以上。因此，本發(fā)明的方法無需使用磁珠等高成本安全性差的藥物就能達(dá)到更高純度的分離效果，避免了繁復(fù)的操作，因而降低了成本，并且由該方法得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞的安全性大大提高，可以制備成本發(fā)明用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物。本發(fā)明用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物不僅安全性好，而且能在體內(nèi)修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中損傷的神經(jīng)元細(xì)胞，從而為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了可能。


圖1為實(shí)施例1和3獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)蛋白的熒光免疫照片，其中，圖IA 為鼠抗人微管聯(lián)合蛋白_2IgG標(biāo)記后二抗顯色熒光免疫照片，圖IB為鼠抗人巢蛋白IgG標(biāo)記后二抗顯色熒光免疫照片；圖2為實(shí)施例1和3獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)基因的PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測圖片；圖3為使用實(shí)施例2和3獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中大鼠模型， 移植后隨著時(shí)間變化進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺失評分改善曲線；圖4為使用實(shí)施例2和3獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中大鼠模型， 移植后隨著時(shí)間變化進(jìn)行腦損傷面積改善曲線；圖5為使用實(shí)施例2和3獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中大鼠模型， 移植后患側(cè)紋狀體內(nèi)切片BrdU陽性染色NLC照片(免疫熒光顯微鏡放大倍數(shù)40倍)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基包括液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述選擇培養(yǎng)基還含有l(wèi)_500ug/mL的柴胡皂苷α、1_20體積％的胎牛血清、5-200ng/mL的人表皮生長因子(印idermal growth factor, EGF)和5_200ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)。優(yōu)選地，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述選擇培養(yǎng)基還含有5_300ug/ mL的柴胡皂苷α、5-15體積％的胎牛血清、lO-lOOng/mL的人表皮生長因子和lO-lOOng/mL 的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。進(jìn)一步優(yōu)選地，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述選擇培養(yǎng)基還含有50-200ug/mL的柴胡皂苷α ,5-10體積％的胎牛血清、20-50ng/mL的人表皮生長因子和20-50ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。本發(fā)明的神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基可以包括本領(lǐng)域常用的各種基本培養(yǎng)基，例如，選自神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基、BME細(xì)胞培養(yǎng)基、杜爾貝可改良伊格爾(Dulbecco，s modified Eagle，s medium,DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基、 Fischer' s細(xì)胞培養(yǎng)基、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、199細(xì)胞培養(yǎng)基、MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、FlO細(xì)胞培養(yǎng)基、F12細(xì)胞培養(yǎng)基和1640細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種或幾種。優(yōu)選包括的所述基本培養(yǎng)基為重量比1 1的F12細(xì)胞培養(yǎng)基和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。所述基本培養(yǎng)基的成分為本領(lǐng)域公知，上述列舉的基本培養(yǎng)基名稱為它們的商品名，商業(yè)上可供。本發(fā)明還提供了一種從胡皂苷α分化神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的方法，其中，所述方法使用本發(fā)明所述的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明提供的從皂苷α分化神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的方法可以適用于各種的神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞屬于具有一定分化程度的成體多能干細(xì)胞。理論上講，任何來源的神經(jīng)干細(xì)胞都可以應(yīng)用本發(fā)明的方法分化和增殖得到神經(jīng)元樣細(xì)胞，例如骨髓、臍帶血、胎盤、臍帶、流產(chǎn)胚胎(例如流產(chǎn)的12-14周的胚胎)和流產(chǎn)胎兒等來源的。 但考慮到可能有悖于倫理道德、社會風(fēng)俗習(xí)慣甚至法律規(guī)定，因此一般不利用流產(chǎn)胚胎和流產(chǎn)胎兒，并且胚胎和流產(chǎn)胎兒的來源有限。優(yōu)選所述離體組織選自骨髓、胎盤、臍帶血和臍帶中的一種或幾種。其中，骨髓和臍帶血可以來自公共臍帶血庫(例如，中國臍帶血庫等)和骨髓庫(例如，中華骨髓庫等)。從來源豐富程度考慮，優(yōu)選所述離體組織是臍帶，其一般作為醫(yī)療廢棄物被處理掉。本發(fā)明所述神經(jīng)元樣細(xì)胞分化培養(yǎng)體系包括5X IO5至5Χ IO6個(gè)/ml、優(yōu)選1 X IO6 個(gè)/ml神經(jīng)元樣細(xì)胞和lmL-100mL、優(yōu)選5_10mL的神經(jīng)元樣細(xì)胞分化培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由神經(jīng)干細(xì)胞分化得到神經(jīng)元樣細(xì)胞。