專利名稱：生產(chǎn)角鯊烯的微藻新菌株的制作方法
生產(chǎn)角鯊烯的微藻新菌株 本發(fā)明是關(guān)于特別適用于角鯊烯的生產(chǎn)和應(yīng)用的一種微藻新菌株。角鯊烯是一種三萜類化合物，分子結(jié)構(gòu)為三十碳五十氫的異戊二烯，其分子式為2,6,10，15，19，23-六甲基-2,6,10，14，18，22 二十四碳六烯。這是一種所有高等生物，包括在人類身上(皮脂中可以找到)自然分泌的脂質(zhì)。角鯊烯實(shí)際是膽固醇、類固醇激素和維生素D的一種生物合成的基礎(chǔ)中間體(一種膽固醇代謝酶，角鯊烯單加氧酶，在氧化角鯊烯分子的其中一個(gè)鏈的同時(shí)，誘導(dǎo)環(huán)化作用并產(chǎn)生羊毛固醇，后者將轉(zhuǎn)化為膽固醇和其他類固醇)。在工業(yè)中，角鯊烯主要用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)。作為食用添加，通常是被制成為角鯊烯膠囊或油制品。
在化妝品領(lǐng)域，其分子可作為保濕霜里面的一種抗氧化劑，抗靜電劑和潤(rùn)膚保濕齊U，迅速滲透進(jìn)入皮膚，不留下痕跡，沒有油膩感，與其它油和維生素混合使用效果良好。在這個(gè)領(lǐng)域使用的時(shí)候，請(qǐng)注意，由于角鯊烯性質(zhì)極不穩(wěn)定出個(gè)不飽和烴)，飽和形式的角鯊?fù)?加氫反應(yīng)制得)是最佳的抗氧化劑，現(xiàn)在市場(chǎng)上售賣的也是這種，一般來說其純度水平非常高(99% )。毒理學(xué)研究表明，按照目前在化妝品中使用的濃度，角鯊烯和角鯊?fù)椴]有毒性，對(duì)人體皮膚無刺激，不致敏。在制藥領(lǐng)域，角鯊烯可以用作疫苗輔助佐劑。這些佐劑物質(zhì)能夠刺激免疫系統(tǒng)，增加對(duì)疫苗的反應(yīng)。以乳液形式添加到疫苗物質(zhì)里，使疫苗具有更強(qiáng)免疫力，自1977年以來，角鯊烯已用于流感疫苗(FLUAD復(fù)立達(dá)，奇龍公司[CHIRON]，預(yù)防季節(jié)性流感的疫苗)，每劑加入10毫克的角鯊烯。由于所有的疫苗都含有角鯊烯，其乳液呈乳白色。角鯊烯也用作疫苗佐劑，尤其是實(shí)驗(yàn)性疫苗，抗瘧疾藥物或針對(duì)H5N1和2009年HlNl新型病毒的抗流感疫苗，如下-葛蘭素史克公司所使用的佐劑系統(tǒng)AS03里用于對(duì)抗2009年流感大流行的Pandemrix和Arepanrix疫苗的專利成分，-諾華公司所使用的佐劑系統(tǒng)MF59里面的專利成分。角鯊烯也被用于添加到抗流感疫苗，通過產(chǎn)生記憶⑶4細(xì)胞刺激人體免疫反應(yīng)。在銷售中的產(chǎn)品中，這是對(duì)抗季節(jié)性流感的和病毒抗原聯(lián)合制成的抗流感疫苗的第一種水包油助劑。角鯊烯的純度在這一應(yīng)用領(lǐng)域至關(guān)重要。事實(shí)上，如果內(nèi)服，角鯊烯被視為完全安全的；但是作為注射劑，則備受質(zhì)疑。事實(shí)上，在醫(yī)療領(lǐng)域，對(duì)服用人群的傷害風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)劇增，如果角鯊烯含有雜質(zhì)，因?yàn)楦鶕?jù)其定義，這種助劑將會(huì)誘導(dǎo)人體對(duì)其雜質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。因此，必須獲得高品質(zhì)的、無雜質(zhì)(雜質(zhì)指極微量的金屬，尤其是汞和其它有毒物質(zhì))的角鯊烯。
文獻(xiàn)中提出了幾種制備角鯊烯的途徑。人們常常在軟骨魚類的肝臟中發(fā)現(xiàn)這種化合物，如深海鯊魚(角鯊烯因此得名)。因此,這成為鯊魚被過度捕撈的原因之一，鯊魚已經(jīng)因其珍貴的鰭而成為被獵殺的對(duì)象。此后，鯊魚的肝臟也被用于出售，以生產(chǎn)出“有益健康”的優(yōu)質(zhì)膠囊。但是，即使售賣的角鯊烯主要是從鯊魚肝臟中提取，也不能完全排除衛(wèi)生問題。事實(shí)上，鯊魚可能被病原體感染，可能產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)。此外，鯊魚肝臟這樣一個(gè)消除毒素和凈化身體機(jī)能的器官，也可能含有對(duì)人體有害的毒素，例如carchatoxin0這些令人憂慮的環(huán)境問題(鯊魚的強(qiáng)烈嚴(yán)重退化)和衛(wèi)生問題(魚肝也儲(chǔ)存著令人擔(dān)憂的、對(duì)健康有害的毒素)，促使人們從植物提取角鯊烯。
