專利名稱：Csnk1g3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因的應(yīng)用，特別是涉及一種CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白激酶是由人類基因組中最大的一類基因所編碼，其作用是通過將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物蛋白上，來調(diào)控各種蛋白的活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞生物學(xué)過程，人類基因群編碼超過57個激酶家族之中的518種蛋白激酶。大約有55%已知的原癌基因編碼蛋白激酶，其余多數(shù)的原癌基因則編碼可激活蛋白質(zhì)激酶或被激酶磷酸化的特異蛋白。所有蛋白激酶參與細(xì)胞信號通路，參與心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、關(guān)節(jié)炎和其它免疫紊亂、神經(jīng)系 統(tǒng)如老年性癡呆癥、阿默海茨癥AD等發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)已發(fā)與超過400種人類疾病與蛋白激酶相關(guān)。美國FDA的制藥和生物技術(shù)公司中有四分之一的藥物研究開發(fā)方案集中在研發(fā)新的蛋白激酶抑制劑，這些藥物應(yīng)用于治療包括腫瘤、炎癥、心力衰竭、糖尿病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，超過60種的蛋白激酶抑制劑正在臨床試驗之中,其中許多已開發(fā)上市,如諾華(Novartis)的Gleevec ,阿利斯康(AstraZeneca)的Iressa ,施貴寶的Tarceva (Genentech andOSIPharmaceuticals)，拜爾的 Nexavar (Bayer)，輝瑞的 Sutent (Pfzer)，Sprycel (Bristol-Myers Squibb)和葛蘭素史克的Tykerb (GlaxoSmithKline)，制藥公司清楚地認(rèn)識到蛋白激酶抑制劑的重要性，已成為藥物研發(fā)的熱點。肝癌嚴(yán)重威脅著我國人民的生命健康。肝癌的診斷，尤其早期診斷是臨床診療和預(yù)后的關(guān)鍵。目前，在我國肝癌的定性診斷仍以檢測血清AFP(甲胎蛋白)為主，呈現(xiàn)如下特點60%以上的肝癌病例血清AFP > 400μ g/L ;目前還沒有其他腫瘤標(biāo)志物的特異性可與AFP相媲美；AFP檢測較少依賴影像學(xué)設(shè)備和新技術(shù)。AFP是目前全球應(yīng)用最為廣泛的肝癌腫瘤標(biāo)志物，已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年，其敏感性為40 % 65 %，特異性為76 % 96 %，如此的敏感性和特異性均不令人滿意。因此，發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性高的新的腫瘤標(biāo)志物將是提高肝癌早期診斷水平的關(guān)鍵。除AFP外，近年來用于肝癌檢測的其他血清標(biāo)志物還包括甲胎蛋白異質(zhì)體、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶II (GGT-II)、堿性磷酸酶同工酶I、醛縮酶同工酶A(ALD-A)、巖藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、異常凝血酶原、鐵蛋白與酸性鐵蛋白等。AFP異質(zhì)體和異常凝血酶原的應(yīng)用提高了肝癌患者的檢出率，但早期診斷和指導(dǎo)個性化治療的分子分型診斷仍是我們面臨的極大挑戰(zhàn)。一般認(rèn)為以下四類生物分子常作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志物1、癌胚和糖蛋白抗原；2、酶和同工酶；3、細(xì)胞因子；4、基因。肝癌的治療在過去20年來已取得很大的進(jìn)展，外科手術(shù)切除及肝臟移植屬于“根治性”治療，仍是肝癌治療的首要選擇。隨著肝癌早期診斷水平的提高及腫瘤治療生物學(xué)概念的改變，腫瘤局部非手術(shù)治療在肝癌治療中的地位日益提高。經(jīng)導(dǎo)管動脈內(nèi)化療栓塞(TACE)已成為不能切除肝癌治療的首選方法，是中晚期肝癌治療的重要手段。該方法可使90%以上的肝癌患者受益，但總體療效有待提高。此外，經(jīng)皮肝穿刺瘤內(nèi)無水乙醇治療(PEI)也是較常用的局部化療方法，對癌直徑< 3cm的肝癌及門靜脈癌栓的治療有一定價值。但目前肝癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對性差，療效不佳，因此，迫切需要尋找新的作用靶點，研究和開發(fā)肝癌特異的新藥物，提高化療的特異性和有效性。近幾年來隨著對肝癌基礎(chǔ)研究的深入，生物治療在肝癌的綜合治療中取得了較大進(jìn)展，成了繼手術(shù)、放療、化療后腫瘤治療的第四大療法，如免疫治療、基因治療，包括抗血管生成、自殺基因治療、腫瘤疫苗治療、SiRNA技術(shù)等。但許多生物治療的臨床療效仍不十分滿意，且絕大多數(shù)還處在實驗研究階段，相關(guān)的關(guān)鍵理論和實驗技術(shù)仍需進(jìn)一步研究和發(fā)展。CSNK1G3是Casein激酶家族的一員，能夠磷酸化底物蛋白，因此，具有進(jìn)一步研究的價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治 療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一對特異擴(kuò)增CSNK1G3基因的引物，該引物可用于制備用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供CSNK1G3基因的測序引物，該測序引物可用于制備用基因測序診斷肝癌的產(chǎn)品。