專(zhuān)利名稱(chēng)：高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高效分泌表達(dá)AcAP5的CHO細(xì)胞株。
背景技術(shù)：
犬鉤蟲(chóng)吸血時(shí)，其頭腺分泌一種具有抗凝血活性的物質(zhì)，被稱(chēng)作犬鉤蟲(chóng)抗凝血肽 (anticoagulant ρ印tide，AcAPs)。該物質(zhì)本質(zhì)是一種蛋白水解酶，具有延長(zhǎng)血漿凝血酶原時(shí)間(Pt)、抑制血液凝固以及促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用。AcAPs目前已有AcAP5、AcAP6、 AcAPc2三種重組蛋白。AcAP5由77個(gè)氨基酸組成，是Xa因子的高效特異性抑制劑，與Xa 的反應(yīng)位區(qū)在肽37-42 (-C-R-S-R-G-C-)，作用位點(diǎn)在第40位精氨酸和第41位甘氨酸之間。 AcAPs的抗凝血、抗血栓作用有將會(huì)成為臨床上一種新的抗凝劑和抗血栓治療藥物。目前用CHO表達(dá)AcAP5的最高表達(dá)量是6mg/L，且無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決目前用CHO表達(dá)外源基因產(chǎn)物的表達(dá)量低，且無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題，提供高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株。本發(fā)明高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，利用二氫葉酸還原酶缺陷型中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0-dhfr_)作為宿主細(xì)胞，經(jīng)篩選、擴(kuò)增后得到穩(wěn)定、高效表達(dá)AcAP5的細(xì)胞株，表達(dá)量最高達(dá)到12mg/L · 72h。本發(fā)明高分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行—、目的片段雙酶切由上海生工公司合成帶有信號(hào)肽的AcAP5基因序列克隆到T 載體上，將T載體用BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下
成分用量
0.2昭/叫T載體20|iL
IOx MbufFer6|iL
BamHl3 μ
Notl3μL
ddH2028|iL酶切反應(yīng)條件為37°C放置3小時(shí)，然后將酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到插入片段；二、質(zhì)粒載體雙酶切用BamHI和NotI雙酶切消化質(zhì)粒載體pcDNA3. l/V5-His_C，
反應(yīng)體系如下成分用量
0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μL
IOx MbufFer6|iL
,SawHI3 μ
XhoI3μL
ddH2028|iL酶切反應(yīng)條件為37°C放置3小時(shí)，然后將酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，再用 DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到酶切后的質(zhì)粒載體；三、DNA片段的連接，反應(yīng)體系如下
成分用量
0.2μ§/μ 酶切后的質(zhì)粒載體3|iL
10ng/|iL 插入片段13|iL
IOx T4 DNA 連接酶 buffer2μL
T4 DNA連接酶2|iL連接反應(yīng)條件為16 °C放置過(guò)夜，獲得連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒pcDNA3. 1/ V5-His-C-AcAP5 ；四、細(xì)胞培養(yǎng)用含1001^/1胎牛血清、離4、1\肌的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)二氫葉酸還原酶缺陷型中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-dhfr—；五、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5與質(zhì)粒 pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent 共轉(zhuǎn)染 CHO-dhfr-細(xì)胞，在 24 孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞達(dá)到95%融合時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無(wú)抗生素、無(wú)血清的CHO-S-SFM II，500 μ L/ 孔，轉(zhuǎn)染6h后更換含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用ELISA試劑盒鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按1 10傳代，24h細(xì)胞貼壁后更換為選擇性培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 16d后有陽(yáng)性克隆形成，然后用定向消化的方法將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入24孔板，又傳代至12孔板，經(jīng)ELISA 試劑盒測(cè)定對(duì)陽(yáng)性克隆中10株高表達(dá)的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；六、MTX的加壓培養(yǎng)以MTX加壓篩選，濃度依次為2X10_8mmol/L、lX10_7mmol/L 和5X liTmmol/L，最終得到能夠在5X l(Tmmol/L的MTX中正常生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞株，即為高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株。步驟一所述帶有信號(hào)肽的AcAP5基因序列根據(jù)Genbank中犬鉤蟲(chóng)(Ancylostoma caninum)的mRNA序列(Aceession :U30795)的原始序列，去掉原始信號(hào)肽序列，同時(shí)根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)選擇CH0-dhft_偏愛(ài)密碼子。為了使轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，同時(shí)使表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外，在原始序列5’端加上Kozak序列和信號(hào)肽，在原始序列兩端分別加上限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI的位點(diǎn)。步驟一所述帶有信號(hào)肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID NO=I所示。步驟一所述帶有信號(hào)肽的AcAP5基因中加入的信號(hào)肽的基因序列如SEQ ID NO 2 所示。
