專利名稱：牛乳鐵蛋白肽及其制備方法
牛乳鐵蛋白肽及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及牛乳鐵蛋白肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗生素作為抗菌和促生長(zhǎng)添加劑在動(dòng)物飼料中使用已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史，但隨著人們認(rèn)識(shí)水平的提高，抗生素在動(dòng)物飼料中的廣泛使用暴露出越來(lái)越多的負(fù)面作用，其中最為嚴(yán)重的，一是能造成畜禽產(chǎn)品中的藥物殘留，直接影響消費(fèi)者的身體健康；二是嚴(yán)重影響動(dòng)物消化道的微生態(tài)平衡，造成一些病原菌耐藥性的發(fā)生，使得針對(duì)由這些病原菌所引起的感染的預(yù)防和治療變得非常困難。目前，細(xì)菌抗藥性問(wèn)題普遍存在，而且耐藥菌株的數(shù)量也顯著增加，一些原來(lái)威脅人類生命的疾病，比如肺結(jié)核等，重又開始大范圍發(fā)生。丹麥?zhǔn)亲钤缃乖陲暳现惺褂每股氐膰?guó)家，從1994年開始，逐步減少抗生素在飼料中的使用。 2003年，世界衛(wèi)生組織(WHO)建議按照丹麥的模式逐步減少抗生素的使用。2006年，歐盟已經(jīng)全面禁止抗生素在動(dòng)物飼料中的使用。雖然我國(guó)還沒(méi)有立法阻止抗生素作為飼料添加劑的使用，也在逐步減少使用量。但是，目前我國(guó)仍有20余種抗生素在動(dòng)物飼料中使用。 隨著我國(guó)加入WT0，抗生素的使用已經(jīng)嚴(yán)重影響了我國(guó)畜牧業(yè)產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。 因此，開發(fā)新型抗生素替代品對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的安全、健康、和諧發(fā)展越來(lái)越重要。
抗菌肽(antibacterial peptides)是指存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界病原微生物侵害、消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類小分子多肽，它是動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。抗菌肽是由生物特定基因編碼，具有廣譜抗菌活性，尤其對(duì)耐藥菌株有明顯的殺滅作用，且不破壞生物體細(xì)胞，無(wú)免疫原性?？咕目纱笾路譃橐韵聨最悮⒕念?(cecropins)、富含脯氨酸殘基的娃皮素(magainin)、富含甘氨酸的蜂毒素(melittin)、富含胱氨酸殘基的防御素(defensin)和富含脯氨酸和精氨酸的cathelicidin族抗菌肽類。 抗菌肽具有高效抗細(xì)菌、真菌、病毒，甚至抗腫瘤活性，在農(nóng)業(yè)和臨床治療上都有廣闊的應(yīng)用前景，是最具開發(fā)前景的抗生素替代品發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛乳鐵蛋白肽(Bovine Lactoferricin,簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)fcinB) 及其制備方法，Lfcin B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳鐵蛋白400倍，能在胃腸道中發(fā)揮更重要的作用。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù) 方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
牛乳鐵蛋白肽的核苷酸序列為
GCTCCAAGAAAGAACGTTAGATGGTGTACTATTTCTCAACCAGAA
TGGTTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGT
GCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGCTTTGGAATGT
ATTAGAGCTATTGCTGAGAAGAAGGCTGATCCTGTTACTTTGGAT
GGTGGTATGGTTTTCGAAGCTGGTAGAGATCCATACAAGTTGAGA
CCAGTTGCTGCTGAAATTTACGGTACTAAGGAATCTCCACAAACT
CATTACTACGCTGTTGCTGTTGTTAAGAAGGGTTCTAACTTTCAA
TTGGATCAATTGCAAGGTAGAAAGTCTTGTCATACTGGTTTGGGT
AGATT
其中牛乳鐵蛋白肽核苷酸序列的活性中心為
TTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGTGCT
CCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTC
該牛乳鐵蛋白妝的氣基酸序列為
aprknvrwctisqpewfkcrrwqwrmkklgapsitcvrrafaleciraiaggmvfeagrdpyklrpvaae iygtkespqt hyyavavvkk gsnfqldqlq grkschtglgr
其中牛乳鐵蛋白肽氨基酸序列的活性部分為
fkcrrwqwrm kklgapsitc vrraf。
該序列共由365個(gè)堿基組成，其中，5’端信號(hào)肽包括48個(gè)堿基，3’端融合蛋白部分包括240個(gè)堿基，活性中心由75個(gè)堿基(從第49位到第123位)組成，編碼具有序列表中的氨基酸序列的Bovine Lactoferricin蛋白，編碼區(qū)中，A占28.1 % (102個(gè))，C占 14. 3% (52個(gè))，6占26.2% (95 個(gè))，T 占 31. 4% (114 個(gè))，A+T 占 59. 5% (216 個(gè))，C+G 占 40. 5% (147 個(gè))。
牛乳鐵蛋白肽的制備方法包括以下步驟
1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