因此，從橄欖油、棕櫚油、其他油類作物，或者從莧屬植物、種籽、米糠、小麥胚芽中將其分離出來是有可能的。然而，這種方法存在一個(gè)重大缺點(diǎn)，角鯊烯在植物中含量極低，大約以重量計(jì)算占比為O. I到O. 7%。作為從鯊魚肝臟或者植物中提取工藝的第一替代方法，往往由于需要實(shí)施大型的濃縮和凈化工藝而成本高企，因此人們提出了第一種從微生物入手進(jìn)行角鯊烯生產(chǎn)的工藝方法天然酵母或重組酵母，尤其是啤酒酵母(Saccharomyces)類型的。因此，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生產(chǎn)角S烯的能力已被熟知，但是其產(chǎn)出物含量仍然非常低大概是O. 041毫克/克生物量(保羅·巴塔查爾吉BHATTACHARJEE等人，2001年，《世界微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》，第17期，第811-816頁(yè))。通過遺傳重組，研究人員已經(jīng)將其生產(chǎn)性能進(jìn)行了優(yōu)化處理。因此，重組酵母生產(chǎn)角鯊烯具有如下優(yōu)勢(shì)-享受和宿主細(xì)胞同等的GRAS(公認(rèn)安全使用物質(zhì))地位，-無病原體，無傳染性蛋白微粒，無毒素，和宿主細(xì)胞一樣，并且-已經(jīng)被用于疫苗領(lǐng)域(如這些酵母的表達(dá)載體含有乙肝抗原)。然而，正如第WO 2010/023551號(hào)醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用專利申請(qǐng)所指出的那樣(生產(chǎn)的角鯊烯達(dá)到97%以上的純度，可以用作疫苗佐劑)，在人們研制出超高產(chǎn)量的角鯊烯重組酵母以前(超過15%細(xì)胞干重)，這種第一替代方案還不能被工業(yè)化。然而，獲取這些重組細(xì)胞需要通過分子生物學(xué)手段，實(shí)施許多重大、漫長(zhǎng)而又復(fù)雜的代謝工程步驟，誘導(dǎo)產(chǎn)生角鯊烯的生物合成作用和抑制角鯊烯的分解代謝作用。的確是的，此外，正如在第WO 2010/023551號(hào)專利申請(qǐng)?zhí)岢龅哪菢?，角鯊烯合成的相關(guān)基因有很多包括甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，焦磷酸鹽脫羧酶，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶，HMGR(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶)和角鯊烯合成酶。分解代謝作用后，轉(zhuǎn)化為含有角鯊烯環(huán)氧化酶(ERGl)的麥角留醇，羊毛留醇合成酶，C14-位脫甲基酶，dl4-還原酶，C4-甲基氧化酶和C4-脫羧酶(ERG26)，3-酮還原酶，C24-甲基轉(zhuǎn)移酶，C8-異構(gòu)酶，C5-去飽和酶，d22-脫氫酶和d24_還原酶的過程中，牽涉到為數(shù)眾多的酶密碼基因。此外，其他代謝酶也必須加以考慮LEU2基因([測(cè)試]-異丙基蘋果酸脫氫酶)，環(huán)氧化鯊烯環(huán)化酶，酵母固醇-24-甲基轉(zhuǎn)移酶和麥角留醇_5，7. 24 (28)-三烯酚-22-脫氫酶。第二替代方案鯊魚肝臟或植物提取工藝方面，人們已經(jīng)提出了從破囊壺菌目科里提取微藻的角S烯制備工藝方法，這種方法頗具前景(包括破囊壺菌，Aurantiochytrium和裂殖弧菌)，尤其是Schizochytrium mangrovei或裂殖弧菌。這些微藻在異養(yǎng)條件下生產(chǎn)出角鯊烯(暗室；提供葡萄糖作為碳源)，并且行內(nèi)的微生物發(fā)酵技師很容易操作。