專利名稱：擴展青霉菌脂肪酶在制備生物柴油中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請涉及擴展青霉菌脂肪酶在制備生物柴油中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來脂肪酶(Lipase EC)在エ業(yè)應(yīng)用方面取得了很大進展，堿性脂肪酶具有對底物水解效率高、反應(yīng)溫和、無毒、能在一定條件下水解脂肪作用等優(yōu)點，已經(jīng)在洗滌劑、造紙、制革、食品、紡織及輕エ業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，并已經(jīng)成為全世界酶制劑市場上重要的品種。通過對大量的微生物菌種進行選育，現(xiàn)在已經(jīng)獲得了一種產(chǎn)堿性脂肪酶能力較強 的擴展青霉(P. expansium)菌株,并經(jīng)過多年的誘變育種和發(fā)酵エ藝改進,其產(chǎn)脂肪酶的能力已經(jīng)得到大幅度的提高。但是，傳統(tǒng)的菌株育種方法主要依靠隨機的理化誘變，目標(biāo)不明確，費時費カ而且收效不明顯，目前通過采用這些方法來提高該菌株產(chǎn)脂肪酶的能力已經(jīng)非常有限，潛力小。生物柴油(Biodiesel)是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及動物油脂、餐飲垃圾油等為原料油，通過酯交換エ藝制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。生物柴油是生物質(zhì)能的ー種，它是生物質(zhì)利用熱裂解等技術(shù)得到的一種長鏈脂肪酸的單烷基酷。生物柴油是含氧量極高的復(fù)雜有機成分的混合物，這些混合物主要是ー些分子量大的有機物，幾乎包括所有種類的含氧有機物，如醚、酷、醛、酮、酚、有機酸、醇
坐寸o生物柴油作為全球能源緊缺狀況下的一種優(yōu)良的可替代能源，具有廣闊的市場應(yīng)用價值，是目前研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明申請即是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供ー種能夠高效合成脂肪酶的青霉基因工程菌的方法。具體來說，本發(fā)明申請所述的一種獲得高效表達脂肪酶菌株的方法，其特征在于所述的方法包括如下的步驟I、獲得潮霉素抗性表達盒并克隆至目標(biāo)質(zhì)粒上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒；2、分別擴增青霉的脂肪酶基因(PEL)、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PgpdA)和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)，得到有強啟動子驅(qū)動的PEL基因表達盒；3、將該PEL基因表達盒插入到潮霉素抗性的重組質(zhì)粒中，獲得了含潮霉素篩選標(biāo)記的PEL基因超表達載體；4、將含潮霉素篩選標(biāo)記的PEL基因超表達載體轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將PEL基因表達盒轉(zhuǎn)化到青霉菌株中，獲得高表達脂肪酶的青霉基因工程菌。
其中所述的青霉菌為擴展青霉。所述的目標(biāo)質(zhì)粒為下列之一pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。本發(fā)明申請還涉及將所述的青霉基因工程菌應(yīng)用于制備脂肪酶。所述的應(yīng)用是將所述的青霉基因工程均以5-20%接重量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35°C、200-300rpm條件下，發(fā)酵2天后，經(jīng)分離純化得到所述的脂肪酶。通常，是將所述的青霉基因工程菌以菌絲體或孢子懸液接入種子培養(yǎng)基在25-35 °C、200-300rpm條件下培養(yǎng)24小時后，以5% -20 %接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35°CU50-300rpm條件下發(fā)酵2天后，經(jīng)分離純化得到所述的脂肪酶。本發(fā)明中所用到的培養(yǎng)基如下PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯，200 ;蔗糖，20 ;瓊脂，15 ；PH自然；MM 培養(yǎng)基IM K2HPO4-KH2PO4 (PH7. 