使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基的本發(fā)明的方法，經(jīng)傳代增殖的神經(jīng)元樣細(xì)胞仍然保持與相同的性狀。例如，無論是神經(jīng)干細(xì)胞分化得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞還是傳代多次得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞它們的神經(jīng)絲蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、微管聯(lián)合蛋白-2(MAP-2)表達(dá)陽性，而膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)為陰性。 按照這個(gè)檢測神經(jīng)元樣細(xì)胞是否分化變性的標(biāo)準(zhǔn)判斷，本發(fā)明的方法得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞可以保證在多次傳代次數(shù)不發(fā)生分化變性。所述多次傳代得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞，可以用作制備本發(fā)明藥物組合物的原料。此外，為了便于運(yùn)輸和保存，所述神經(jīng)元樣細(xì)胞也可以進(jìn)行冷凍保存，在臨近使用前復(fù)蘇即可。本發(fā)明還提供了一種用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發(fā)明所述從從胡皂苷α分化神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞，以及和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料，例如，包括但不限于鹽水、緩沖鹽液、水、甘油、乙醇及其混合物。所述藥物組合物適于靜脈內(nèi)、腰穿、椎管、介入、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)注射和輸注等給藥。適于給藥的藥物組合物包括無菌水浴液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用于在臨近使用前在無菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。適宜的水性或非水性載體、 稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘泊、丙二醇、聚乙二醇、竣甲基纖維素、植物油和可注射的有機(jī)酶如泊酸乙醋。這些組合物還可以含有防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑等佐劑。加入等滲劑如糖類、氯化鈉等可能是有利的。優(yōu)選所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體，以及以所述注射液體積為基準(zhǔn)，1 XIO5至1 X IO8個(gè)/毫升的本發(fā)明所述的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞。 優(yōu)選所述注射液包括以所述注射液體積為基準(zhǔn)，5 X IO5至1 X IO7個(gè)/毫升的本發(fā)明所述的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞。優(yōu)選所述藥學(xué)上可接受的載體為生理鹽水。這里所述的生理鹽水，是指生理學(xué)實(shí)驗(yàn)或臨床上常用的滲透壓與動(dòng)物或人體血漿的滲透壓相等的溶液。優(yōu)選地，用于哺乳類動(dòng)物和人體時(shí)是0. 85-0. 9%的氯化鈉溶液。更優(yōu)選0. 9%的氯化鈉溶液。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元樣細(xì)胞可以對神經(jīng)元損傷和丟失進(jìn)行修復(fù) (參見實(shí)施例5)。因此本發(fā)明用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物中提及的神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自腦卒中、腦性癱瘓、腦損傷、腦出血、骨髓側(cè)索硬化癥和帕金森病等中的一種或幾種。使用由本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞，處于本發(fā)明的分化培養(yǎng)基中，因此在制備用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物之前，可以通過除去本發(fā)明的分化培養(yǎng)基，用生理鹽水洗滌并重懸所述神經(jīng)元樣細(xì)胞。所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決定。將本發(fā)明的用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物在注射給患者時(shí)殘留的培養(yǎng)基組分不會引起患者不適即可。所述組合物包括IXlO5到IXlO8個(gè)/mL本發(fā)明的新的神經(jīng)元樣細(xì)胞；優(yōu)選為lX10llj5X107f/mL。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞在制備治療腦卒中藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，其包括給患者施用本發(fā)明用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物。施用本發(fā)明用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物的方式可以選自介入注射、腰穿、靜脈注射、皮下注射和皮內(nèi)注射中的一種或幾種；更優(yōu)選所述施用的方式為腦部立體定向介入注射。本發(fā)明所述用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物優(yōu)選含有IX IO5到IXlO8 細(xì)胞/mL的神經(jīng)元樣細(xì)胞，其每次注射給藥量為0. lmL-5mL/個(gè)體；更優(yōu)選地，本發(fā)明所述用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物包括1 X IO6到5 X IO7個(gè)/mL的神經(jīng)元樣細(xì)胞，其每次注射給藥量為0. lmL-2mL/個(gè)體。