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之五是提供CSNK1G3基因的siRNA，該siRNA可用于制備治療肝癌的藥物。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一方面，提供了一種CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、激酶活性檢測、原位雜交、基因芯片或基因測序診斷肝癌的產(chǎn)品。所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增CSNK1G3基因的引物。所述用實時定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增CSNK1G3基因的引物。所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與CSNK1G3蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。所述用激酶活性檢測的產(chǎn)品包括特異性檢測CSNK1G3激酶活性的底物及反應(yīng)體系O所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括與CSNK1G3基因的核酸序列雜交的探針。所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與CSNK1G3基因的核酸序列雜交的探針。所述用基因測序診斷肝癌的產(chǎn)品包括用于CSNK1G3基因的測序引物，即CSNK1G3基因開放讀碼框外顯子的特異性測序引物。在本發(fā)明的一方面，提供用于制備用RT-PCR診斷肝癌產(chǎn)品的一對特異擴(kuò)增CSNKIG3基因的引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO 1所不的序列或其互補(bǔ)序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互補(bǔ)序列。另外，本發(fā)明還提供了一種用于制備用基因測序診斷肝癌的產(chǎn)品中的CSNK1G3基因的測序引物，所述測序引物序列具有如SEQ ID NO :5-28所示的序列或其互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。所述治療肝癌的藥物及方式包括通過RNA干擾抑制CSNK1G3基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相 關(guān)病毒載體，能夠抑制CSNK1G3蛋白激酶活性的化合物、多肽、單克隆抗體。其中，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾特異性抑制CSNK1G3基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸及其不同修飾狀態(tài)、不同遞送方式。所述治療肝癌的藥物包括攜帶特異性針對CSNK1G3基因干擾其表達(dá)的DNA載體、
病毒載體。在本發(fā)明的另一方面，提供用于制備治療肝癌藥物的CSNK1G3基因的三對siRNAs，分別為sil、si2和si3。其中，sil的正義鏈具有如SEQ ID N0:29所示序列，sil的反義鏈具有如SEQ ID NO 30所示序列。si2的正義鏈具有如SEQ ID NO 31所示序列，si2的反義鏈具有如SEQ ID NO 32所示序列。si3的正義鏈具有如SEQ ID NO 33所示序列，si3的反義鏈具有如SEQ ID NO 34所示序列。本發(fā)明治療肝癌的藥物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。本發(fā)明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。針齊IJ、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。為了實現(xiàn)CSNK1G3基因作為肝癌診斷標(biāo)志物應(yīng)用的目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn) I. RT-PCR檢測CSNK1G3基因mRNA在肝癌病人癌組織及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差
巳升。2.免疫檢測CSNK1G3蛋白在肝癌病人中的表達(dá)水平。3.激酶活性檢測CSNK1G3激酶在肝癌病人血清中的活性；4.原位雜交檢測CSNK1G3基因在肝癌病人組織中的表達(dá)水平；5.基因芯片檢測CSNK1G3基因在肝癌病人組織中的表達(dá)水平；6.檢測肝癌組織中CSNK1G3基因開放讀碼框(ORF)的核酸序列；本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)一例肝癌病人組織中CSNK1G3基因開放讀碼框(ORF)的核酸序列存在突變。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對CSNK1G3蛋白特異的抗體。例如，將提純的人CSNK1G3基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人CSNK1G3蛋白或它的抗原的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤及時制備。