因此，通過控制發(fā)酵條件，這些工藝提供容易實(shí)現(xiàn)的提純步驟，使角鯊烯的品質(zhì)能夠滿足食品、化妝品和醫(yī)療領(lǐng)域的需求。從破囊壺菌科微藻身上產(chǎn)出的角鯊烯不過是和其它目的脂類化合物伴生的副產(chǎn)物，脂類舉例如二十二碳六烯酸(或者DHA)，ω 3多不飽和脂肪酸。因此，角鯊烯通常被描述為DHA商業(yè)用油不可皂化部分的其中一個(gè)成分(和類胡蘿卜素和類固醇做比較)。 在比較過程中，Schizochytrium mangrovei FBI的菌株生產(chǎn)出的DHA細(xì)胞干重大約為6. 2%，角鯊烯為0.017%。結(jié)論是，能夠自然生產(chǎn)角鯊烯的這些微生物，其產(chǎn)量是非常低的-大約為0.I毫克/克生物量，破囊壺菌ACEM 6063 (參見勒維斯等人《新生物技術(shù)》，2001年，第439-447頁(yè)。)-大約0. 162 毫克 / 克生物量，Schizochytrium mangrovei FBI (參見江等人，《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》，2004年，第52期，頁(yè)數(shù)1196至1200)-大約0.18毫克/克生物量，Aurantiochytrium BR-MP4-A1香港紅樹林隔離劑(參見李等人，《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》，2009年，第57期，頁(yè)數(shù)4267至4272)為了提高產(chǎn)量，看來優(yōu)化發(fā)酵條件是勢(shì)在必行。在錢李等人發(fā)表在《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》2009年，第57期，第4267-4272頁(yè)的文章指出，角鯊烯是在留醇生物合成的關(guān)鍵中間體，角鯊烯轉(zhuǎn)化為類固醇的第一步關(guān)鍵步驟是加氧對(duì)角鯊烯進(jìn)行環(huán)氧酶催化。然而，如果人們希望實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)角鯊烯的蓄積，應(yīng)當(dāng)避免高溶氧水平。因此，在低溶氧水平(0-5%飽和度)條件下，培養(yǎng)破囊壺菌ACEM6063可以使角鯊烯累積到超過I毫克/克生物量，而溶氧水平的升高(40-60% )，角鯊烯的含量也不過只達(dá)到0.01毫克/克。同樣,培養(yǎng)溫度為15°C,通過破囊壺菌ACEM 6063進(jìn)行角鯊烯生產(chǎn),產(chǎn)量可以達(dá)到I. 2毫克/克，而在20°C的時(shí)候只有0. 7毫克/克(參見勒維斯等人，《新生物技術(shù)》，2001 年，第 3 期，第 439-447 頁(yè))。在G.陳等人發(fā)表在《新生物技術(shù)》2010年，第27-4期，第382-389頁(yè)的文章中，回顧了裂殖壺菌主要產(chǎn)自DHA，其途徑為聚酮合成方法(簡(jiǎn)稱PKS)，然而角鯊烯是通過膽固醇生物合成途徑合成的，這意味著生產(chǎn)這兩種化合物的時(shí)候，破囊壺菌的營(yíng)養(yǎng)需求是不同的。他們的工作目的是系統(tǒng)地尋找不同氮源對(duì)角鯊烯產(chǎn)量的影響。G.陳等人發(fā)現(xiàn)，在含有谷氨酸鈉、酵母提取物和蛋白胨氮源混合物培養(yǎng)基中，裂殖壺菌可以快速生長(zhǎng)，并且蓄積“高”含量的角鯊烯。
