專利名稱：水稻種子26kD球蛋白Glb-1基因終止子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻種子^kD球蛋白Glb-I基因終止子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物生物技術(shù)的最新發(fā)展不僅實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀的改良(如提高作物產(chǎn)量，增強(qiáng)抗病、抗蟲、抗除草劑特性，改良品質(zhì)等)，而且使植物成為生物醫(yī)藥和工業(yè)產(chǎn)品的生物反應(yīng)器。絕大多數(shù)禾本科作物具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、耐儲藏、生產(chǎn)規(guī)模容易控制、可直接食用等特點(diǎn)，并且其具備體內(nèi)翻譯后修飾的能力，因而成為第二代轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的理想載體。近年來利用水稻種子生產(chǎn)具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究發(fā)展很快，且已經(jīng)取得了巨大成功。如維生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有預(yù)防和治療缺鐵性貧血和提高自身免疫功能的大豆鐵蛋白(Ferritin)、具有刺激胰島素分泌預(yù)防糖尿病發(fā)生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉過敏癥疫苗等均成功地在水稻中表達(dá)并高水平累積。然而，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)必須在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平同時提高基因表達(dá)。啟動子主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)，終止子則在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平同時起調(diào)控作用。盡管目前廣泛應(yīng)用的終止子，如NOS、0cS，與異源啟動子組合后可啟動報(bào)告基因在植物中的高表達(dá)，能夠滿足生物化學(xué)、生理學(xué)以及細(xì)胞定位方面的研究需求。然而，對于其他能夠提高基因表達(dá)的終止子研究較少。由于一些重要農(nóng)藝性狀以及植物次生代謝產(chǎn)物都是由多基因控制，提高單個基因的表達(dá)對于相關(guān)性狀改良作用不明顯。通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法， 如重復(fù)轉(zhuǎn)化或雜交來實(shí)現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化卻費(fèi)時費(fèi)力。近年來發(fā)展起來的多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以在一個表達(dá)載體中同時插入多個基因，為了避免轉(zhuǎn)基因同源性過高引起的轉(zhuǎn)基因沉默，這些基因需要由不同的啟動子驅(qū)動表達(dá)，不同的終止子終止轉(zhuǎn)錄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一個終止子，名稱為tGlb-Ι，該終止子與nos終止子相比，可以提高外源基因的表達(dá)水平。本發(fā)明所提供的終止子，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。所述嚴(yán)格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS、0. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，1 X SSC，0. SDS中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Νει3Ρ04 Π ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 5X SSC, 0. SDS 中漂洗； 還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. IX SSC,0. 1% SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交， 在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。其中，序列表中序列1由506個核苷酸組成。含有所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述DNA分子的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKII、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或 pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。使用所述DNA分子構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在外源基因轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin))、組成型啟動子或組織特異表達(dá)啟動子(如種子特異表達(dá)的啟動子)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的DNA分子構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個外源基因序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工， 如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因， 賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對 methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。