0) 10mL，M-N(MgS04 7H20 30g/L，NaCl15g/L)20mL, I % CaCl2 2H20 lmL，20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4 I OmL, Sporeelement (ZnSO4 7H20 lOOmg/L,CuSO4 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L,MnSO4 H2O lOOmg/L,Na2MoO4 2H20 lOOmg/L) 5mL,20% NH4NO3 2. 5mL，無菌水 941. 5mL ；IM 培養(yǎng)基1.25M K-buf f er (PH4. 9) IOmL, M-N (MgSO4 7H20 30g/L, NaCl15g/L)20mL, I % CaCl2 2H20 lmL，20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4 I OmL, Sporeelement (ZnSO4 7H20 lOOmg/L,CuSO4 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L,MnSO4 H2O lOOmg/L,Na2MoO4 2H20 lOOmg/L) 5mL,20% NH4NO3 2. 5mL，50% 甘油 IOmL, IM MES (PH5. 5)40mL, IOOmMAS (こ酰丁香酮)2mL,無菌水898. 7mL ；CM培養(yǎng)基加一半頂培養(yǎng)基的葡萄糖量，外加I. 5%瓊脂，其它成份同頂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基(%):黃豆餅粉 4，玉米淀粉 0. 8，Na NO3 0. 3，Na2HPO4 0. 2，K2SO4
0.25，MgSO4 0. 03，F(xiàn)eSO4 0. 003 ；發(fā)酵培養(yǎng)基(%):黃豆餅粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4O. 3，MgSO4 0. 035，F(xiàn)eSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02。本發(fā)明所述的青霉基因工程菌及其制備與應(yīng)用的有益效果主要體現(xiàn)在I、運用基因工程技術(shù)對青霉菌進行改良，育種目標(biāo)明確，效率高；2、所得工程菌產(chǎn)脂肪酶能力強，比工程菌的出發(fā)青霉菌菌株提高了 70%以上。本發(fā)明申請還涉及利用所述的改型脂肪酶制作生物柴油的方法用生物酶法合成生物柴油，即用動物油脂和低碳醇通過脂肪酶進行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，制備相應(yīng)的脂肪酸甲酯及こ酷。酶法合成生物柴油具有條件溫和、醇用量小、無污染排放的優(yōu)點。由于利用物酶法合成生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、醇用量小、無污染物排放等優(yōu)點，具有環(huán)境友好性，因而日益受到人們的重視。具體來說，所述的方法包括如下步驟I、原料的預(yù)處理將生物油脂過濾去除雜質(zhì)，然后進行攪拌得到乳化，其中攪拌速度為 5000-10000rpm，攪拌時間為 5_15min ；2、酯交換反應(yīng)步驟將摩爾比為I : 1-3的油脂和甲醇或こ醇加入反應(yīng)容器中，然后加入上述得到的改型擴展青霉菌脂肪酶和有機溶劑，在20-50°C的反應(yīng)條件下，密閉混合反應(yīng)6-24小時，在反應(yīng)的過程中，再次加入甲醇或こ醇，毎次加入甲醇或こ醇與油脂的摩爾比為1-3:1;3、生物柴油的獲得反應(yīng)結(jié)束后，將所述的脂肪酶從反應(yīng)物中分離出來，再將反應(yīng)產(chǎn)物進行離心分層，靜置后分離處下層的粗甘油，上層液體進行蒸餾，回收有機溶劑，得到成品生物柴油。其中，在步驟2中，所述的改型擴展青霉菌脂肪酶與原料油的摩爾比為I : 12-20，有機溶劑與原料油的摩爾比為I : 0. 5-1.5。所述的有機溶劑包括但不限于石油醚、異辛烷、正己烷、正庚烷、環(huán)己烷和三氯甲燒。所述的原料油包括但不限于菜籽油、大豆油、棉籽油、花生油、玉米油、豬油、魚油和微生物油脂。本發(fā)明申請所得到的生物柴油，具有以下的優(yōu)點I.具有優(yōu)良的環(huán)保特性主要表現(xiàn)在由于生物柴油中硫含量低，使得ニ氧化硫和硫化物的排放低，可減少約30% (有催化劑時為70%)；2.生物柴油中不含對環(huán)境會造成污染的芳香族烷烴，因而廢氣對人體損害低于柴油，檢測表明，與普通柴油相比，使用生物柴油可降低90%的空氣毒性，降低94%的患癌率；由于生物柴油含氧量高，使其燃燒時排煙少，一氧化碳的排放與柴油相比減少約10%(有催化劑時為95% )，生物柴油的生物降解性高；3.具有較好的低溫發(fā)動機啟動性能。無添加劑冷濾點達_20°C ;4.