盡管這樣，所謂的“高”含量角鯊烯是相對(duì)而言。事實(shí)上，和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的產(chǎn)出值相比較，如果這個(gè)方法的設(shè)計(jì)人能夠顯著提高角鯊烯含量及產(chǎn)量，其提升比例分別為26. 3%和10. 1%，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件實(shí)際上可以提供含量為O. 72毫克/克和滴定濃度為5. 90毫克/升的角鯊烯。懷著同樣的優(yōu)化角鯊烯產(chǎn)量的目標(biāo)，K. W.范等人，在《世界微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》2010年第26-3期第1303至1309頁(yè)，使用了單加氧酶角鯊烯抑制劑(留醇生物合成的關(guān)鍵酶)特比萘芬(氫氧基氯化物)。行內(nèi)人都了解，角鯊烯的含量和產(chǎn)出率和微生物培養(yǎng)基的培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)。細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)時(shí)間越久，可以蓄積的角鯊烯就越少；實(shí)際上，培養(yǎng)基通過甾醇生物合成作用消耗更多角鯊烯。特比萘芬的作用是，防止通過固醇途徑消耗角鯊烯，并刺激了角鯊烯在細(xì)胞內(nèi)的 蓄積，較試驗(yàn)組其增量達(dá)到36至40%。但是,在本文中使用的Aurantiochytrium mangrovei FB3菌株制得的角藍(lán)烯產(chǎn)量是最高的，甚至遠(yuǎn)高于釀酒酵母(O. 041毫克/克生物量),甚至高于鮑圓酵母Torulasporadebrueckii (O. 24毫克/克生物量)，即使這樣，這種方法也不過是O. 53毫克/克的生物量。因此，盡管人們所作的一切努力，這些值仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于橄欖油的參考值(大約為
4.24毫克/克)，離工業(yè)規(guī)模所需要的數(shù)值差距甚遠(yuǎn)。
為了研制出一種比現(xiàn)存技術(shù)更有效和更廉宜的方法，在其研究過程中，申請(qǐng)人找出了一種具備異常高的角鯊烯生產(chǎn)能力的微藻菌株，這種微藻產(chǎn)出的角鯊烯超過10毫克微藻/克生物量，舉例說產(chǎn)出18毫克角S烯/克生物量，即使用Aurantiochytriummangrovei FB3菌株所生產(chǎn)的產(chǎn)量的30倍。此外，除了其出色的角S烯生產(chǎn)能力以外，這種菌株還能制得其他目的脂類化合物，例如高于生物量干重15%的二十二碳六烯酸(DHA)，舉例說其制成品為生物量干重的17，6%。這個(gè)裂殖壺菌已經(jīng)于2011年4月14日于法國(guó)國(guó)家微生物保藏中心(CNCM)提交的第 1-4469 號(hào)菌種((裂殖壺菌 R0Q425 (Schizochytrium sp. R0Q425)))，以及于 2009 年6月2日向武漢大學(xué)(中華人民共和國(guó)武漢，郵政編碼430072)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提交的號(hào)碼為M 209118(裂殖壺菌080129 (Schizochytrium sp. 080129))。其特點(diǎn)在于ARN 18S密碼基因的部分序列I GAGGGTTTTA CATTGCTCTC aTTCCaATAGCAaGACGCGA AGCGCCCCGC ATTGATATTT61 CTCGTCACTA CCTCGTGGAG TCCACATTGGGTAATTTACG CGCCTGCTGC CTTCCTTGGA121 TGTGGTAGCC GTCTCTCAGG CTCCCTCTCCGGAGTCGAGC CCTAACTCCC CGTCACCCGT181 TATAGTCACC GTAGGCCAAT ACCCTACCGTCGACAACTGA TGGGGCAGAA ACTCAAACGA241 TTCATCGCTC CGAAAAGCGA TCTGCTCAATTATCATGACT CACCAAGAGA GTTGGCTTAG301 ACCTAATAAG TGCGGCCCTC CCCGAAAGTCGGGCCCGTAC AGCACGTATT AATTCCAGAA361 TTACTGCAGG TATCCGTATA AAGGAACTACCGAAGGGATT ATAACTGATA TAATGAGCCG421 TTCGCAGTTT CACAGTATAA TTCGCTTATACTTACACATG CATGGCTTAG TCTTTGAGA從上述序列，可以識(shí)別裂殖壺菌的菌株。