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑CSNK1G3功能的抗體，也可以是不影響人CSNK1G3功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人CSNK1G3基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人CSNK1G3基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的CSNK1G3基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如E. coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化CSNK1G3蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA_RNA嵌合體、PNA或其他衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15 25個堿基對最佳。所述探針自身互補(bǔ)最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。為了實現(xiàn)本發(fā)明中CSNK1G3基因作為制備肝癌治療藥物的靶點，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)I、化學(xué)合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對CSNK1G3基因序列，利用脂質(zhì)體包裹遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)，干擾CSNK1G3基因的表達(dá)，CCK-8法測量肝癌細(xì)胞Huh_7，H印3B，·MHCC-97H，MHCC-97L生長活性。本發(fā)明中實驗結(jié)果證明特異性針對CSNK1G3基因的小核糖核酸分子能夠抑制肝癌細(xì)胞體外的生長，說明CSNK1G3基因可用作制備肝癌治療藥物的靶基因。2、利用各種載體，包括DAN載體、腺病毒、腺相關(guān)病毒載體來干擾CSNK1G3基因的表達(dá)，達(dá)到體內(nèi)干擾CSNK1G3基因的效果，從而實現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的目的。3、獲得能夠特異性抑制CSNK1G3基因激酶活性的多肽、單克隆抗體，達(dá)到抑制CSNK1G3激酶活性的目的，從而實現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的目的。4、獲得能夠特異性抑制CSNK1G3基因激酶活性的化合物，達(dá)到抑制CSNK1G3激酶活性的目的，從而實現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞增殖的目的。本發(fā)明中用于特異性干擾CSNK1G3基因的小核糖核酸序列設(shè)計原則如下(I)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA” 二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在45% -55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)(untranslatedregions, UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(人，或者小鼠，大鼠等等)進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列體外評估干擾FOK3基因表達(dá)。本發(fā)明首次公開了 CSNK1G3激酶基因的應(yīng)用，用于制備肝癌診斷的產(chǎn)品和肝癌治療的藥物。本發(fā)明實驗證實CSNK1G3基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且首次證實CSNK1G3基因在肝癌病人發(fā)生錯義突變(圖I所示)，而且通過CSNK1G3基因序列特異性siRNA干擾可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長，因此CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為診斷肝癌的標(biāo)志物和用于肝癌治療的藥物靶點，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速，并提供了新的肝癌治療的基因靶點。總之，本發(fā)明CSNK1G3基因為防治肝癌提供了新的治療靶點和有效新藥。


下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明圖I是CSNK1G3基因在一例肝癌病人癌旁組織、癌組織及門靜脈癌栓樣本中發(fā)生突變的測序峰圖，結(jié)果顯示該突變導(dǎo)致CSNK1G3蛋白第138位氨基酸的改變；圖2是全激酶組規(guī)模RNAi細(xì)胞學(xué)篩選生長相關(guān)激酶的總體分布情況。A圖橫坐標(biāo)參數(shù)表示在四株肝癌細(xì)胞細(xì)胞H印3B，Huh-7，MHCC-97H，MHCC-97L中每個siRNA影響細(xì)胞活性的程度，縱坐標(biāo)參數(shù)表示細(xì)胞學(xué)篩選中每個siRNA的變異系數(shù)情況。B圖顯示了細(xì)胞RNAi篩選中四株細(xì)胞Z值的頻數(shù)分布情況； 圖3是細(xì)胞RNAi篩選中每株細(xì)胞Z值區(qū)段頻數(shù)累及分布曲線及根據(jù)5%可信區(qū)間、10 %分析區(qū)間取得相應(yīng)的臨界Z值，用于獲取篩選中有意義的SiRNA及對應(yīng)的激酶基因圖；圖4是在篩選體系中5%可信區(qū)間、10%分析區(qū)間內(nèi)四株肝癌細(xì)胞生長必須的siRNAs及相應(yīng)激酶數(shù)量圖，圖中的1、2、3、4代表細(xì)胞株的數(shù)目；圖5 是 CSNKlG3siRNAs 抑制肝癌細(xì)胞 MHCC-97L、MHCC-97H、H印3B、Huh-7 生長的柱狀圖。
