專利名稱：一種判定中國人群tnip1單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及判定中國人群TNIPl單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性的方法。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及身體多系統(tǒng)多器官的復(fù)雜免疫系統(tǒng)疾病。 遺傳和環(huán)境因素共同影響SLE的發(fā)生發(fā)展過程。隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的興起，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一系列SLE相關(guān)基因，如MHC、BLK、ITGAM、STAT4、IRF5、BANKl及ETSl等。盡管如此，SLE發(fā)病機(jī)理仍不是很清楚。在這些候選基因中，TNF誘導(dǎo)蛋白3 (TNFAIP3)結(jié)合蛋白 I (TNIPl)的基因多態(tài)性與諸多自身免疫系統(tǒng)疾病(如SLE、銀屑病等)的發(fā)病率顯著相關(guān)。 TNIPl作為NF-kB的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)維持中扮演十分重要的角色。TNIPl通過直接與TNFAIP3和IkB的g亞基相互作用和抑制NF_kB前體蛋白pl05的剪切來負(fù)性調(diào)控 NF-kB信號通路。
Gateva等研究發(fā)現(xiàn)位于TNIPl內(nèi)含子上(染色體位置為5q33.1)的SNP rs7708392 (C/G)與歐洲人群SLE的發(fā)病率有明顯相關(guān)性。但是這一關(guān)聯(lián)在中國人群中是否存在尚不清楚。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種判定中國人群TNIPl單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性的方法。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn) 一個新的SNPrs79937737，它位于TNIPl基因的內(nèi)含子區(qū)域，位于第5染色體第 150437672核苷酸位置，其前端250個堿基序列如SEQ ID NO:6所示，其后端250個堿基序列如SEQ ID NO:7所示。
一種判定中國人群TNIPl單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性的方法，所述方法是非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法，所述SNP為SNPrs7708392和SNPrs79937737。
作為更進(jìn)一步的優(yōu)選方案，上述方法包括如下步驟(1)基因分型取外周血基因組DNA，鑒定其基因型；(2)統(tǒng)計學(xué)分析采用卡平方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較次要等位基因頻率來分析 SNP是否與疾病相關(guān)以及所采集的樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡，用OR值及95%置信區(qū)間的方式表示SNP與疾病之間的關(guān)聯(lián)程度，用SHEsis軟件進(jìn)行連鎖不平衡及單倍型分析，/7值小于O. 05認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義；(3)統(tǒng)計分析顯示，SNPsrs7708392和rs79937737的基因型頻在SLE病例組和正常對照組中都符合Hardy - Weinberg平衡，但這兩個位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在SLE 病例組和正常組中并沒有顯著性差異，單倍型分析顯示SNPs rs7708392與rs79937737并不處 于連鎖不平衡狀態(tài)，這兩個SNP所產(chǎn)生的單倍型在SLE病例組和正常組中也都沒有顯著性差異。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明是采用非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法檢測位于TNIPl內(nèi)含子上的 SNPrs7708392的基因型，檢測結(jié)果顯示，新發(fā)現(xiàn)位于rs7708392上游5bp處尚未報道的 SNPrs79937737，而且 SNPrs7708392 和 SNPrs79937737 與中國人 SLE 發(fā)病率都不相關(guān)。


圖1是用總探針進(jìn)行非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法分析樣本的基因型。 (A)探針區(qū)和非探針區(qū)的熔融曲線圖；(B)標(biāo)準(zhǔn)化后的溶解曲線圖顯示六種基因型；(C)標(biāo)準(zhǔn)化后的差異曲線圖顯示六種基因型；圖2是對探針去基因序列進(jìn)行測序的結(jié)果，顯示兩個位點(diǎn)存在突變；圖3是引物及總探針、子探針的序列及位置；圖4是用子探針進(jìn)行非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法分析樣本的基因型，其中(B)用子探針I(yè)進(jìn)行分析時的探針區(qū)和非探針區(qū)的熔融曲線圖；(C)用子探針I(yè)進(jìn)行分析時的標(biāo)準(zhǔn)化后的溶解曲線圖；(D)用子探針I(yè)進(jìn)行分析時的標(biāo)準(zhǔn)化后的差異曲線圖；圖5是用子探針進(jìn)行非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法分析樣本的基因型，其中(E)用子探針2進(jìn)行分析時的探針區(qū)和非探針區(qū)的熔融曲線圖；(F)用子探針2進(jìn)行分析時的標(biāo)準(zhǔn)化后的溶解曲線圖；(G)用子探針2進(jìn)行分析時的標(biāo)準(zhǔn)化后的差異曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例
研究人群我們在北京大學(xué)深圳醫(yī)院收集根據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)標(biāo)準(zhǔn)確診的285例SLE病人(男，26例，女，259例；年齡中位數(shù)為29歲；年齡跨度在12 - 55歲之間)和336例正常人 (男，28例，女，308例；年齡中位數(shù)為28歲；年齡跨度在17-46歲之間)。所有正常人均無 SLE家族史或患其他SLE相關(guān)的疾病。本研究獲得深圳醫(yī)院倫理委員會同意及所有參與者的知情同意。