所述重組載體具體可為pGluB-3-tGlb-l。所述 pGluB-3-tGlb-l 是將 pGluB-3-nos 中的nos終止子替換為序列表中序列1所示的tGlb-Ι終止子得到的重組載體。所述表達(dá)盒是指由啟動子、由所述啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的目的基因和位于所述目的基因下游的所述DNA分子組成的。其中，所述啟動子可為組成型啟動子或組織特異表達(dá)啟動子(如胚乳特異性啟動子)。所述目的基因可為蛋白編碼基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎xRNA基因和/或反義RNA 基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將含有所述DNA分子的表達(dá)盒導(dǎo)入目的植物中，得到所述目的基因表達(dá)水平高于將如下表達(dá)盒導(dǎo)入所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物將所述的表達(dá)盒中的所述DNA分子替換為胭脂堿合成酶的nos終止子得到的表達(dá)盒。所述目的植物具體可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，小麥，玉米，高粱或大麥，所述雙子葉植物具體可為大豆，油菜，棉花，煙草，馬鈴薯，甘薯或油桐。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述含有所述DNA分子的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該含有所述DNA分子的表達(dá)盒，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該含有所述DNA分子的表達(dá)盒轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用或作為終止子的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。利用本發(fā)明的終止子與不同的啟動子配合，可提高外源基因在目的植物中的表達(dá)和累積水平，可改良種子品質(zhì)、將具有生理活性的蛋白或短肽導(dǎo)入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農(nóng)產(chǎn)品科技附加值等。本發(fā)明的終止子及其應(yīng)用為利用生物技術(shù)改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場等研究奠定了基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用前景。


圖1為從水稻基因組DNA中PCR擴(kuò)增^kD球蛋白Glb-I基因終止子(tGlb_l) 的電泳圖譜。其中1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為tGlb-Ι的片段。其中，標(biāo)準(zhǔn)分子量大小由下至上依次為:0. Ikb, 0. 2kb,0. 3kb,0. 4kb，0. 5kb，0. 6kb，0. 7kb,0. 8kb,0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb,
1.5kb，2. 0kb，3. 0kb，4. 0kb，5. 0kb，6. 0kb，8. Okb, 10. Okb。圖2為載體pMD-tGlb-1經(jīng)&ic I和EcoR I的雙酶切鑒定圖譜。其中1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為pMD-tGlb-Ι的酶切片段。其中，標(biāo)準(zhǔn)分子量大小由下至上依次為0. Ikb, 0. 2kb，0. 3kb，0. 4kb，0. 5kb，0. 6kb，0. 7kb，0. 8kb，0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb, 1. 5kb，2. Okb, 3. Okb, 4. Okb, 5. Okb, 6. Okb, 8. Okb, 10. Okb，酶切片段由下至上依次為tGlb-1 片段， 506bp ；載體框架片段，2700bp。圖3為載體pGluB-3-tGlb-l的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，Glb-IT為tGlb-1。圖4為載體pGluB-3-tGlb-l經(jīng)Me I和EcoR I雙酶切的鑒定圖譜。其中1為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為pGluB-3-tGlb-l的酶切片段。其中，標(biāo)準(zhǔn)分子量大小由下至上依次為0. Ikb,0. 2kb，0. 3kb，0. 4kb，0. 5kb，0. 6kb，0. 7kb，0. 8kb，0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb, 1. 5kb,