因此，本發(fā)明和2011年4月14日向法國(guó)國(guó)家微生物保藏中心(CNCM)提交的裂殖壺菌的菌株有關(guān)。這個(gè)菌株在本申請(qǐng)書下文將被命名為“CNCM 1-4469”。這個(gè)菌株表現(xiàn)出令人感興趣的角鯊烯高產(chǎn)能力。實(shí)際上，應(yīng)用該菌株可以從每100克生物量干重獲得克重級(jí)別規(guī)模的角鯊烯。特別是，通過詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法，可以實(shí)現(xiàn)角鯊烯
量化生產(chǎn)。因此，本發(fā)明同時(shí)也和該菌株的變種或者衍生菌株相關(guān)，所謂變種或者所謂衍生菌株具有高于或者等于I克/100克生物量干重的角鯊烯產(chǎn)量的特性。特別是，本發(fā)明和具有高于或者等于I克/100克生物量干重的角鯊烯產(chǎn)量的SCh菌株，從CNCM 1-4469菌株通過基因改造或者基因突變制得。基因改造可以是定向誘變和/或隨機(jī)。本發(fā)明和某種含有CNCM 1-4469菌株基因改造或者基因突變的菌株制備方法相關(guān)，作為選項(xiàng)之一，和具有至少I克/100克生物量干重的角鯊烯生產(chǎn)能力的菌株篩分步驟相關(guān)。
本發(fā)明和具備角鯊烯生產(chǎn)能力的CNCM 1-4469菌株和變種菌株的培養(yǎng)方法相關(guān)，包括在適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行該菌株的培養(yǎng)步驟、生物量的回收步驟。培養(yǎng)是在異養(yǎng)條件下進(jìn)行。一般來說，培養(yǎng)步驟包括預(yù)培養(yǎng)步驟，該步驟使菌株成活，然后是培養(yǎng)步驟和真正的發(fā)酵步驟。這最后一個(gè)步驟是目的脂類化合物的生產(chǎn)階段。這些微藻的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域里已經(jīng)廣為人知。舉例說，在上述G.陳的文章中，我們發(fā)現(xiàn)他的方法包括以下連續(xù)的步驟-在含有葡萄糖、谷氨酸鈉、酵母提取物和各種微量兀素的瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌株，-在放置在軌道式振蕩器的錐形燒瓶里進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，pH值6，溫度為25°C，以獲得成活的生物量。-從培養(yǎng)中的錐形燒瓶里接種另外一個(gè)系列，使用和預(yù)培養(yǎng)基同樣的培養(yǎng)基，拿取約O. 5% (v/v)的上一個(gè)步驟得到的生物量，維持溫度為25°C。預(yù)培養(yǎng)階段為時(shí)24至74小時(shí)，最好約為48個(gè)小時(shí)。培養(yǎng)階段最好為60-150個(gè)小時(shí)。至于氮源性質(zhì)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)它是可以選擇的，從酵母提取物，尿素，谷氨酸鈉，硫酸銨這個(gè)組合里面選擇單獨(dú)一項(xiàng)或者選擇組合。同樣地，可以全部或者部分使用谷氨酸鈉取代尿素，或使用谷氨酸鈉和硫酸銨的混合物?？梢云眠x擇酵母提取物，現(xiàn)有技術(shù)工藝傳統(tǒng)上使用的碳源，可能你傾向于選擇酵母提取物，傳統(tǒng)上現(xiàn)有技術(shù)所實(shí)施的工藝方法，尿素+維生素混合物，例如由西格瑪公司銷售的BME混合物試劑(β -巰基乙醇)，用量比例為5毫升/升。更佳的方法是，預(yù)培養(yǎng)基包含維生素BI，Β6和Β12.至于培養(yǎng)基pH值，如下例所述，將保持在5. 5和6. 5，最好是固定在pH值6。pH值的調(diào)節(jié)可以使用業(yè)內(nèi)人士所了解的任何方式，例如，通過添加2N的硫酸，然后添加SN氫氧化鈉。最后，溶氧率可以調(diào)節(jié)到20和0%之間的值，最好保持在5%作用，最初的階段維持24至48小時(shí)，最好是36小時(shí)，然后任其下降到0%。