以上個(gè)給出了本發(fā)明所述用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物每一次注射的劑量，一個(gè)療程三次注射，每兩次注射間隔一周。本發(fā)明所述用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物一般在注射完第二次后的第三天到第七天起效。所述有效的標(biāo)準(zhǔn)是改良神經(jīng)功能缺失評分(modified Neurological Severity Scores，mNSS)逐漸降低，腦損傷面積得到改CN 善，以減少或停止腦損傷面積為目標(biāo)。一個(gè)療程結(jié)束后，可以馬上連續(xù)進(jìn)行第二個(gè)療程的治療，也可以間隔一到三個(gè)月后進(jìn)行第二個(gè)療程的治療以鞏固療效，一般治療兩個(gè)至四個(gè)療程可以消除神經(jīng)系統(tǒng)疾病病癥；間隔時(shí)間為六個(gè)月或一年，患者如認(rèn)為有必要，還可進(jìn)行鞏固療效的治療。優(yōu)選使用本發(fā)明的方法來分離神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的離體組織(例如骨髓)，所得神經(jīng)元樣細(xì)胞制備成本發(fā)明的藥物組合物給藥神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者自體，這樣可以最大限度地避免免疫排斥反應(yīng)造成的副作用。以下，對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些示例。實(shí)施例1 本實(shí)施例用于說明使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基從人骨髓中分離的神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法。骨髓來自45歲捐獻(xiàn)的腦出血患者，與該患者及醫(yī)院方簽署了知情同意書，在其手術(shù)時(shí)采集其骨髓。將骨髓用IXPBS等體積稀釋，得到骨髓稀釋液，以骨髓稀釋液1. 077千克/立方米的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)的體積比為2 1加入到50ml離心管中， 在2000rpm、25度下進(jìn)行密度梯度離心20分鐘，離心后收集中間層細(xì)胞，并使用IXPBS IOOOrpm離心10分鐘，洗滌所得細(xì)胞三次，加入完全培養(yǎng)基，含10 %胎牛血清、20ng/mL人表皮生長因子和20ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(美國R&D公司)的DMEM/F12培養(yǎng)基 (1 1)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按3X105細(xì)胞/cm2的密度接種于75cm2的培養(yǎng)瓶中，每瓶再加入上述培養(yǎng)基使終體積為10ml。在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第三天后，半量換液。換液時(shí)將舊培養(yǎng)基緩慢吸出5ml，加入新鮮的上述培養(yǎng)基，每瓶加入5ml，繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的85%時(shí)，將培養(yǎng)基傾去，并將細(xì)胞通過用胰酶消化， 800rpm離心5分鐘收集后在含10%胎牛血清、20ng/mL人表皮生長因子和20ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基(1 1)中傳代培養(yǎng)。同樣當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的85%時(shí)，進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。1瓶原代培養(yǎng)物可以傳代三瓶，每瓶起始培養(yǎng)的細(xì)胞密度為2X IO5細(xì)胞/mL。三瓶75cm2培養(yǎng)瓶在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，得到貼壁并且生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的90%的細(xì)胞。獲得的神經(jīng)干細(xì)胞取1瓶進(jìn)行免疫熒光檢測 (下面詳述方法)，使用鼠抗人巢蛋白(Iiestin)IgG和鼠抗人膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(DFAP) IgG進(jìn)行染色，檢測結(jié)果顯示mestin和DFAP都為陽性，符合神經(jīng)干細(xì)胞表型特征。取上述培養(yǎng)好的神經(jīng)干細(xì)胞，傾去培養(yǎng)基，每瓶加入200ug/mL柴胡皂苷α、10% 胎牛血清、20ng/mL人表皮生長因子(EGF)和50ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基IOml進(jìn)行分化培養(yǎng)(分化培養(yǎng)基)，48小時(shí)后半量換液，換液時(shí)將舊培養(yǎng)基緩慢吸出5ml，加入新鮮的分化培養(yǎng)基，每瓶加入5ml，繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)。第五天神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，并進(jìn)行半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)到第7天間充質(zhì)基本分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。取其中1瓶細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測，棄去培養(yǎng)基，按前述條件經(jīng)胰酶消化，SOOrpm 離心5分鐘后，收集細(xì)胞沉淀用ImL 1XPBS(PH 7. 4的磷酸緩沖液)重懸，計(jì)數(shù)。取6份 50 μ L(每份含IX IO6個(gè)細(xì)胞)上述的傳代得到細(xì)胞懸液分別接種在六孔培養(yǎng)板的六個(gè)孔中貼壁生長4小時(shí)，吸出培養(yǎng)基后用IXPBS洗滌一次，加入2%甲醛固定3分鐘，用0. 5%曲通100 (Triton-100) IXPBS洗滌三次，再向六孔板的六個(gè)孔中分別加入IXPBS以及用 IX PBS稀釋的鼠抗人神經(jīng)絲蛋白(NF-M) IgG、鼠抗人巢蛋白(nestin) IgG、兔抗人MAP_2IgG 和鼠抗人膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(DFAP) IgG。在4度冰箱過夜進(jìn)行染色/結(jié)合，之后用0.5% Triton-1001 XPBS洗滌3次，向各孔中加入用IXPBS稀釋的二抗IgG-PE或IgG-FITC，在 37度下孵育lh，孵育后用IXPBS輕輕洗滌3次，洗滌完之后用90%甘油封閉。熒光顯微鏡下觀測，結(jié)果顯示，85%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)絲蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、微管聯(lián)合蛋白-2(ΜΑΡ1)表達(dá)陽性，而膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)為陰性，符合神經(jīng)元樣細(xì)胞的特異性特征，因而證明使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基從人骨髓來源神經(jīng)干細(xì)胞能分化出高純度的神經(jīng)元樣細(xì)胞。表 1不同組別神經(jīng)干細(xì)胞分化為NF-M染色陽性神經(jīng)元樣細(xì)胞百分率