具有較好的潤滑性能使噴油泵、發(fā)動機缸體和連桿的磨損率低，使用壽命長；5.具有較好的安全性能，由于閃點高，生物柴油不屬于危險品。因此，在運輸、儲存、使用方面的安全性又是顯而易見的；6.具有良好的燃料性能十六烷值高，使其燃燒性好于柴油，燃燒殘留物呈微酸性，使催化劑和發(fā)動機機油的使用壽命加長；7.具有可再生性能作為可再生能源，與石油儲量不同，其通過農(nóng)業(yè)和生物科學(xué)家的努力，可供應(yīng)量不會枯竭；8.無須改動柴油機，可直接添加使用，同時無需另添設(shè)加油設(shè)備、儲存設(shè)備及人員的特殊技術(shù)訓(xùn)練；9.生物柴油以一定比例與石化柴油調(diào)和使用，可以降低油耗、提高動カ性，并降低尾氣污染。


附圖為超表達載體pCHAMBIA2302: : PgpdA-PEL-TtrpC的構(gòu)建路線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明申請所述的本發(fā)明申請所述的獲得高效表達脂肪酶菌株的方法以及利用該脂肪酶生產(chǎn)生物柴油的方法進行進一步描述，目的是為了公眾更好的理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，而不是對所述技術(shù)內(nèi)容的限制，事實上，在本發(fā)明精神實質(zhì)內(nèi)，對本發(fā)明申請所述方法的改進，目標(biāo)質(zhì)粒和限制性內(nèi)切酶的替換都是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員無需創(chuàng)造性的勞動即可獲得的，因此都在本發(fā)明申請所要求保護的技術(shù)方案之內(nèi)。
實施例一、超表達載體的構(gòu)建采用如下的步驟(I)利用限制性內(nèi)切酶Sac I，Kpn I將潮霉素抗性表達盒從質(zhì)粒PV2+上酶切出來，片段經(jīng)凝膠回收，克隆到PCAMBIA2300質(zhì)粒的相應(yīng)酶切位點上，獲得具有潮霉素抗性的重組質(zhì)粒PCHAMBIA2302 ;潮霉素表達盒也可來自其它含該序列的任何DNA或者直接合成，用于構(gòu)建PEL基因超表達載體的質(zhì)粒除pCAMBIA2300タト，還可用能在絲狀真菌中表達的質(zhì)粒如 pCAMBIA1300、pCAMBIA3300 等 pCAMBIA 系列載體和 pHB 載體；(2)根據(jù)擴展青霉菌P. expansium的脂肪酶基因PEL (AF330635)的序列設(shè)計引物(正向引物TGACTAGT ATGTTGirCAACTACCAATCTTT下劃線的序列為限制性酶Spe I切點；反向引物:TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下劃線的序列為限制件酶Not I切點)，利用PCR技術(shù)擴增全基因序列，PCR反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，35個循環(huán)；72°C IOmin ； (3)根據(jù)質(zhì)粒 pPAN7_l (Punt et al. 1987 Gene 56:117-124)的序列設(shè)計引物(正向引物GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA,下劃線的序列為限制性酶Not I切點；反向引物GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC,下劃線的序列為限制性酶PmeI切點)，利用PCR技術(shù)擴增出色氨酸合成酶終止子TtrpC，PCR反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s, 35 個循環(huán)；72で IOmin ；(4)取(2)和(3)的反應(yīng)液各 I U L 作為模板，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作為正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作為反向引物，進行PCR擴增，PCR 的反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 150s，35 個循環(huán)；72°C IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠柱回收，并克隆到PMD-18-T :載體，獲得中間載體PMD-18-T::PEL-TtrpC ；(5)根據(jù)質(zhì)粒 pPAN7_l (Punt et al. 1987 Gene 56 :117-124 的序列設(shè)計引物(正向引物GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下劃線的序列為限制性酶Not I切點；反向引物GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下劃線的序列為限制性酶Pme I切點)利用PCR技術(shù)擴增強啟動子PgpdA。