關(guān)于氧的傳輸，可以使用業(yè)內(nèi)人士所了解的任何方式調(diào)節(jié)使之不超過45毫摩爾/升/小時(shí)。本發(fā)明特別涉及CNCM 1-4469菌株或者具備角鯊烯生產(chǎn)能力的該菌株的變種，以生產(chǎn)目的脂類化合物。相關(guān)的脂類混合物包括角鯊烯，特別是二十二碳六烯酸(或稱DHA)。尤其是相關(guān)混合物就是角鯊烯。應(yīng)該指出的是，可以從每100克干物質(zhì)中生產(chǎn)出大于或者等于I克角鯊烯。本發(fā)明和具備角鯊烯生產(chǎn)能力的CNCM 1-4469菌株和變種菌株的培養(yǎng)方法相關(guān)，富含目的脂類化合物的生物量回收以及，作為選項(xiàng)之一，目的脂類化合物的分離和/或提純。目的脂類化合物包含角鯊烯，特別是二十二碳六烯酸(或稱DHA)。尤其是，相關(guān)混合物就是角鯊烯。尤其是，可以從每100克干物質(zhì)中生產(chǎn)出大于或者等于I克角鯊烯。發(fā)酵步驟后，可以使用任何業(yè)內(nèi)人士已 知的發(fā)酵培養(yǎng)基回收生物量的方法，例如，可從發(fā)酵裝置提取生物量，或者簡(jiǎn)單地使用微濾濃縮或離心濃縮，連續(xù)地使用水溶劑濃縮_稀釋法清洗。這樣，本發(fā)明還與具備角鯊烯生產(chǎn)能力的包含CNCM 1-4469菌株或該菌株變種的生物量相關(guān)。特別是與在發(fā)酵或者培養(yǎng)步驟后，富含目的脂類化合物的生物量關(guān)，如角鯊烯和十二碳六烯酸，相比較而言角鯊烯相關(guān)性更高。通過本文件所描述的方法可以制得角鯊烯。的確，經(jīng)過發(fā)酵，生物量可以包含以重量計(jì)算17. 6%的十二碳六烯酸和I. 8%的角鯊烯。所謂的“富含角鯊烯”在這里的意思為，每100克干物質(zhì)生物量的角鯊烯含量大于或等于每100克。除了生物量，本發(fā)明還涉及一種提取物或稱細(xì)胞裂解液，該提取物或細(xì)胞裂解液從具備角鯊烯生產(chǎn)能力的、包含CNCM 1-4469菌株或其變種的生物量中制得。特別是，從發(fā)酵后的生物量中制得該提取物或裂解液。這種提取物或細(xì)胞裂解液富含目的脂類化合物，如角鯊烯和十二碳六烯酸，尤其是角鯊烯。為了提取脂類而進(jìn)行的細(xì)胞破碎可以通過機(jī)械作用，化學(xué)作用，酶作用。隨后，通過數(shù)個(gè)連續(xù)的提取步驟，可以用正己烷/乙醇法從細(xì)胞裂解液中提取油。正己烷組分分離后，正己烷蒸發(fā)，原油被分離出來。因此，目的脂類化合物(尤其是角鯊烯)的生產(chǎn)方法包括生物量收獲法，提取物或細(xì)胞裂解液的制備，含有目的脂類化合物尤其是角鯊烯的原油提取。本發(fā)明涉及一種含有目的脂類化合物的原油或成品油，從具備角鯊烯生產(chǎn)能力的、含有CNCM 1-4469菌株或其變種的生物量中制備。最后，本發(fā)明還涉及目的脂類化合物的應(yīng)用，如角鯊烯或二十二碳六烯酸(或稱DHA)，特別是角鯊烯，角鯊烯通過本發(fā)明中應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品的組成成分的制備方法任意一種工藝。因此，本發(fā)明還涉及應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品的組成成分的制備方法，該方法包括目的脂類化合物的生產(chǎn)，如角鯊烯或二十二碳六烯酸(或稱DHA)，特別是應(yīng)用醫(yī)療、化妝品和食品領(lǐng)域產(chǎn)品的組成成分的制備方法任意一種工藝生產(chǎn)的角鯊烯。本發(fā)明特別涉及具備角鯊烯生產(chǎn)能力的、含有CNCM 1-4469菌株或其變種的一種產(chǎn)品或者成分，在培養(yǎng)或發(fā)酵該菌株后制得的一種生物量，或者該菌株的提取物或者細(xì)胞裂解液。尤其是，這個(gè)產(chǎn)品或這個(gè)成分是一種食品成分或一種食品或補(bǔ)充食品。其形態(tài)可能是液體或固體。尤其是，它包含了該菌株的一種凍干細(xì)胞、或者提取物、或細(xì)胞裂解液。該產(chǎn)品或該成分的形態(tài)可能為粉狀，顆粒狀，膠囊，或片劑形式，最好是膠囊的狀態(tài)。