2.Okb, 3. Okb, 4. Okb, 5. Okb, 6. Okb, 8. Okb, 10. Okb,酶切片段由下至上依次為tGlb-1 片段，506bp ；載體框架片段，16. 61Λ。圖5為轉(zhuǎn)pGluB-3-tGlb-l載體Ttl代水稻植株嵌合引物PCR擴(kuò)增電泳圖譜。1為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為以pGluB-3-tGlb-l為模板的陽性對照，3為以未轉(zhuǎn)化株系為模板的陰性對照，4 11為轉(zhuǎn)pGluB-3-tGlb-l植物表達(dá)載體的再生植株。圖6為未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株⑶S染色結(jié)果。其中，1、2、3、4分別為未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株根、莖、葉及種子的染色結(jié)果。圖7為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos植株GUS染色結(jié)果。其中，1、2、3、 4分別為轉(zhuǎn)pGluB-3-nos植株根、莖、葉及種子的染色結(jié)果。圖8為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGlb-l植株⑶S染色結(jié)果。其中，1、 2、3、4分別為轉(zhuǎn)pGluB-3-tGlb-l植株根、莖、葉及種子的染色結(jié)果。圖9為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGlb-l所結(jié)種子的⑶S熒光活性測定結(jié)果。圖10為T1代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGlb-l所結(jié)種子的⑶S熒光活性測
定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、水稻種子^kD球蛋白Glb-I基因終止子(tGlb-Ι)的獲得根據(jù)水稻^kD球蛋白Glb-I基因的cDNA序列(GenBank號為AY427575)，從 GenBank中查找^kD球蛋白Glb-I基因的基因組DNA序列，終止密碼子后506bp的序列即為本發(fā)明的水稻種子26kD球蛋白Glb-I基因的終止子(tGlb-Ι)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增tGlb-Ι。為便于載體構(gòu)建，在引物上分別添加酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。tGlb-Ι的正向引物為tGlb-1 SacF 5' -AAGAGCTCTAGGCTTAGCTGGCTTGCCT-3 ‘ (Sac I)，反向引物為 tGlb-1 EcoR :5' -A GAATTCAAGGACGGATTTGAATTGAG-3‘ (EcoR I)。CTAB 法從野生型水稻 Kitaake (文獻(xiàn) Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 :2417-2424) 葉片中小量提取基因組DNA，以其為模板，以tGlb-l^icF和tGlb-lEcoR為引物，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后94 °C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin,30個循環(huán)，最后 72 °C IOmin0 PCR擴(kuò)增得到506bp的目的條帶，如圖1所示?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，直接連接到 PMD18-T載體(購自TaKaRa公司)上，進(jìn)行測序，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的tGlb-Ι序列大小為 506bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。將測序檢測表明含有tGlb-Ι片段的重組載體命名為pMD-tGlb-1。pMD-tGlb-1經(jīng)&ic I和EcoR I的雙酶切鑒定圖譜如圖2所示。實(shí)施例2、水稻種子^kD球蛋白Glb-I基因終止子(tGlb-Ι)的穩(wěn)定表達(dá)載體構(gòu)建1、tGlb-Ι融合⑶S基因的植物穩(wěn)定表達(dá)載體構(gòu)建用&ic I和EcoR I雙酶切pMD_tGlb_l質(zhì)粒，回收tGlb_l的5(^bp酶切片段，將該片段插入到含有GluB-3啟動子的pGluB-3-nos的McI和EcoR I雙酶切識別位點(diǎn)之間構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體pGluB-3-tGlb-l (其結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示)。pGluB-3-nos按照文獻(xiàn) Qu etal.，J. Exp. Bot. 2008,59 :2417- 所述的方法構(gòu)建以水稻臺中65的基因組DNA 為模板，以GluB-3 正向引物 5，~CCCAAGCTTATTTTACTTGTACTGTTTAACC~3‘ (HIndIII)禾口GluB-3 反向引物 5，AAACCCGGGAGCTTTCTGTATATGCTAATG-3‘ (SmaI)為引物，PCR擴(kuò)增得到GluB-3啟動子，將GluB_3啟動子用HindIII和SmaI雙酶切，插入到pGPTV-35S-HPT(Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008，59 :2417-2424)的 GUS 上游的 HindIII和SmaI位點(diǎn)，得到的重組載體即為pGluB-3-nos。pGPTV-35S_HPT以⑶S為外源基因，nos為終止子。將得到的重組載體pGluB-3-tGlb-l在PCR鑒定的基礎(chǔ)上利用I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定，得到含有506bp tGlb-1的片段，如圖4所示。2、轉(zhuǎn)pGluB-3-tGlb-l水稻的獲得及pGluB-3-nos水稻再生植株的獲得構(gòu)建完成的pGluB-3-tGlb-l表達(dá)載體構(gòu)建經(jīng)過酶切與測序驗(yàn)證其正確性后， 利用凍融法分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，具體方法如下吸取7μ1表達(dá)載體質(zhì)粒加入 ΙΟΟμ 1ΕΗΑ105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻后置于液氮中冷凍7min，之后轉(zhuǎn)入37°C水浴中靜置3min，然后加入800ulYEB液體培養(yǎng)基于靜置恢復(fù)培養(yǎng)池 5h，取400 μ 1菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平Rif 50mg/L)，于倒置培養(yǎng)2 3天。