權(quán)利要求
1.一種人神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基包括液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其特征在于，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述選擇培養(yǎng)基還含有l(wèi)-500ug/mL的柴胡皂苷α、1_20體積％的胎牛血清、5-200ng/mL的人表皮生長因子和 5-200ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分化培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有5-300ug/mL的柴胡皂苷α ,5-15體積％的胎牛血清、lO-lOOng/mL的人表皮生長因子和lO-lOOng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分化培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述選擇培養(yǎng)基還含有50-200ug/mL的柴胡皂苷α ,5-10體積％的胎牛血清、20-50ng/mL的人表皮生長因子和20-50ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分化培養(yǎng)基，其中，所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基(Neuronal Medium，NM)、BME細(xì)胞培養(yǎng)基、杜爾貝可改良伊格爾細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基、Fischer' s細(xì)胞培養(yǎng)基、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、199細(xì)胞培養(yǎng)基、MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、 FlO細(xì)胞培養(yǎng)基、F12細(xì)胞培養(yǎng)基和1640細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種或幾種。
5.一種將神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法使用權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述的人神經(jīng)干細(xì)胞。
6.由權(quán)利要求1-5所述的方法得到的神經(jīng)元樣細(xì)胞。
7.一種制備權(quán)利要求6所述的柴胡皂苷α分化試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2)柴胡皂苷α；3)細(xì)胞因子(人表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子)；4)消化細(xì)胞的酶以及；5)使用說明書。
8.一種用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要求6-7中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞，以及和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體，以及以所述注射液體積為基準(zhǔn)，1 X IO5至1 X IO8個(gè)/毫升的權(quán)利要求6-7中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述注射液包括以所述注射液體積為基準(zhǔn)，5 X IO5至1 X IO7個(gè)/毫升的權(quán)利要求6-7中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體為生理鹽水。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病選自腦卒中、腦性癱瘓、腦損傷、腦出血、骨髓側(cè)索硬化癥和帕金森病等中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種柴胡皂苷α處理人神經(jīng)干細(xì)胞得到神經(jīng)元樣細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，所述選擇培養(yǎng)基包括液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述選擇培養(yǎng)基還含有1-500ug/mL的柴胡皂苷α、1-20體積％的胎牛血清、5-200ng/mL的人表皮生長因子和5-200ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子；還提供了使用前述分化培養(yǎng)基的制備該柴胡皂苷α分化試劑盒的方法；還提供了包括前述的方法獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞的用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物。使用本發(fā)明的選擇培養(yǎng)基的本發(fā)明的方法能夠高效分化神經(jīng)干細(xì)胞，得到神經(jīng)元樣細(xì)胞。本發(fā)明用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物能在體內(nèi)修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞，并消除神經(jīng)病變。
文檔編號C12N5/0797GK102363767SQ20111030796
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者沈麗, 王振光, 郝麗敏, 黃啟明 申請人:北京弘潤天源生物技術(shù)有限公司