基因型鑒定采用Innogent的全基因組DNA提取試劑盒(Innogent, China),根據(jù)試劑盒說明書要求提取所收集的外周血基因組DNA。采用非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線的方法鑒定樣本的基因型。方法簡述如下首先進(jìn)行不對稱PCR，20 mL體系含基因組DNA模板20 ng,rPCR 緩存液(Takara, Japan), 200 mM dNTPs, O. 5 U rTaq DNA 聚合酶(Takara, Japan), O. 05 mM 正向引物，O. 5 mM反向引物和O. 5 mM C3封閉的探針。PCR反應(yīng)在Bio-Rad S1000 PCR儀上進(jìn)行(Bio-Rad,美國)。PCR擴(kuò)增條件如下94°C預(yù)變性2分鐘，繼之進(jìn)行50個循環(huán)，包括94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸20s，最后72°C延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移10mL PCR產(chǎn)物到HR-1專用的毛細(xì)管中，再加入I mL LCGreen Plus染料(Idaho Technology, USA)后，進(jìn)行高分辨率溶解曲線分析。溶解溫度從55°C上升到90°C，以O(shè). 3°C /s的升溫速度采集溶解曲線。用LightScanner軟件(Idaho Technology, USA)分析所獲得的高分辨率溶解曲線。實(shí)驗(yàn)所用的引物和探針均由LightScanner probe design軟件設(shè)計(Idaho Technology, USA)。引物和探針的序列如下:正向引物SEQ ID N0:1，反向引物SEQ ID NO:2 及三個 C3 封閉的非標(biāo)記探針 probe SEQ ID NO: 3 ；probe-l SEQ ID NO:4 ；probe-2 SEQ ID N0:5。這些引物和探針?biāo)诘奈恢萌鐖D2所示。
統(tǒng)計分析采用卡平方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較次要等位基因頻率(MAF)在病例組與正常組之間的差異來分析SNP是否與疾病相關(guān)以及所采集的樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡。 用OR值及95%置信區(qū)間的方式表示SNP與疾病之間的關(guān)聯(lián)程度。用SHEsis軟件進(jìn)行連鎖不平衡及單倍型分析。P〈0. 05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線是近年來發(fā)展起來的一種高效廉價的SNP檢測方法。 與普通高分辨率溶解曲線分析相比，此法利用一小段非標(biāo)記C3封閉探針來放大突變位置的信息，使得突變位點(diǎn)溶解曲線產(chǎn)生較顯著性偏移，產(chǎn)生較好的基因型區(qū)分度。通常，此方法獲得的溶解曲線能明顯區(qū)分三種類型基因型(野生型，雜合突變及純合突變)。但是， 我們在采用這一方法來檢查SNP rs7708392的基因型時發(fā)現(xiàn)6種曲線類型(如圖廣2)，提示我們探針?biāo)鶛z測的DNA片段上存在可能不止一個突變位點(diǎn)。隨后，DNA測序結(jié)果證實(shí)在 SNP rs7708392上游5 bp處存在一個新的SNP。我們把這個新發(fā)現(xiàn)的SNP序列賦予序號 rs79937737。為了使檢測方法能夠準(zhǔn)確鑒定這兩個SNP的基因型，我們重新設(shè)計2個探針分別針對這兩個SNP。探針序列和位置如圖2所示。溶解曲線分析顯示這兩個探針能夠準(zhǔn)確有效的分別區(qū)分這兩個SNP的基因型(圖3 5)。隨后，我們用這兩個探針分別檢測所有 SLE病例組和正常對照組樣本。
統(tǒng)計分析顯示，SNPs rs7708392和rs79937737的基因型頻在SLE病例組和正常對照組中都符合Hardy - Weinberg平衡。但這兩個位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在SLE病例組和正常組中并沒有顯著性差異(表I)。單倍型分析顯示SNPs rs7708392與 rs79937737并不處于連鎖不平衡狀態(tài)(r2=0. 02)。此外，這兩個SNP所產(chǎn)生的單倍型在SLE 病例組和正常組中也都沒有顯著性差異(表2)。
表I
權(quán)利要求
1.一個新的SNPrs79937737，其特征在于位于TNIPl基因的內(nèi)含子區(qū)域，位于第5染色體第150437672核苷酸位置，其前端250個堿基序列如SEQ ID NO:6所示，其后端250個堿基序列如SEQ ID NO:7所示，此SNP的特征為A/G多態(tài)性。
2.一種判定中國人群TNIPl單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性的方法，其特征在于所述方法是非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法，所述SNP為SNPrs7708392和SNPrs79937737。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述判定中國人群TNIPl單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟 (1)基因分型取外周血基因組DNA，鑒定其基因型； (2)統(tǒng)計學(xué)分析采用卡平方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較次要等位基因頻率來分析SNP是否與疾病相關(guān)以及所采集的樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡，用OR值及95%置信區(qū)間的方式表示SNP與疾病之間的關(guān)聯(lián)程度，用SHEsis軟件進(jìn)行連鎖不平衡及單倍型分析，p值小于O. 05認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義； (3)統(tǒng)計分析顯示，SNPsrs7708392和rs79937737的基因型頻在SLE病例組和正常對照組中都符合Hardy - Weinberg平衡，但這兩個位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在SLE病例組和正常組中并沒有顯著性差異，單倍型分析顯示SNPs rs7708392與rs79937737并不處于連鎖不平衡狀態(tài)，這兩個SNP所產(chǎn)生的單倍型在SLE病例組和正常組中也都沒有顯著性差異。
全文摘要
本發(fā)明公開了判定中國人群TNIP1單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性的方法。本發(fā)明是采用非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法檢測位于TNIP1內(nèi)含子上的SNPrs7708392的基因型，檢測結(jié)果顯示，新發(fā)現(xiàn)位于rs7708392上游5bp處尚未報道的SNPrs79937737，而且SNPrs7708392和SNPrs79937737與中國人SLE發(fā)病率都不相關(guān)。
文檔編號C12N15/11GK103013988SQ20111028565
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者萬峻, 于波, 邵勇, 關(guān)明, 張偉, 陳岳文, 董小林, 張超 申請人:深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心