PCR反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s，72°C 150s，35個循環(huán)；72V IOmin0利用限制性內(nèi)切酶Sal I和Spe I將PgpdA克隆到載體 PMD-18-T: :PEL-TtrpC 的相應(yīng)位點，獲得中間載體 PMD-18-T: :PgpdA-PEL-TtrpC ；(6)利用限制內(nèi)切酶 Sal I 和 Pme I 對載體 PMD-18-T: :PgpdA-PEL-TtrpC 進行消化，回收表達盒PgpdA-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相應(yīng)位點，獲得最終載體PCHAMBIA2302: :PgpdA-PEL_TtrpC，整個的構(gòu)建過程如附圖所示；(7)對含有最終載體pCHAMBIA2302: : PgpdA-PEL-TtrpC的菌進行擴大培養(yǎng)，并抽提質(zhì)粒，利用凍融法轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌EHA105，隨機挑選6株轉(zhuǎn)化子，以(TGACTAGTATGTTGITCAACTACCAATCTTT)作為正向引物；以(TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC)作為反向引物，以載體PMD-18-T: =PEL-TtrpC為陽性對照，空EHA105為陰性對照，對這6株菌進行PCR鑒定，結(jié)果顯示這6株菌均為陽性。實施例ニ、青霉基因工程菌的獲得所述青霉基因工程菌的獲得包括如下的步驟(I)挑取分離純化后的野生型青霉接種于PDA平板上，于28°C培養(yǎng)20天左右，用無菌水洗下成熟孢子；(2)將實例一中含終載體 pCHAMBIA2302: :PgpdA-PEL-TtrpC 的工程農(nóng)桿菌 EHA105接種于含有鏈霉素、卡那霉素(均為IOOii g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中28°C，200rpm過夜培養(yǎng)，用含有鏈霉素和卡那霉素(均為100 u g/ml)的MM培養(yǎng)基重新活化，280C，220rpm培養(yǎng)48小吋。吸取適量的培養(yǎng)物5000rpm離心去上清，并用IM液體培養(yǎng)基洗滌，最后用IM液體培養(yǎng)基稀釋至0D600 = 0. 15，然后在28°C，220rpm的條件下培養(yǎng)6-8小時，至0D600 =
0.5-0. 6 ；(3)將第(I)步得到的新鮮孢子配制成I X IO7個/mL濃度的懸浮液，隨后取上述孢子懸液與步驟(2)中的工程農(nóng)桿菌等體積混合，取200 UL均勻涂布到鋪有玻璃紙的頂固體培養(yǎng)基(含AS 200 u g/mL)之上，28°C共培養(yǎng)60h，然后將玻璃紙反鋪到含有潮霉素(100 ii g/mL轉(zhuǎn)化選擇抗生素)、頭孢菌素(500 ii g/mL,抑制農(nóng)桿菌生長抗生素)的PDA培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)2天，揭下玻璃紙，在28°C條件下培養(yǎng)1-3天，將抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子挑出接 種到ニ篩培養(yǎng)基上，如穩(wěn)定傳代，即是所述的青霉基因工程菌，如此獲得了 30株青霉基因工程菌。隨機挑選5株轉(zhuǎn)化子進行擴大培養(yǎng)，并分別抽提基因組DNA，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作為正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作為反向引物，以載體PMD-18-T: :PEL-TtrpC為陽性對照，野生型青霉基因組DNA為陰性對照，對這5株菌進行PCR鑒定，結(jié)果顯示這5株菌均為陽性。MM培養(yǎng)基的成分如下所述IM K2HPO4-KH2PO4 (PH7. 0) IOmL, M-N (MgSO4 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL, I %CaCl2 *2H20 lmL，20%葡萄糖 10mL，0.01% FeSO4 IOmL, Spore element (ZnSO4 *7H20 IOOmg/L, CuSO4 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 H2O lOOmg/L, Na2MoO4 2H20 lOOmg/L) 5mL,20% NH4NO3 2. 