具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(NewYork ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例IRT-PCR實驗檢測CSNK1G3基因在肝癌組織中的表達(dá)情況逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實驗檢查CSNK1G3基因再肝癌組織中的表達(dá)情況。RT-PCR 是指將逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription ；RT)反應(yīng)和 PCR(Polymerase ChainReaction)反應(yīng)組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及SI核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo (dT)或基因特異性的引物起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。I.組織分離實驗用組織來源于原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(_80°C )保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。
2.總核糖核酸(RNA)的抽提試劑盒抽提總核糖核酸(RNA)采用TRIZOL(Invitrogen),該試劑是基于酸性酹一步抽提法生產(chǎn)的。TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。用于抽提總核糖核酸(RNA)所用的器皿和水均進(jìn)行核糖核酸酶滅活處理，以保證實驗中無核糖核酸酶的環(huán)境。3.核糖核酸(RNA)抽提步驟RNA提取的一般步驟是破碎組織一分離RNA —沉淀RNA —洗滌RNA —融解RNA —保存RNA。破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。分離RNA —半用酚、氯仿等有機(jī)溶劑 ，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA —般分布于上層，與蛋白層分開。沉淀RNA —般用乙醇、3Μ NaAc (ρΗ-5. 2)或異丙醇。洗滌RNA使用70%乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于_70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA :加入NaAc 至 O. 3M, 12，OOOXg 離心 5 分鐘。4. cDNA 的合成(I)冰浴離心管里面加入模板RNA 4yL(lyg/yL)，隨機(jī)引物2yL(20pmol/μ L),去離子水5 μ L,混勻,離心3-5秒；(2)70°C水浴5分鐘，冰浴30秒(此處是為了使引物和模板正確配對);(3)加入5 X M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈緩沖液4 μ L (200U/ μ I), RNase抑制劑I μ L (Ribonuclease Inhibitor, 40U/ μ I，TaKaRa)，dNTP 2 μ L (2. 5mM, TaKaRa)(這些應(yīng)該先配好，然后分再裝到每一管)，混勻；(4) 37°C水浴5分鐘，加入I μ L M-MLV RT反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ I)，混勻；(5) 37°C水浴I小時(此步是反轉(zhuǎn)錄過程)；(6) 700C，10分鐘結(jié)束反應(yīng)(此處是滅活酶活性，避免對后續(xù)實驗產(chǎn)生干擾)，產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一步PCR實驗，余下的-70°C保存。5. RT-PCR的弓丨物設(shè)計及擴(kuò)增理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。設(shè)計理想的引物都有以下共同的特點典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。選擇GC含量為40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。設(shè)計5’端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。避免引物對3’末端存在互補(bǔ)序列，這會形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。避免3’末端富含GC。設(shè)計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。避免3’末端的錯誤配對。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。因此，本實施例中設(shè)計的引物具體如下CSNK1G3-F:5，-GCACCACAGCTACATTTGGA-3，(SEQ ID NO 1)；CSNK1G3-R:5，-TCCAAACTAGGTCCCAGCAG-3’ (SEQ ID NO 2)；β -act in (F) :5，-CATCCTGCGTCTGGACCT-3，(SEQ ID NO :3)；
