專利名稱：一種氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)初，丙酮、丁醇發(fā)酵是僅次于乙醇發(fā)酵的第二大發(fā)酵工業(yè)，但隨著石油化工的發(fā)展，逐步被化學(xué)法替代。隨著石油資源的日益緊缺，生物法生產(chǎn)丙酮、丁醇重新顯示出優(yōu)勢(shì)。受世界石油資源價(jià)格、環(huán)保和全球氣候變化的影響，發(fā)展生物燃料已成為許多國(guó)家提高能源安全、減排溫室氣體、應(yīng)對(duì)氣候變化的重要措施。生物丁醇以其能量密度高、腐蝕性小、對(duì)水的寬容度大、可以和汽油混合等許多優(yōu)于生物乙醇之處而受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。丁醇不僅是優(yōu)良的有機(jī)溶劑和重要的化工原料，能應(yīng)用于化工、塑料、有機(jī)合成、油漆等工業(yè)，而且還是一種極具潛力的新型生物燃料，在替代汽油作為燃料方面優(yōu)于乙醇。丁醇，又稱正丁醇，是重要的有機(jī)化工原料，可用作油漆和表面涂料，也用于生產(chǎn)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)等增塑劑，還用來(lái)制造醋酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸丁酯、正丁胺、氨基樹(shù)脂、乙二醇醚，并可用于表面涂料、皮革處理、香料、橡膠加工助劑和農(nóng)用化學(xué)品等方面。隨著我國(guó)化學(xué)工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的不斷發(fā)展，丁醇將有一定增長(zhǎng)[柴國(guó)梁.國(guó)內(nèi)丁醇市場(chǎng)分析.上?；?，2006，31 O) :49-52] 0從丁醇的消費(fèi)市場(chǎng)看，丙烯酸丁酯和醋酸丁酯需求的強(qiáng)勁增長(zhǎng)將是推動(dòng)丁醇消費(fèi)增長(zhǎng)的主要?jiǎng)恿?。丙酮、丁醇發(fā)酵是丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridium acetobutylicum，簡(jiǎn)稱丙丁菌)等在厭氧條件下將葡萄糖、木糖等代謝為丙酮、丁醇和乙醇的生物化學(xué)過(guò)程。丙丁菌的代謝途徑開(kāi)始是從葡萄糖經(jīng)丙酮酸到大量乙酸、丁酸積累，然后從乙酸和丁酸形成丙酮、 丁醇和乙醇。發(fā)酵體系的氧化還原電位值是PH值、溶解氧濃度、平衡常數(shù)和大量溶解培養(yǎng)基中物質(zhì)的氧化還原電位的綜合反映[Ishizaki A, Snibai H, Hirose Y. Basic aspects ofelectrodepotential change in submerged fermentation[J]. Agric. Biol. Chem., 1974,38 :2399-2405]。胞外的氧化還原電位可以影響胞內(nèi)的酶活、NADH/NAD+的比例，從而可以影響菌體的代謝。目前，有關(guān)氧化還原電位用于發(fā)酵過(guò)程的調(diào)控已經(jīng)在許多專利中出現(xiàn)。中國(guó)專利CN101307339報(bào)道了江南大學(xué)孫志浩等調(diào)節(jié)厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸過(guò)程中菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酸的ORP值，選取適合于菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酸的ORP值作為發(fā)酵控制參數(shù)，以達(dá)到提高琥珀酸產(chǎn)量和降低副產(chǎn)物濃度的目的。中國(guó)專利CN101235397報(bào)道了華東理工大學(xué)王永紅等控制發(fā)酵液的氧化還原電位為-190 -150mv，使得菌體較快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，以高的比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)，可大大提高乳酸菌生產(chǎn)乳酸的產(chǎn)量。中國(guó)專利CN101182555報(bào)道了南京工業(yè)大學(xué)李建等將氧化還原電位控制在最適值，達(dá)到了丁二酸的高效率生產(chǎn)，減少了副產(chǎn)物生成， 縮短了發(fā)酵時(shí)間。丙酮丁醇梭菌的氧化還原電位包括兩方面。一方面由于它缺乏氧化還原電位較高的細(xì)胞色素和細(xì)胞色素酶，對(duì)于許多代謝物就不能或很少氧化，能量供應(yīng)就不足。因此，它不能在有氧或氧化還原電勢(shì)較高的環(huán)境中生長(zhǎng)。另一方面，當(dāng)丙酮丁醇梭菌種子液接入培養(yǎng)基后，細(xì)胞的周?chē)痪簬?lái)的還原性物質(zhì)所包圍，開(kāi)始進(jìn)行代謝。培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物被微生物的氧化還原酶系氧化，并通過(guò)酶系的傳遞，使培養(yǎng)基中的氧及其它氧化物質(zhì)被還原， 細(xì)菌中獲得能量，同時(shí)培養(yǎng)基中的氧化型物質(zhì)濃度降低。也就是說(shuō)，細(xì)菌本身的代謝起到了還原的作用，使自己建立了一個(gè)還原電位低到可以生長(zhǎng)的環(huán)境，得以繼續(xù)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。丙酮丁醇發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)厭氧發(fā)酵的過(guò)程，且可分為兩個(gè)時(shí)期，即產(chǎn)酸期、產(chǎn)醇期。在產(chǎn)酸期，PH值下降，丙丁菌細(xì)胞數(shù)目激烈增加，溶劑產(chǎn)生很少，主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸、 丁酸、H2和(X)2等；在產(chǎn)醇期，丁酸和乙酸被還原，pH值上升，其減酸速率與前發(fā)酵期的升酸速率相似，其中丁酸的減少比乙酸多，轉(zhuǎn)變成丙酮、丁醇等溶劑，在這個(gè)時(shí)期，發(fā)酵現(xiàn)象最旺盛，菌體活力最強(qiáng)，菌體數(shù)量最多[陳駒聲.發(fā)酵法丙酮和丁醇生產(chǎn)技術(shù).北京化學(xué)工業(yè)出版社，1991]。兩個(gè)發(fā)酵階段的氧化還原電位值有一定的變化規(guī)律，產(chǎn)酸期ORP值較高有利于均提升長(zhǎng)，產(chǎn)醇期ORP值較低有利于產(chǎn)醇?