5mL，無菌水 941. 5mL。IM培養(yǎng)基的成分如下所述IM K-buf fer (PH4. 9) IOmL, M-N (MgSO4 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL, I %CaCl2 *2H20 lmL，20%葡萄糖 10mL，0.01% FeSO4 IOmL, Spore element (ZnSO4 *7H20 IOOmg/L, CuSO4 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 H2O lOOmg/L, Na2MoO4 2H20 lOOmg/L) 5mL,20 % NH4NO3 2. 5mL, 50 % 甘油 IOmL, IM MES (PH5. 5) 40mL, IOOmM AS (こ酰丁香酮)2mL,無菌水 898. 7mLCM培養(yǎng)基加一半頂培養(yǎng)基的葡萄糖量，外加I. 5%瓊脂，其它成份同頂培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯，200 ;蔗糖，20 ;瓊脂，15 ；PH自然。實施例三本發(fā)明申請是在有機溶劑油——水界面上完成的酯交換反應(yīng)，酷交換合成酯化率可達到85-95%。本發(fā)明中使用的脂肪酶是采用本發(fā)明得到的改型擴展青霉菌脂肪酶，然后采用固定化處理的方法，其中，所述的固定化方法包括如下步驟在緩沖液中加入酶粉，攪拌使其充分溶解，然后將一定量的硅藻土加入酶液中，恒溫振蕩一定時間后，離心收集固體，將固定化載體用丙酮清洗3-5次，使載體顆粒分散，再用蒸餾水清洗3-5次，將丙酮洗掉，冷凍干燥后即得到固定化的脂肪酶。實施例四
具體來說，所述的方法包括如下步驟I.原料的預(yù)處理將菜籽油過濾去除雜質(zhì)，然后進行攪拌得到乳化，其中攪拌速度為5000rpm,攪拌時間為15min ；2.酯交換反應(yīng)步驟將摩爾比為I : 3的菜籽油和甲醇加入反應(yīng)容器中，然后加入上述得到的固定化的改型擴展青霉菌脂肪酶和正己烷，所述的改型擴展青霉菌脂肪酶與菜籽油的摩爾比為I : 12，正己烷與菜籽油的摩爾比為I : 0.5-1. 5，在20°C的反應(yīng)條件下，密閉混合反應(yīng)24小時，在反應(yīng)的過程中，再次加入甲醇，毎次加入甲醇與菜籽油的摩爾比為1-3:1;3.生物柴油的獲得反應(yīng)結(jié)束后，將所述的脂肪酶從反應(yīng)物中分離出來，再將反 應(yīng)產(chǎn)物進行離心分層，靜置后分離處下層的粗甘油，上層液體進行蒸餾，回收正己烷，得到成品生物柴油。實施例五所述的方法包括如下步驟I.原料的預(yù)處理將花生油過濾去除雜質(zhì)，然后進行攪拌得到乳化，其中攪拌速度為IOOOOrpm,攪拌時間為5min ；2.酯交換反應(yīng)步驟將摩爾比為I : I的花生油和こ醇加入反應(yīng)容器中，然后加入上述得到的改型擴展青霉菌脂肪酶和環(huán)己烷，所述的改型擴展青霉菌脂肪酶與花生油的摩爾比為I : 12-20，環(huán)己烷與花生油的摩爾比為I : 0. 5-1. 5，在50°C的反應(yīng)條件下，密閉混合反應(yīng)6小時，在反應(yīng)的過程中，再次加入こ醇，毎次加入こ醇與花生油的摩爾比為1-3 I ；3.生物柴油的獲得反應(yīng)結(jié)束后，將所述的脂肪酶從反應(yīng)物中分離出來，再將反應(yīng)產(chǎn)物進行離心分層，靜置后分離處下層的粗甘油，上層液體進行蒸餾，回收環(huán)己烷，得到成品生物柴油。實施例六具體來說，所述的方法包括如下步驟I.原料的預(yù)處理將豬油過濾去除雜質(zhì)，然后進行攪拌得到乳化，其中攪拌速度為7000rpm,攬拌時間為IOmin ；2.酯交換反應(yīng)步驟將摩爾比為I : 2的豬油和甲醇加入反應(yīng)容器中，然后加入上述得到的改型擴展青霉菌脂肪酶和石油醚，所述的改型擴展青霉菌脂肪酶與豬油的摩爾比為I : 12-20，石油醚與豬油的摩爾比為I : 0. 5-1. 5，在20-50°C的反應(yīng)條件下，密閉混合反應(yīng)6-24小吋，在反應(yīng)的過程中，再次加入甲醇，毎次加入甲醇與豬油的摩爾比為1-3 I ；3.生物柴油的獲得反應(yīng)結(jié)束后，將所述的脂肪酶從反應(yīng)物中分離出來，再將反應(yīng)產(chǎn)物進行離心分層，靜置后分離處下層的粗甘油，上層液體進行蒸餾，回收石油醚，得到成品生物柴油。依據(jù)本發(fā)明申請獲得的改型擴展青霉菌脂肪酶加工制造生物柴油，有效的緩解了能源緊缺的問題，并且所述方法反應(yīng)時間短、エ藝簡化、生物柴油的轉(zhuǎn)化率高，并且該方法還具有能耗低、產(chǎn)品易于回收和無污染物排放等特點。
權(quán)利要求