可以作為替代方案的是，該產(chǎn)品或該成分為液態(tài)，包含由本方面中任意一個(gè)工藝方法制得的原油、成品油。為了更好的理解本發(fā)明，以下舉例其性質(zhì)是說明性的，而不是限定性的。例I :使用SCH CNCM 1-4469菌株進(jìn)行角鯊烯生產(chǎn)的研究為了展現(xiàn)SCH CNCM 1_4469菌株出色的角鯊烯生產(chǎn)能力，我們對(duì)該菌株和文獻(xiàn)中的參考微藻菌株進(jìn)行了角鯊烯生產(chǎn)對(duì)照，這里所說的微藻就是Schizochytriummangrovei (RCC 893,法國(guó)《海洋浮游植物培養(yǎng)庫(kù)》(Roscoff Culture Collection,簡(jiǎn)稱RCC)。預(yù)培養(yǎng)某和培養(yǎng)某這里所說的微藻發(fā)酵分為兩個(gè)連續(xù)預(yù)培養(yǎng)階段，之后是培養(yǎng)/生產(chǎn)本身的階段。 預(yù)培養(yǎng)基的組成成分如下表一所示表一
預(yù)培養(yǎng)階段培養(yǎng)基
葡萄糖__25g
酵母提取物__2g_
_谷氨酸鈉鹽^19g
氯化納__6g_
硫酸鎂__6. 5g
硫酸納__O- Ig
I化鈣0. Ig
碳酸氫納__O- Ig
磷酸二氫鉀.2g
濃縮液的維生素__O- 6ml
微量元素濃縮液__O- 6mI
去離子水qsqI O. 3L培養(yǎng)階段/生產(chǎn)階段的培養(yǎng)基組成成分如下表二所示表二
權(quán)利要求
1.裂殖壺菌菌株，其于2011年4月14日保藏在法國(guó)國(guó)家微生物保藏中心CNCM，保藏編號(hào)為1-4469。
2.裂殖壺菌菌株，其特征在于所述裂殖壺菌菌株能夠從每100克干重的生物質(zhì)中生產(chǎn)含量大于或等于I克的角鯊烯，并且所述裂殖壺菌菌株通過基因突變或基因改造由權(quán)利要求I的裂殖壺菌菌株獲得。
3.目的脂類化合物的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求I或者2的裂殖壺菌菌株，以及回收富含目的脂類化合物的生物質(zhì)，以及任選地收獲目的脂類化合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的目的脂類化合物為角鯊烯或二十二碳六烯酸(或DHA)，優(yōu)選為角鯊烯。
5.權(quán)利要求I或2的裂殖壺菌菌株在生產(chǎn)目的脂類化合物，如角鯊烯或二十二碳六烯酸(或DHA)中的應(yīng)用。
6.由權(quán)利要求3的方法生產(chǎn)的目的脂類化合物，如角鯊烯或二十二碳六烯酸(或DHA)在制備醫(yī)療，化妝品，食品工業(yè)用組合物中的應(yīng)用。
7.產(chǎn)品或組合物，所述產(chǎn)品或組合物含有權(quán)利要求I或2的裂殖壺菌菌株或其富含目的脂類化合物，如角鯊烯或二十二碳六烯酸(或DHA)的級(jí)分或者細(xì)胞提取物。
8.權(quán)利要求7的產(chǎn)品或組合物，其特征在于所述產(chǎn)品或組合物富含角鯊烯。
9.權(quán)利要求7或8的產(chǎn)品或組合物，其特征在于所述產(chǎn)品或組合物是食品或補(bǔ)劑。
10.裂殖壺菌菌株的制備方法，所述裂殖壺菌菌株能夠提供每100克干重的生物質(zhì)大于或等于I克的角鯊烯含量，所述制備方法包括對(duì)權(quán)利要求I的裂殖壺菌菌株進(jìn)行基因突變或基因改造。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)角鯊烯的微藻新菌株，本發(fā)明的目的為裂殖壺菌的一種新菌株，該菌株表現(xiàn)出角鯊烯的高產(chǎn)能力，使用該菌株進(jìn)行目的脂類化合物生產(chǎn)的方法，以及使用該菌株制備的產(chǎn)品和組合物。
文檔編號(hào)A23L1/30GK102787074SQ20111014706
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者伯納德·波拉, 周潔, 澤維爾·范德瓦勒, 索菲·德弗勒坦 申請(qǐng)人:羅蓋特兄弟公司