β -act in (R) :5，-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’ (SEQ ID NO :4)。以β-actin作為內(nèi)對照，反應(yīng)混合物中各成分為β-actin(F)、β -actin(R) >CSNK1G3 (F)、CSNK1G3 (R)、10XPCR buffer、MgcI2、dNTP、Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Taq )cDNA 模板分別為 0. 2，0. 2，0. 4，0. 4，I. 0，I. 0，0. 2，0. I 和 5 μ LcDNA 模板，最后補(bǔ)充 ddH20 使反應(yīng)體系為10 μ Lo PCR的反應(yīng)條件如下94 °C，5分鐘預(yù)變性；94 °C，30秒變性；55 °C，30秒退火；72 °C，30秒延伸；35個循環(huán)，電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。實施例2原位雜交用CSNK1G3基因探針，與腫瘤切片進(jìn)行原位雜交，陽性雜交信號越強(qiáng)，患肝癌的可能性越高。實驗步驟為將肝臟腫瘤組織取材后OCT包埋、液氮速凍，恒冷冰凍切片，該冰凍切片進(jìn)一步用于原位雜交。實施步驟如下(I)冰凍切片與雜交前預(yù)處理I).將樣品從_80°C取出，用OCT包埋，在_23°C (切片機(jī)腔體溫度)平衡至少30min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10 μ m厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(lmg/ml)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180°C干烤6小時)，保存于-70°C冰柜備用。2).冰凍切片經(jīng)室溫干燥IOmin后，在4%的多聚甲醛-PBS (pH7. 4)固定lOmin。3).活躍的 DEPC-PBS (未高壓的 O. I % DEPC-I X PBS 溶液)洗 2 次，每次 5min。 4).在O. 2M的鹽酸作用中作用IOmin后，重復(fù)步驟4)。5).在切片上滴加蛋白酶K(0. lyg/ml)，37°C孵育15min，重復(fù)步驟4)。6).經(jīng)O. IM TEA (三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的O. 25% AA/Ο. IM TEA (乙酸酐/三乙醇胺，pH8. O)中乙?；疘Omin (在大多數(shù)實驗中，步驟4，5，6省略)。7). 5XSSC 中平衡 15min。(2)雜交I).在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100 μ L/玻片)，置于放有濕盒液(50%甲酰胺 ν/ν;0· 3Μ NaCl ；lmM EDTA ; IOmM Tris_Cl，pH8. O)的濕盒中，55 58°C下的烘箱中預(yù)雜交2h。2).甩掉預(yù)雜交液，地高辛標(biāo)記的反義或正義cRNA探針(濃度l-2ng/l·! L)經(jīng)70°C變性10分鐘，置冰上lmin，玻片上滴加預(yù)雜交液(約60 μ L/玻片)，覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48 58°C下雜交18-30h。(3)雜交后處理
I).取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52°C預(yù)熱的5XSSC洗30mino2).在無 DNA 的 RNA 酶 A (20 μ g/ml)溶液中 37°C下孵育 30min。3).分別依次用 52°C預(yù)熱的 2XSSC, IXSSC O. I X SSC 洗 2 次，每次 30min。(4)雜交信號檢測I).在緩沖液 A(0. IM Tris-HCl pH7. 5,0. 15Μ NaCl)中平衡 5min。2).在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(I 500 I : 2000稀釋于含O. 5%阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應(yīng)2h。3) ·用緩沖液A洗2次，每次15min。4).在緩沖液 B (O. IM Tris-HCl ；0. IM NaCl ；0. 05M MgCl2, ρΗ9· 5)中平衡 5min 。5).硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴_4_氯_3_引哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B中，每ml緩沖液B含有4. 5 μ L NBT和3. 5 μ L BCIP0在玻片上滴加混合染液在濕盒中顯色過夜。6).充分顯色后，用 EDTA(lmM EDTA, ρΗ8. O)洗 15min 終止反應(yīng)。7).在95%乙醇中洗Ih以除去非特異的背景。8).用蒸餾水洗15min除去可能存在的結(jié)晶體。9).脫水、透明，用中性樹膠封片。10).充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。實施例3在肝癌病人組織中對CSNK1G3基因開放讀碼框序列進(jìn)行測序I、肝癌組織DNA的抽提采用QIAGEN 公司 DNA 抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit, Cat. no. :51306)進(jìn)行相關(guān)抽提操作，具體見該產(chǎn)品說明書，操作步驟簡述如下(I)將組織放置于碾缽中，加入適量液氮充分碾磨至粉末狀，將組織粉末轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中(約25mg)，在離心管中加入100 μ I裂解液和10 μ I RNaseA/蛋白酶K貯液，迅速充分振蕩混勻，置于55°C溫浴15分鐘，其間來回顛倒離心管數(shù)次。(2)加入 10 μ 13Μ 似六。