本發(fā)明高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明選用CHO-dhfr—細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，具有以下優(yōu)點(diǎn)CH0-dhfr_細(xì)胞適用于各種蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)和胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)；在MTX選擇壓力下，DHFR基因及該基因兩側(cè)的序列可以大量擴(kuò)增；對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)性強(qiáng)，可以用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；CHO細(xì)胞既可進(jìn)行貼壁培養(yǎng)也可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；可大量地規(guī)模性生產(chǎn)，培養(yǎng)量可達(dá)5000L。本發(fā)明的CHO細(xì)胞株可以高效表達(dá)AcAP5，表達(dá)量為9 12mg/L · 72h，且可以工業(yè)化生產(chǎn)。AcAP5可以抗凝血、抗血栓，其主要抑制凝血因子X(jué)a，直接與Xa的活性中心結(jié)合從而特異性抑制Xa，阻斷凝血的共同途徑，達(dá)到抗凝血作用。本發(fā)明為犬鉤蟲(chóng)抗凝血肽抗凝活性的深入研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖1為具體實(shí)施方式
一中重組質(zhì)粒DNA的測(cè)序圖；圖2為具體實(shí)施方式
一中陽(yáng)性克隆的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，利用二氫葉酸還原酶缺陷型中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0-dhfr_)作為宿主細(xì)胞，經(jīng)篩選、擴(kuò)增后得到穩(wěn)定、高效表達(dá)AcAP5的細(xì)胞株，表達(dá)量最高達(dá)到12mg/L · 72h。本實(shí)施方式高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株的構(gòu)建方法具體如下一、目的片段雙酶切由上海生工公司合成帶有信號(hào)肽的AcAP5基因序列克隆到T 載體上，將T載體用BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下酶切反應(yīng)條件37°C放置3小時(shí)，將酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到插入片段。二、質(zhì)粒載體雙酶切用BamHI和NotI雙酶切消化質(zhì)粒載體pcDNA3. 1/ V5-His-C (購(gòu)自Invitrogen公司)，反應(yīng)體系如下
成分 0.2昭/叫T載體 IOx Mbuffer
20μL 6μL 3 |iL 3 |iL 28|iL
BamHl Notl
ddH20成分用量
0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μL
IOx MbufFer6|iL
,SawHI3 μ
XhoI3μL
ddH2028|iL酶切反應(yīng)條件37°C放置3小時(shí)，將酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到酶切后的質(zhì)粒載體。三、DNA片段的連接反應(yīng)體系如下
成分用量
0.2μ§/μ 酶切后的質(zhì)粒載體3|iL
10ng/|iL 插入片段13|iL
IOx T4 DNA 連接酶 buffer2|iL
T4 DNA連接酶2|iL連接反應(yīng)條件16°C放置過(guò)夜，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli ToplO (購(gòu)自天津天有利科技有限公司)，采用菌落PCR的方法篩選陽(yáng)性菌落，并進(jìn)一步提取重組質(zhì)粒 DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明無(wú)堿基的錯(cuò)誤，未改變載體閱讀框，方向相同(如圖1)。BamHI、 NotI和DNA連接酶購(gòu)自NEB公司。四、細(xì)胞培養(yǎng)二氫葉酸還原酶缺陷型中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0-dhfr_由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理教研室贈(zèng)予，用含100mL/L胎牛血清(FBS)、NAA、1 XHT的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自GIBCO公司)培養(yǎng)。五、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5與質(zhì)粒pDCHlPll混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent (購(gòu)自 Invitrogen 公司)共轉(zhuǎn)染 CHO-dhfr-細(xì)胞，在 24 孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞達(dá)到95%融合時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無(wú)抗生素、無(wú)血清的CHO-S-SFM II， 500 μ L/孔，轉(zhuǎn)染6h后更換含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II (不含HT、NAA) ImL,繼續(xù)培養(yǎng) 48h，用ELISA試劑盒(購(gòu)自R&D公司)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按1 10傳代，24h細(xì)胞貼壁后更換為選擇性培養(yǎng)基(不含HT、NAA,但含0. 75mg/L的G418 (購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司)，100mL/L的FBS)，培養(yǎng)14 16d后有陽(yáng)性克隆形成(因培養(yǎng)基中不含HT，故存活細(xì)胞為成功共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)；然后用定向消化的方法將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入24孔板，又傳代至12 孔板，經(jīng)ELISA試劑盒測(cè)定對(duì)陽(yáng)性克隆中10株高表達(dá)的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。六、MTX的加壓培養(yǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，取培養(yǎng)3d的上清用ELISA試劑盒檢測(cè)，以 MTX (氨甲喋呤)加壓篩選，濃度依次為2 X l(T%mol/L、1 X 10"7mmol/L和5 X 10"7mmol/L,最終得到能夠在5X 10_7mmol/L的MTX中正常生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞株，即為高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株。