1.1、牛乳鐵蛋白肽基因的合成；
人工合成牛乳鐵蛋白的前I 121氨基酸序列。
1. 2、牛乳鐵蛋白妝基因的克隆；
人工合成一對(duì)引物，并在其5’端分別加上BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。上游引物及下游引物如下
Blf-F 5/ ~TATCGGATCCGCTCCAAGAAAGAACGTT~3/，
Blf-R 5/ ~GGTGCTCGAGTTATCTACCCAAACCAGTATG~3/。
1. 3、構(gòu)建重組表達(dá)載體。
2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白
2.1、含牛乳鐵蛋白肽基因的工程菌的獲得；
2. 2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。
3、蛋白質(zhì)的分離與純化
3.1、融合蛋白的分離；
3. 2、融合蛋白的濃縮；
3. 3、融合蛋白的純化；
3. 4、牛乳鐵蛋白肽的保存。
本發(fā)明的有益效果為
1、在水溶液中呈親水脂的兩個(gè)反向β折疊結(jié)構(gòu)，具有耐熱、在消化道不易被降解、無(wú)抗原性的特征，能調(diào)節(jié)免疫作用，具有廣譜抗菌作用，不干擾腸道有益菌等特性；
2、其對(duì)許多G+和G-均有抗菌作用，如大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等，但不作用于雙歧桿菌等對(duì)人體有益細(xì)菌、同時(shí)還能刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)、參與免疫調(diào)節(jié)；
3、由于其特殊的功能作用，作為飼料添加劑以食品防腐劑的開發(fā)研究，已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)和制造商的重視，成為研究熱點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例基因工程生產(chǎn)牛乳鐵蛋白肽
1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
1. 1> Bovine Lactoferricin I 基因的合成
人工合成牛乳鐵蛋白的前I 121氨基酸序列(下劃線部分為牛乳鐵蛋白肽(共 363bp，121個(gè)氨基酸)
GCTCCAAGAAAGAACGTTAGATGGTGTACTATTTCTCAACCAGAA
TGGTTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGT
GCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGCTTTGGAATGT
ATTAGAGCTATTGCTGAGAAGAAGGCT GATGCTGTTACTTTGGAT
GGTGGTATGGTTTT°C GAAGCTGGTAGAGATCCATACAAGTTGAGA
CCAGTTGCTGCTGAAATTTACGGTACTAAGGAATCTCCACAAACT
CATTACTACGCTGTTGCTGTTGTTAAGAAGGGTTCTAACTTTCAA
TTGGATCAATTGCAAGGTAGAAAGTCTTGTCATACTGGTTTGGGT
AGA TT
保存于pUC19/T0P10 中。
1. 2> Bovine Lactoferricin I 基因的克隆
人工合成一對(duì)引物，并在其5’端分別加上BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。上游引物及下游引物如下
Blf-F 5/ -TATCGGATCCGCTCCAAGAAAGAACGTT-3'，
Blf-R 5/ ~GGTGCTCGAGTTATCTACCCAAACCAGTATG~3/。
以上述Blf-F和Blf-R為引物，以人工合成牛乳鐵蛋白的前I 121氨基酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增體系為10 X buffer 2. 5 μ L，dNTPmix (IOmM) 2 μ L， MgCl2 (25mM)1. 5 μ L, Blf-F primer (10 μ Μ)I μ L, Blf-R primer (10 μ Μ)I μ L, TaKaRa pfu-Taq (5u) O. 25 μ L，模板25ng，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25. O μ L ;擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共35個(gè)循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。
PCR擴(kuò)增得到378bp的片段，將得到的PCR產(chǎn)物回收，連接pMD18_T克隆載體(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)，得到重組載體pMD18-T_Bovine Lactoferricin I,然后將該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆，然后對(duì)陽(yáng)性克隆用BamH I與Xho I雙酶切鑒定，鑒定正確后送Invitrogen公司測(cè)序。
1. 3、構(gòu)建重組表達(dá)載體
將上述步驟1. 2 得到的 pMD18-T_Bovine Lactoferricin I 用 BamH I 與 Xho I 雙酶切，得到的含Bovine Lactoferricin I基因的片段與經(jīng)同樣雙酶切的pET30a(+)表達(dá)載體相連接，得到 pET30a(+)-Bovine Lactoferricin I。
2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白
2.1、含牛乳鐵蛋白肽基因的工程菌的獲得
I)用電擊法將步驟I中步驟1. 3的重組表達(dá)載體pET30a(+)-Bovine Lactoferricin I轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)于德國(guó)默克公司)。