挑取少許農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行目標(biāo)基因的菌落PCR檢測后將陽性菌落在YEB抗性平板上劃線擴(kuò)繁培養(yǎng)，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化水稻品種kitaake的愈傷組織，用潮霉素篩選抗性愈傷，并進(jìn)一步培養(yǎng)分化成幼苗后移栽溫室。利用潮霉素篩選方法(按照文獻(xiàn)Hiei et al.，Plant J. 1994，6 :271-282所述方法進(jìn)行)，獲得8株Ttl代轉(zhuǎn)pGluB-3-tGlb-l水稻植株。利用PCR方法對上述篩選得到的部分轉(zhuǎn)pGluB-3-tGlb-l水稻進(jìn)行PCR分子檢測，PCR引物為tGlb_l和⑶S基因序列的嵌合引物，即:tGlb-l序列反向引物tGlb-lEcoR 5' -AGAATTCAAGGACGGATTTGAATTGAG-3 ‘和 GUS 序列內(nèi)部的正向引物 GUSF185 5 ‘ -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3 ‘。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?MV 預(yù)變性 5min，然后 94 °C 30sec, 55 °C 30sec，72°C lmin,30個循環(huán)，最后72 °C IOmin0 PCR擴(kuò)增得到0. 7kb的目的條帶即為檢測陽性。結(jié)果表明PCR檢測的8株轉(zhuǎn)pGluB-3-tGlb-l植株(表示為Kitaake/ pGluB-3-tGlb-l)均呈陽性(如圖5所示)。按照上述方法，將pGluB-3-nos轉(zhuǎn)入野生型水稻Kitaake，得到9株轉(zhuǎn) pGluB-3-nos 的陽性 pGluB-3-nos 植株(表示為 Kitaake/pGluB-3-nos)。轉(zhuǎn) pGluB-3-nos 水稻植株的PCR檢測方法以tnos序列反向引物tnosR 5' -GATCTAGTAACATAGATGAC-3‘ 和GUS序列內(nèi)部的正向引物GUSF185 5' -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3‘為引物，擴(kuò)增tnos 和GUS基因的嵌合序列，得到500bp的目的條帶即為陽性轉(zhuǎn)化株。T0代轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)的種子和由該種子長成的植株為T1代，依此類推，T2、T3分別表示轉(zhuǎn)基因植株第2代和第3代。實(shí)施例3、水稻種子^kD球蛋白Glb-I基因終止子(tGlb-Ι)的功能驗(yàn)證1、T0 代轉(zhuǎn)基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 和 Kitaake/pGluB-3-tGlb-l 的 GUS 組織化學(xué)檢測對PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/ pGluB-3-tGlb-l的Ttl代植株進(jìn)行組織化學(xué)染色，以未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株為對照。具體步驟為將轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/pGluB-3-tGlb-l 的Ttl代植株和未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株的部分葉片、根、莖桿組織切成小塊；將開花后17天的灌漿期種子用解剖刀從中部縱切開。將處理好的樣品浸泡于GUS染色反應(yīng)液(0. IM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)，IOmM Na2-EDTA (ρΗ7· 0)，5mM鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀， 1. OmM X-Gluc, 0. 1% Triton X-100)，37°C反應(yīng) 0. 5-4 小時。70% 乙醇中保存、觀察。體視鏡下觀察并拍照。結(jié)果如圖6、圖7、圖8所示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株的根、葉片、莖桿和開花后17天的種子的糊粉層和亞糊粉層均未觀察到⑶S表達(dá)；Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 和 Kitaake/pGluB-3-tGlb-l 植株的根、葉片、莖桿均未觀察到 GUS 表達(dá)，T0代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos開花后17天的種子僅在糊粉層和亞糊粉層有所表達(dá)，而Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGlb-l的糊粉層、亞糊粉層及整個胚乳藍(lán)色均清晰可見表達(dá)。結(jié)果表明tGlb-l與nos終止子相比增強(qiáng)了葡萄糖苷酸酶(⑶S)報(bào)告基因在水稻種子胚乳中的表達(dá)強(qiáng)度，但并未改變GUS報(bào)告基因在胚乳中的特異性表達(dá)。2、T0 及 T1 代轉(zhuǎn)基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 和 Kitaake/pGluB-3-tGlb-l 的 GUS熒光活性測定對PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/pGluB-3-tGlb-l的Ttl代及T1代植株開花后17天的灌漿期種子進(jìn)行⑶S定量分析。方法按照 Jefferson 等的熒光檢測方法(Jefferson, Plant Mol. Biol. Report, 1987,5 :387-405) 進(jìn)行。