，F(xiàn)有的技術(shù)中還沒(méi)有直接通過(guò)篩選合適的氧化劑與還原劑來(lái)設(shè)計(jì)合適的ORP調(diào)控策略來(lái)提高丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量以及提高總?cè)軇┺D(zhuǎn)化率和生產(chǎn)速率的專利或其他文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，以達(dá)到提高丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量、生產(chǎn)速率和轉(zhuǎn)化率的技術(shù)效果。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三步驟，根據(jù)丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇時(shí)氧化還原電位變化的特性，在發(fā)酵體系中引入ORP電極，結(jié)合氧化劑過(guò)氧化氫、硫酸鐵或鐵氰化鉀，以及還原劑維生素C、硼氫化鈉或硫化鈉對(duì)發(fā)酵體系的ORP進(jìn)行調(diào)節(jié)，將厭氧發(fā)酵的初期ORP控制在-550士5mv，當(dāng)0D_ 長(zhǎng)到2后，再將ORP控制在-525 士 5mv。其中，氧化劑過(guò)氧化氫、硫酸鐵、鐵氰化鉀分別為濃度1 2g/L的水溶液；還原劑維生素C、硼氫化鈉或硫化鈉分別為為濃度1 2g/L的水溶液。其中，所述的丙酮丁醇梭菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) XY16CCTCC NO :M 2010011,丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ASl. 134CGMCC1. 134，或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ASl. 135CGMCC 1. 135ο其中，所述的菌種活化步驟中，菌種由凍存的甘油管中接入50mL血清瓶的pH為 6. 0 7. 0的含有淀粉或糖類的能提供碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基中，通入N2或 CO2，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為30 40°C，活化培養(yǎng)12 Mh，用于種子培養(yǎng)基接種和菌種保存。其中，所述的種子培養(yǎng)步驟中，種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. 0 7. 0的含有淀粉或糖類的能提供碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)將500mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基100 400mL，通入隊(duì)或0)2，115 121°C滅菌15 30min，冷卻后接入活化的種子液， 培養(yǎng)溫度為30 40°C，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為8 16h，用于發(fā)酵罐接種。
其中，所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. 0 7. 0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，發(fā)酵罐中放入PH電極和ORP電極，接種量為5% 10% (ν/ν)，溫度為35 40°C，發(fā)酵罐通入隊(duì)或(X)2以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在100 200rpm，并利用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿控制發(fā)酵過(guò)程pH在4. 0 6. 0，發(fā)酵的初期ORP控制在-550士5mv，當(dāng)OD6tltl長(zhǎng)到2后，再將ORP控制在-525士5mv，發(fā)酵總時(shí)間為 36 72h。其中，所述的強(qiáng)堿為2mol/L的氫氧化鈉水溶液，強(qiáng)酸為2mol/L的鹽酸水溶液。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明通過(guò)ORP電極檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程的ORP值變化，加入氧化劑和還原劑，并將體系的PH控制在最適值，達(dá)到丁醇的高效率生產(chǎn)，提高了丁醇以及總?cè)軇┑纳a(chǎn)強(qiáng)度。本發(fā)明采用ORP電極測(cè)定丁醇發(fā)酵體系的ORP值，并利用氧化劑和還原劑控制發(fā)酵體系的ORP值，對(duì)于厭氧發(fā)酵控制參數(shù)的研究和生物基丁醇的制備研究，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。對(duì)比例1 菌種丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum) XY16CCTCC NO :M 2010011。本發(fā)明所有實(shí)施例中的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任何可實(shí)現(xiàn)丙丁菌發(fā)酵丁醇所適用的常規(guī)培養(yǎng)基，在本實(shí)施例中如下配方?；罨胺N子培養(yǎng)基酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸銨2g/L， NaC12g/L, MgS043g/L, KH2PO4lg/L, K2HPO4lg/L, FeSO4 · 7H200. lg/L, pH6. 0。發(fā)酵培養(yǎng)基(P2)碳源(葡萄糖60g/L 單獨(dú)滅菌)，K2HPO4O. 5g/L，KH2PO4O. 5g/L， CH3C00NH42. 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, MnSO4 · H2O 0. Olg/L, NaCl 0. Olg/L, FeSO4 · 7H20 0. 01g/L，玉米漿 lg/L。5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基裝液量為3L。將凍存的甘油管中的菌種接入50mL血清瓶中30mL的活化培養(yǎng)基中，通入隊(duì)，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37°C，活化培養(yǎng)。培養(yǎng)1 后，用無(wú)菌的移液槍將活化的菌種按5%的體積比接入含有300mL種子培養(yǎng)基的500mL血清瓶中，擴(kuò)大培養(yǎng)，1 后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(5L發(fā)酵罐)，接種量為10% (ν/ν)，攪拌轉(zhuǎn)速在120rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)。