本實(shí)施方式的陽(yáng)性克隆的RT-PCR鑒定試驗(yàn)，具體方法為收集MTX加壓篩選后的細(xì)胞，以TRIzoI進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，RNA反轉(zhuǎn)錄后以Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；94°C 30s,51°C 30s, 72°C 30s，共30個(gè)循環(huán)；再72°C最終延伸 5min。上游引物P1 5 ‘ -AGTGCGGCGAGAACGAGTGG-3 ‘下游引物P2 5 ‘ -CGATGACGGTGTCGCGGTAGAA-3 ‘試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，泳道1為DNA marker,泳道2為陽(yáng)性克隆的RT-PCR產(chǎn)物，泳道3為未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。對(duì)未轉(zhuǎn)染pcDNA3. l/V5-His-C-AcAP5和pDCHlPll的CHO細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增后無(wú)條帶。由于CHO細(xì)胞自身并無(wú)AcAP5 mRNA形式存在，所以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)相應(yīng)片段被擴(kuò)增。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中擴(kuò)增出295bp的片段，表明目的片段已完整的整合到CHO 細(xì)胞中，有目的基因的轉(zhuǎn)錄。重組AcAP5蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)試驗(yàn)，具體方法為分別對(duì)2 X 10_8mmol/L、 1 X liTmmol/L和5 X liTmmol/L三個(gè)不同濃度MTX加壓培養(yǎng)后的細(xì)胞株培養(yǎng)72h，之后取培養(yǎng)液上清，用ELISA試劑盒測(cè)定重組AcAP5蛋白含量。檢測(cè)結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，其特征在于利用二氫葉酸還原酶缺陷型中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，經(jīng)篩選、擴(kuò)增后得到穩(wěn)定、高效表達(dá)AcAP5的細(xì)胞株，具體方法按以下步驟進(jìn)行一、目的片段雙酶切由上海生工公司合成帶有信號(hào)肽的AcAP5基因序列克隆到T載體上，將T載體用BamHI和NotI進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下成分用量·0.2昭/叫T載體20|iLIOx MbufFer6|iLBamHl3 μ Notl3μLddH2028|iL酶切反應(yīng)條件為37°C放置3小時(shí)，然后將酶切產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到插入片段；二、質(zhì)粒載體雙酶切用BamHI和NotI雙酶切消化質(zhì)粒載體pcDNA3.1/V5-His-C,反應(yīng)體系如下成分用量·0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μLIOx MbufFer6|iLBamHl3 μ XhoI3μLddH2028|iL酶切反應(yīng)條件為37°C放置3小時(shí)，然后將酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，再用 DNAGEL EXTRACTION KIT純化回收，得到酶切后的質(zhì)粒載體；三、DNA片段的連接，反應(yīng)體系如下成分用量·0.2μ§/μ 酶切后的質(zhì)粒載體3|iL10ng/|iL 插入片段13|iLIOx T4 DNA 連接酶 buffer2|iLT4 DNA連接酶2|iL連接反應(yīng)條件為16°C放置過(guò)夜，獲得連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒pcDNA3. l/V5-His-C-AcAP5 ；四、細(xì)胞培養(yǎng)用含1001^/1胎牛血清、離4、1\肌的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)二氫葉酸還原酶缺陷型中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0-dhfr_ ；五、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5與質(zhì)粒 pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent 共轉(zhuǎn)染 CH0_dhff 細(xì)胞，在 M 孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞達(dá)到95%融合時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無(wú)抗生素、無(wú)血清的CHO-S-SFM II，500 μ L/孔，轉(zhuǎn)染6h后更換含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用ELISA試劑盒鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按1 10傳代，24h細(xì)胞貼壁后更換為選擇性培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 16d后有陽(yáng)性克隆形成，然后用定向消化的方法將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入24孔板，又傳代至12孔板，經(jīng)ELISA 試劑盒測(cè)定對(duì)陽(yáng)性克隆中10株高表達(dá)的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；六、MTX的加壓培養(yǎng)以MTX加壓篩選，濃度依次為2Xl(T8mmol/L、lXl(T7mmol/L和 5X 10_7mmol/L，最終得到能夠在5X 10_7mmol/L的MTX中正常生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞株，即為高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，其特征在于步驟一所述帶有信號(hào)肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID N0:1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，其特征在于步驟一所述帶有信號(hào)肽的AcAP5基因中加入的信號(hào)肽的基因序列如SEQ ID NO :2所7J\ ο
4.權(quán)利要求1所述高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，涉及高效分泌表達(dá)AcAP5的CHO細(xì)胞株。本發(fā)明是要解決目前用CHO表達(dá)外源基因產(chǎn)物的表達(dá)量低，且無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題。高效分泌表達(dá)AcAP5的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，利用二氫葉酸還原酶缺陷型中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，經(jīng)篩選、擴(kuò)增后得到穩(wěn)定、高效表達(dá)AcAP5的細(xì)胞株。本發(fā)明的CHO細(xì)胞株可以高效表達(dá)AcAP5，表達(dá)量最高達(dá)到12mg/L·72h，且可以工業(yè)化生產(chǎn)。用于抗凝血、抗血栓。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102358893SQ201110304079
公開(kāi)日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者付海燕, 余瓊, 劉威, 張巍 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)