具體為每株取3粒種子，分別置于3個1.5ml印pendorf管中，用研棒將種子碾碎， 加入200 μ 1抽提液(50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH7. 0)，IOmM β -巰基乙醇，IOmM Na2EDTA(pH 8. 0) ,0. 1% SDS, 0. 1 % Triton X-100)，振蕩混勻。4°C 13，OOOrpm 離心 5min,取上清于新管中。10 μ 1上清，加入90 μ 1反應(yīng)液(ImM 4-MUG溶于GUS抽提液)，37°C反應(yīng)60分鐘，加入 900 μ 1終止液(0. 2Μ Na2CO3)，室溫終止反應(yīng)。以4-MU做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用F-4500 (日立)型熒光分光光度計(jì)在360nm激發(fā)波長和460nm吸收波長下檢測相對4-MU含量。以牛血清白蛋白為對照，利用BIO-Rad Protein Assay KitII (購自美國伯樂公司，編號GPR6611)測定蛋白質(zhì)含量。對轉(zhuǎn)基因水稻株系Ttl代所結(jié)種子進(jìn)行GUS熒光活性測定結(jié)果如圖9所示。在8 個 Kitaake/pGluB-3-tGlb-l 的 T0 株系中，GUS 活性最高值為 46. 04pmol 4-MU mirT1 μ
蛋白，最低值為 9. 65pmol 4-MU mirT1 μ g—1 蛋白，平均值為 23. 9 士 12. 7pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白。而9個轉(zhuǎn)Kitaake/pGluB-3-nos對照載體株系中，則⑶S活性最高值為17. 38pmol 4-MU mirT、蛋白，最低值為 2. 39pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 11. 2士5. Opmol 4-MU mW蛋白。Kitaake/pGluB-3-tGlb-l的8個Tci株系GUS表達(dá)量1個小于，其余均大于或者等于對照Kitaake/pGluB-3-nos的Ttl株系平均值，前者最大值是后者最大值的 2. 64倍，是其最小值的19. 23倍，平均值為對照平均值的2. 13倍。對轉(zhuǎn)基因水稻株系部分T1代所結(jié)種子進(jìn)行GUS活性測定(圖10所示)。Kitaake/ pGluB-3-tGlb-l的6個株系GUS活性最高值為40. 72pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，最低值為 14. 4pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 25. 4士9. Ipmol 4-MU mirT1 μ 蛋白。而對照的 7 個 Kitaake/pGluB-3-nos 的 T1 株系中，則 GUS 活性最高值為 21. 52pmol4_MU mirT1 μ 蛋白，最低值為 2. 82pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 9. 9士5. 8pmol4_MU mirT、蛋白。 前者平均值為對照的2. 55倍。結(jié)果表明，tGlb-Ι與nos終止子相比增強(qiáng)了外源基因在水稻胚乳中的表達(dá)水平。
權(quán)利要求
1.DNA分子，其特征在于所述DNA分子為如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒由啟動子、由所述啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的目的基因和位于所述目的基因下游的權(quán)利要求1所述的DNA分子組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其特征在于所述啟動子為組成型啟動子或組織特異表達(dá)啟動子，所述組織特異表達(dá)啟動子為胚乳特異性表達(dá)啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)盒，其特征在于所述目的基因?yàn)榈鞍拙幋a基因和/ 或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎x RNA基因和/或反義RNA基因。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求3-5中任一所述的表達(dá)盒導(dǎo)入目的植物中，得到所述目的基因表達(dá)水平高于將如下表達(dá)盒導(dǎo)入所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物將權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒中的權(quán)利要求1所述的DNA分子替換為nos終止子得到的表達(dá)盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻，小麥，玉米，高粱或大麥，所述雙子葉植物為大豆，油菜，棉花，煙草，馬鈴薯，甘薯或油桐。
9.權(quán)利要求1所述的DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的DNA分子作為終止子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻種子26kD球蛋白Glb-1基因終止子及其應(yīng)用。該終止子為一種DNA分子，為如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。利用本發(fā)明的終止子與不同的啟動子配合，可提高外源基因在目的植物中的表達(dá)和累積水平，為利用生物技術(shù)改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場等研究奠定了基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/10GK102250908SQ20111019796
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者曲樂慶, 李文靜 申請人:中國科學(xué)院植物研究所