接種后通入隊(duì)，通氣量為0. 25vvm，IOmin后停止通氣，關(guān)閉通氣口，保證發(fā)酵的厭氧環(huán)境，控制發(fā)酵過(guò)程PH在4. 0 6. 0，通過(guò)校準(zhǔn)的ORP電極測(cè)定發(fā)酵體系的ORP值，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中控制ORP值處于-550士5mv。當(dāng)ORP低于設(shè)定值時(shí)，采用鹽酸和鐵氰化鉀升高ORP值，當(dāng)ORP值高于設(shè)定值時(shí)，采用氫氧化鈉和硫化鈉降低ORP值， 并與不控制ORP值的發(fā)酵結(jié)果對(duì)比，發(fā)酵至總?cè)軇┊a(chǎn)量不再變化。本實(shí)施例與對(duì)照組(對(duì)照組為不調(diào)控0RP，其它條件與本實(shí)施例相同)的對(duì)比結(jié)果如表1。表1 0RP(-550±5mv)與對(duì)照組的發(fā)酵結(jié)果對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三步驟，其特征在于，根據(jù)丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇時(shí)氧化還原電位變化的特性，在發(fā)酵體系中引入ORP電極，結(jié)合氧化劑過(guò)氧化氫、硫酸鐵或鐵氰化鉀，以及還原劑維生素C、硼氫化鈉或硫化鈉對(duì)發(fā)酵體系的ORP進(jìn)行調(diào)節(jié)，將厭氧發(fā)酵的初期ORP控制在-550 士 5mv，當(dāng)OD600長(zhǎng)到2后，再將ORP控制在-525 士 5mv。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于， 氧化劑過(guò)氧化氫、硫酸鐵、鐵氰化鉀分別為濃度1 2g/L的水溶液；還原劑維生素C、硼氫化鈉或硫化鈉分別為為濃度1 2g/L的水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于， 所述的丙酮丁醇梭菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)XY16CCTCC NO :M 2010011，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ASl. 134CGMCC 1. 134，或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ASl. 135CGMCC 1. 135。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于， 所述的菌種活化步驟中，菌種由凍存的甘油管中接入50mL血清瓶的pH為6. 0 7. 0的含有淀粉或糖類的能提供碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基中，通入N2或CO2，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為30 40°C，活化培養(yǎng)12 Mh，用于種子培養(yǎng)基接種和菌種保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于， 所述的種子培養(yǎng)步驟中，種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. 0 7. 0的含有淀粉或糖類的能提供碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)將500mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基100 400mL， 通入N2或C02，115 121°C滅菌15 30min，冷卻后接入活化的種子液，培養(yǎng)溫度為30 40°C，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為8 16h，用于發(fā)酵罐接種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于， 所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PH 6. 0 7. 0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的液體培養(yǎng)基，發(fā)酵罐中放入PH電極和ORP電極，接種量為5% 10% (ν/ν)，溫度為35 40°C，發(fā)酵罐通入N2或(X)2以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在100 200rpm，并利用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿控制發(fā)酵過(guò)程pH在4. 0 6. 0，發(fā)酵的初期ORP控制在-550士5mv，當(dāng)OD600長(zhǎng)到2后，再將ORP控制在-525士5mv，發(fā)酵總時(shí)間為36 72h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于， 所述的強(qiáng)堿為2mol/L的氫氧化鈉水溶液，強(qiáng)酸為anol/L的鹽酸水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵三步驟，根據(jù)丙酮丁醇梭菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁醇時(shí)氧化還原電位變化的特性，在發(fā)酵體系中引入ORP電極，結(jié)合氧化劑過(guò)氧化氫、硫酸鐵或鐵氰化鉀，以及還原劑維生素C、硼氫化鈉或硫化鈉對(duì)發(fā)酵體系的ORP進(jìn)行調(diào)節(jié)，將厭氧發(fā)酵的初期ORP控制在-550±5mv，當(dāng)OD600長(zhǎng)到2后，再將ORP控制在-525±5mv。此方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)于厭氧發(fā)酵控制參數(shù)的研究和生物基丁醇的制備研究，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P7/16GK102296093SQ20111026725
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者吳昊, 奚永蘭, 姜岷, 孫佰軍, 歐陽(yáng)平凱, 郭亭, 陳可泉, 韋萍 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)