其中電擊法的步驟如下取出-70°C保存的大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞， 冰浴融化；取80ul的Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,加入已連接好的重組表達(dá)載體,于O. 5ml 冰冷的微量無(wú)菌離心管中混勻，置于冰上5min (使感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒充分接觸)，然后迅速將混合液體加入已滅菌的干凈的電轉(zhuǎn)化杯中，輕擊液體以確保細(xì)菌與DNA懸液位于電擊杯底部。擦干電擊槽外的冷凝水和霧氣，將電擊杯放進(jìn)電擊儀，按設(shè)定的參數(shù)，啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的電脈沖。電擊完立即快速加入800ul的LB培養(yǎng)液，然后吸出液體裝入1. 5ml離心管中，放入37°C、150r/min搖床培養(yǎng)1. 5h。吸取50ul的培養(yǎng)菌液鋪板(含氨芐青霉素，其終濃度為 50 100ug/ml ;含氯霉素，其終濃度為34ug/ml的LB培養(yǎng)平板)，37°C培養(yǎng)過(guò)夜14h (先正面放半小時(shí)，讓培養(yǎng)液被瓊脂完全吸收，再反面培養(yǎng)過(guò)夜)。
2)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定從LB平板上挑取5-8個(gè)具氨芐青霉素和氯霉素2種抗性的單克隆菌落，接種到含50-100mg/L氨芐青霉素和34mg/L氯霉素的3ml LB液體培養(yǎng)基中，250rpm 37°C振蕩培養(yǎng)14h。取1-2 μ I菌液為模板，以步驟I中的Blf-F和Blf-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定大腸桿菌中是否含有目的基因片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件及熱循環(huán)設(shè)置同步驟1，結(jié)果表明，該菌株中含有目的基因片段。然后提取該菌株中的質(zhì)粒，用BamH I與Xho I對(duì)其進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，結(jié)果表明酶切條帶中含有與擴(kuò)增基因大小一致的條帶，說(shuō)明pET30a(+)-Bovine Lactoferricin I重組表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta (DE3) 細(xì)胞中。
2. 2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白
取陽(yáng)性單克隆菌株接種于20ml的LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素，其終濃度為50 100ug/ml ;含氯霉素，其終濃度為34ug/ml)中，37°C、250r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)14 16h。按 I %接種菌液于新的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行表達(dá)即吸取200ul菌液，接種于20ml新的LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素，其終濃度為50 lOOug/ml ;含氯霉素，其終濃度為34ug/ml)中，37°C、 250r/min搖床培養(yǎng)約2h，至OD600 = O. 4 O. 6時(shí)，每個(gè)樣品吸取1. Oml于4°C保存，作為初始樣品對(duì)照；然后加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。加入IPTG使其終濃度達(dá)0. 4mg/ml，然后將培養(yǎng)液置于16°C、250r/min搖床培養(yǎng)，分別于16_18h收取菌液于50ml離心管中。4°C，8000xg， 離心lOmin，棄上清，加入1. Oml預(yù)冷(4°C )的PBS完全重懸沉淀，洗滌菌體；4°C,8000xg, 離心IOmin,棄上清,收集菌體細(xì)胞,稱濕重；按Ig 5ml的比例加入純水重懸沉淀,_80°C, 凍15min ； 100°C,煮5min反復(fù)凍煮2 3次后加入5 X Loading Buffer,最大轉(zhuǎn)速離心3min 后，取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，蛋白質(zhì)電泳結(jié)果表明含有牛乳鐵蛋白肽的融合蛋白在大腸桿菌Rosetta(DE3)中大量表達(dá)，其表達(dá)量約占菌體蛋白總量的35%。
3、蛋白質(zhì)的分離與純化
3.1、融合蛋白的分離
待菌體37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)后，4°C，8000Xg離心收集菌體。用生理鹽水洗滌菌體后，4°C，8000Xg離心收集菌體，稱菌體濕重。然后按菌體濕重Ig IOml的比例加入裂解液重懸菌體。超聲波破碎細(xì)胞，用DNase I和RNase A酶處理核酸后，4°C，10000X g離心，收集上清液，可溶性融合蛋白即存在于上清液中。
3. 2、融合蛋白的濃縮
用0°C時(shí)，飽和度為65%的硫酸銨濃縮上清中融合蛋白，使其濃縮比為10 I。然后用Bradford法測(cè)定濃縮液中蛋白質(zhì)濃度。
3. 3、融合蛋白的純化
由于融合蛋白在N端含有His-tag標(biāo)簽蛋白，所以第一步用Ni2+-1MAC親和層析法純化融合蛋白。所用填料為Bio-Rad公司的IMAC聚丙烯酰胺介質(zhì)，層析柱規(guī)格為1. 5mmX IOcm,在層析過(guò)程中所用填料為IOml,其動(dòng)態(tài)載量為4mg蛋白/ml填料,層析最大流速為 3ml/min。
