專利名稱：一種改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法，更具體地說，涉及一種改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
基因治療是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用。應(yīng)用于基因治療的載體主要有病毒載體(viral vector)和非病毒載體(nonviral vector)兩種。病毒載體在基因治療中取得了一些突破性進(jìn)展，但是在臨床應(yīng)用過程中，其免疫原性和潛在致癌性等仍然是其難以克服的重大隱患。非病毒載體作為基因遞送的另一條途徑，被人們廣泛研究，包括裸DNA、脂質(zhì)體、陽離子高聚物等。陽離子高聚物作為非病毒載體的一種，它既存在非病毒載體的特點(diǎn)(即低毒性， 低免疫原性和低致癌性)，還有自身的優(yōu)勢一易于制備和攜帶目的基因能力高，這些更加有利于其作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。常見的陽離子高聚物能夠通過強(qiáng)靜電作用能夠有效縮合 DNA，形成的聚電解質(zhì)復(fù)合物(PECs)較為穩(wěn)定。這些PECs易于細(xì)胞內(nèi)化，從內(nèi)涵體中逃逸， 并能保護(hù)DNA免受DNA酶的降解。因此，陽離子高聚物成為非病毒基因載體的重要組成部分，但是陽離子高聚物作為基因載體應(yīng)用時(shí)，仍呈現(xiàn)出了一些問題，例如生物相容性差、有毒性、生物降解性低以及轉(zhuǎn)染效率低等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物相容性好、毒性小、穩(wěn)定性高的陽離子高聚物作為非病毒型轉(zhuǎn)基因載體進(jìn)行使用。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備上述陽離子高聚物的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種上述陽離子高聚物的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的一種改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體，以聚羥乙基丙烯酰胺為骨架結(jié)構(gòu)，聚羥乙基丙烯酰胺的側(cè)鏈取代基R為NH2(CH2)niN(CH2)Ii2NH2, Ii1為1_5， 為1_5，其分
子式如下
權(quán)利要求
1. 一種改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，以聚羥乙基丙烯酰胺為骨架結(jié)構(gòu)，聚羥乙基丙烯酰胺的側(cè)鏈取代基R為NH2(CH2)niN(CH2)Ii2NH2, Ii1為1-5， 為1-5，其分子式如下
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，H1為 1-3，n2為 1_3，η 為 5-150。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體，其特征在于，H1為 3，η2 為 3，η 為 50-150。
4.一種制備改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于，按照下述步驟進(jìn)行(1)先將單體和催化劑氯化亞銅溶解在溶劑中，在除氧和除濕的條件下，再將配體N， N，N’，N”，N” -五甲基二乙基三胺和引發(fā)劑配體α -溴異丁酸乙酯加入體系中，進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行透析和凍干，即得聚羥乙基丙烯酰胺；(2)將步驟(1)制備的聚羥乙基丙烯酰胺、無水氯化鋰、三乙胺和對甲苯磺酰氯放入溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，提取產(chǎn)物；(3)利用三氟乙酸乙酯對小分子修飾劑的伯胺進(jìn)行保護(hù)，然后將步驟( 制備的產(chǎn)物、 伯胺受到保護(hù)的小分子修飾劑和三乙胺混合均勻反應(yīng)，使小分子修飾劑通過仲胺連接到步驟(2)制備的產(chǎn)物上，最后對受到保護(hù)的伯胺進(jìn)行脫保護(hù)，即得到改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于，在步驟(1)中，催化劑氯化亞銅和配體N，N, N'，N"，N"-五甲基二乙烯基三胺 (PMDETA)的摩爾比在(1-1.5) (1_1. 5)；催化劑氯化亞銅和引發(fā)劑配體α -溴異丁酸乙酯的摩爾比在(1-1.5) (1-1.5)，所述反應(yīng)時(shí)間至少8小時(shí)，反應(yīng)溫度為20-25°C或者 40-80 "C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于，在步驟(2)中，無水氯化鋰和三乙胺的摩爾比為(1-1.5) (1-1. 5)，聚羥乙基丙烯酰胺的用量大于對甲苯磺酰氯的用量以促使更多的對甲苯磺酰氯連接到聚羥乙基丙烯酰胺上，所述反應(yīng)時(shí)間至少20小時(shí)，所述反應(yīng)溫度為5-25°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于，在步驟⑶中，所述小分子修飾劑是既有伯胺又有仲胺的小分子，分子式為NH2(CH2) Ii1NH(CH2)Ii2NH2，其中叫為 1-5，n2 為 1-5。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于，在步驟(3)中，利用三氟乙酸乙酯對小分子修飾劑的伯胺進(jìn)行保護(hù)時(shí)，在80 90°C下進(jìn)行回流反應(yīng)至少M(fèi)小時(shí)，反應(yīng)體系使用的溶劑為極性溶劑；采用溶液體積百分?jǐn)?shù)為25% 的氨水在溫度為60°C下對氨基進(jìn)行脫保護(hù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種制備改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體的方法，其特征在于，在步驟(3)中，步驟( 制備的產(chǎn)物的用量大于小分子修飾劑，小分子修飾劑與三乙胺的摩爾比是1 1或者小分子修飾劑稍過量，在60 90°C下反應(yīng)至少M(fèi)小時(shí)，反應(yīng)體系使用的溶劑為極性溶劑。
10.如權(quán)利要求1所述的納米金剛石-聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯復(fù)合轉(zhuǎn)基因載體，在基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改性聚羥乙基丙烯酰胺轉(zhuǎn)基因載體，以聚羥乙基丙烯酰胺為骨架結(jié)構(gòu)，聚羥乙基丙烯酰胺的側(cè)鏈取代基R為NH2(CH2)n1N(CH2)n2NH2，n1為1-5，n2為1-5。在制備過程中，先利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合制備聚羥乙基丙烯酰胺，然后利用三氟乙酸乙酯對小分子修飾劑的伯胺進(jìn)行保護(hù)，再將其接到聚羥乙基丙烯酰胺，最后脫保護(hù)即得到轉(zhuǎn)基因子載體。陽離子化的聚羥乙基丙烯酰胺易于細(xì)胞內(nèi)化，能保護(hù)DNA免受DNA酶的降解，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后釋放DNA。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102277369SQ201110113969
公開日2011年12月14日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者劉文廣, 楊建海, 王宏博, 王瑋 申請人:天津大學(xué)