1.一種獲得高效表達脂肪酶菌株的方法，其特征在于所述的方法包括如下的步驟 1)獲得潮霉素抗性表達盒并克隆至目標(biāo)質(zhì)粒上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒； 2)分別擴增青霉的脂肪酶基因(PEL)、構(gòu)巢曲霉的強啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PgpdA)和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)，得到有強啟動子驅(qū)動的PEL基因表達盒; 3)將該PEL基因表達盒插入到潮霉素抗性的重組質(zhì)粒中，獲得了含潮霉素篩選標(biāo)記的PEL基因超表達載體； 4)將含潮霉素篩選標(biāo)記的PEL基因超表達載體轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將PEL基因表達盒轉(zhuǎn)化到青霉菌株中，獲得高表達脂肪酶的青霉基因工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得高效表達脂肪酶菌株的方法，其特征在于其中所述的青霉囷為擴展青霉。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得高效表達脂肪酶菌株的方法，其特征在于所述的目標(biāo)質(zhì)粒為下列之一PCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。
4.利用權(quán)利要求I所得到的青霉基因工程菌生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于所述的方法是將所述的青霉基因工程均以5-20%接重量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-35°C、200-300rpm條件下，發(fā)酵2天后，經(jīng)分離純化得到所述的脂肪酶。
5.利用權(quán)利要求4所得到的脂肪酶生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟 1)原料的預(yù)處理將生物油脂過濾去除雜質(zhì)，然后進行攪拌得到乳化，其中攪拌速度為 5000-10000rpm，攪拌時間為 5_15min ； 2)酯交換反應(yīng)步驟將摩爾比為I: 1-3的油脂和甲醇或こ醇加入反應(yīng)容器中，然后加入上述得到的改型擴展青霉菌脂肪酶和有機溶劑，在20-50°C的反應(yīng)條件下，密閉混合反應(yīng)6-24小時，在反應(yīng)的過程中，再次加入甲醇或こ醇，毎次加入甲醇或こ醇與油脂的摩爾比為1-3 I ； 3)生物柴油的獲得反應(yīng)結(jié)束后，將所述的脂肪酶從反應(yīng)物中分離出來，再將反應(yīng)產(chǎn)物進行離心分層，靜置后分離處下層的粗甘油，上層液體進行蒸餾，回收有機溶劑，得到成品生物柴油。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在干其中，在步驟2)中，所述的改型擴展青霉菌脂肪酶與原料油的摩爾比為I : 12-20，有機溶劑與原料油的摩爾比為I 0. 5-1. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于所述的有機溶劑包括石油醚、異辛烷、正己烷、正庚烷、環(huán)己烷或三氯甲烷。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于所述的原料油包括菜籽油、大豆油、棉籽油、花生油、玉米油、豬油、魚油或微生物油脂。
全文摘要
本發(fā)明申請?zhí)峁┮环N獲得高效表達脂肪酶菌株的方法以及利用該方法得到高表達的脂肪酶在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用，包括原料的預(yù)處理將生物油脂過濾去除雜質(zhì)，進行攪拌得到乳化；酯交換反應(yīng)步驟將摩爾比為1∶1-3的油脂和甲醇或乙醇加入反應(yīng)容器中，然后加入上述得到的改型擴展青霉菌脂肪酶和有機溶劑，在20-50℃的反應(yīng)條件下，密閉混合反應(yīng)6-24小時，在反應(yīng)的過程中，再次加入甲醇或乙醇，每次加入甲醇或乙醇與油脂的摩爾比為1-3∶1；生物柴油的獲得反應(yīng)結(jié)束后，將所述的脂肪酶從反應(yīng)物中分離出來，再將反應(yīng)產(chǎn)物進行離心分層，靜置后分離處下層的粗甘油，上層液體進行蒸餾，回收有機溶劑，得到成品生物柴油。
文檔編號C12R1/83GK102864164SQ20111018552
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者王劍英, 陳健, 王宏, 蘭瑛 申請人:深圳市綠微康生物工程有限公司