收集洗脫峰，然后調(diào)節(jié)洗脫液的PH值至2.0，按質(zhì)量比為3%的量在洗脫液中加入胃蛋白酶P印sin I 10000，37°C孵育I小時(shí)，使其充分切割標(biāo)簽蛋白還原天然乳鐵蛋白肽，然后72°C熱處理15min，終止反應(yīng)，，調(diào)節(jié)反應(yīng)液PH至7. O。
由于乳鐵蛋白肽屬于小分子肽，分子量為3. lKDa，而融合標(biāo)簽蛋白的分子量為 IOKDa,故兩者分子 量的差異采用凝膠過(guò)濾層析法分離切割后天然肽片段和融合標(biāo)簽，收集洗脫峰，收集乳鐵蛋白肽。
3. 4、乳鐵蛋白肽的保存
將洗脫液經(jīng)透析處理后進(jìn)行冷凍干燥處理，收集乳鐵蛋白肽凍干粉末，于4°C長(zhǎng)期保存。
序列表牛乳鐵蛋白肽的核苷酸序列為GCT CCA AGA AAG AAC GTT AGA TGG TGT ACT ATT TCT CAA CCA GAA TGG TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT GCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC GCT TTG GAA TGT ATT AGA GCT ATT GCT GAG AAG AAG GCT GAT GCT GTT ACT TTG GAT GGT GGT ATG GTT TTC GAA GCT GGT AGA GAT CCA TAC AAG TTG AGA CCA GTT GCT GCT GAA ATT TAC GGT ACT AAG GAA TCT CCA CAA ACT CAT TAC TAC GCT GTT GCT GTT GTT AAG AAG GGT TCT AAC TTT CAA TTG GAT CAA TTG CAA GGT AGA AAG TCT TGT CAT ACT GGT TTG GGT AGATT
權(quán)利要求
1.一種牛乳鐵蛋白肽，其特征在于，該牛乳鐵蛋白肽的核苷酸序列為GCT CCA AGA AAG AAC GTT AGA TGG TGT ACT ATT TCT CAA CCA GAATGG TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGTGCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC GCT TTG GAA TGTATT AGA GCT ATT GCT GAG AAG AAG GCT GAT GCT GTT ACT TTG GATGGT GGT ATG GTT TTC GAA GCT GGT AGA GAT CCA TAC AAG TTG AGACCA GTT GCT GCT GAA ATT TAC GGT ACT AAG GAA TCT CCA CAA ACTCAT TAC TAC GCT GTT GCT GTT GTT AAG AAG GGT TCT AAC TTT CAATTG GAT CAA TTG CAA GGT AGA AAG TCT TGT CAT ACT GGT TTG GGTAGA TT 該牛乳鐵蛋白妝的氣基酸序列為 aprknvrwct isqpewfkcr rwqwrmkklg apsitcvrra faleciraia ekkadavtldggmvfeagrdpyklrpvaae iygtkespqt hyyavavvkk gsnfqldqlq grkschtglgr。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛乳鐵蛋白肽，其特征在于，所述牛乳鐵蛋白肽核苷酸序列的活性中心為TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT GCTCCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC該牛乳鐵蛋白肽氨基酸序列的活性中心為fkcrrwqwrm kklgapsitc vrraf。
3.權(quán)利要求1或2所述的牛乳鐵蛋白肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建； 2)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白； 3)蛋白質(zhì)的分離與純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛乳鐵蛋白肽的制備方法，其特征在于所述步驟I)包括 牛乳鐵蛋白肽基因的合成； 牛乳鐵蛋白妝基因的克?。? 構(gòu)建重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛乳鐵蛋白肽的制備方法，其特征在于所述步驟2)包括 含牛乳鐵蛋白肽基因的工程菌的獲得； 誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的牛乳鐵蛋白肽的制備方法，其特征在于所述步驟3)包括 融合蛋白的分離； 融合蛋白的濃縮； 融合蛋白的純化； 牛乳鐵蛋白肽的保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛乳鐵蛋白肽及其制備方法，牛乳鐵蛋白肽(Bovine Lactoferricin，簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)fcin B)是經(jīng)胃蛋白酶從牛乳鐵蛋白(bLF)N-端(17～41)水解的25個(gè)氨基酸殘基，分子量約為3.1kd；其制備方法包括1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建；2)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白；3)蛋白質(zhì)的分離與純化。本發(fā)明的有益效果為L(zhǎng)fcin B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳鐵蛋白400倍，能在胃腸道中發(fā)揮更重要的作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102993296SQ201110272178
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者夏新界, 李圣翔 申請(qǐng)人:廣州格拉姆生物科技有限公司