( !14.8)，然后加入25(^ I DNA Binding Solution，充分振蕩混勻，使溶液呈水溶液狀，隨后將其轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中?；靹蚝髮⑸锨逯苯蛹尤氲诫x心吸附柱中(切勿將沉淀雜質(zhì)取到)，放置一分鐘，12000rpm離心30秒鐘。(3)倒掉收集管中的廢液，再加入600 μ L Wash Buffer, 12，OOOrpm離心30秒。(4)重復(fù)步驟3—次至兩次。此步驟中，最后一次清洗應(yīng)于12，OOOrpm離心3分鐘，以充分除去Wash Buffer。(5)小心取出吸附柱(勿沾上Wash Buffer,因為乙醇會影響后續(xù)的反應(yīng))，將其放入一個干凈的I. 5ml離心管中，并加入50 μ I DP洗脫液或水(DP洗脫液一定要加在吸附柱的正中)。放置2分鐘后，于12，OOOrpm離心I分鐘。離心管中便是所提取的基因組DNA。取3-5 μ I電泳。如有殘余RNA，可適當(dāng)加入少量RNaseA。2、DNA 測序DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。美國PE ABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。本實驗介紹的是ABI PRISM310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程。ABI PRISM310型基因分析儀(即DNA測序儀)，釆用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差I(lǐng)個堿基的3’末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間迀移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的迀移率也不同，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)攝影機(jī)檢測器就可對焚光分子逐個進(jìn)行檢測，激發(fā)的焚光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DNA測序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測序外，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和 個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。CSNK1G3基因測序引物序列如下CSNK1G3(E2)-F :gggatgaacatgctccagtt(SEQ ID NO 5)；CSNK1G3(E2)-R :tggcagctatttcagcctact(SEQ ID NO 6)；CSNK1G3(E3)-F :tttttgaccatgcatttgact(SEQ ID NO 7)；CSNK1G3 (E3) -R tgtggcacagacaaacatga (SEQ ID NO:8)；CSNK1G3(E4)-F :ttgtgttgggacctagtgctc(SEQ ID NO :9)；CSNK1G3(E4)-R :ccccaccagataatccagaa(SEQ ID NO :10)；CSNK1G3(E5) -F agcccagcttttgtccagta(SEQ ID NO :11)；CSNK1G3(E5)-R :tggatcccagaaagacaaca(SEQ ID NO 12)；CSNK1G3 (E6) _F :aggctagtcaaagcccaaaa (SEQ ID NO :13)；CSNK1G3(E6) -R tgcatccccataactgtatca(SEQ ID NO :14)；CSNK1G3(E7/8)-F gaacaaactctccattcttcca(SEQ ID NO :15)；CSNK1G3(E7/8)-R :caaagtgtccctgtgggttc(SEQ ID NO :16)；CSNK1G3(E9)-F :cctcccatttttcttgtgtctc(SEQ ID NO :17)；CSNK1G3 (E9)-R :acggcactacctgcagaaat (SEQ ID NO :18)；CSNK1G3(ElO)-F :ttctttttgctttaccttcttagc(SEQ ID NO :19)；CSNK1G3(ElO)-R :gggtatccaaatacttccattct(SEQ ID NO :20)；CSNK1G3(Ell)-F :tgggtggacttctagtgtgc(SEQ ID NO :21)；CSNK1G3(Ell)-R catgccatgagttccaaaaa(SEQ ID NO :22)；CSNK1G3(E12)-F ccagagggaaggagacagaa(SEQ ID NO :23)；CSNK1G3(E12)-R :cacttgttttgcatgcacct(SEQ ID NO :24)；CSNK1G3(E13)-F ggagtgttgatgcatgaaagtta(SEQ ID NO :25)；CSNK1G3 (E13)-R :aaatgcacaagcacaagcag (SEQ ID NO :26)；CSNK1G3(E14)-F tcagggagaaagggtgagaa(SEQ ID NO :27)；CSNK1G3(E14)-R :atgggcaaagcactcatgtt(SEQ ID NO :28)；
用上述引物分別從待檢測的肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織DNA中擴(kuò)增出DNA片段，采用高保真性 DNA 聚合酶 Hotstar (QIAGEN,HotStar HiFidelity Polymerase Kit, Cat. no.202605)。50 μ L PCR反應(yīng)體系如下DNA模板I μ L，前向引物(F) O. 5 μ L，反向引物(F) O. 5 μ L，Hotstar DNA 聚合酶 0· I μ L，dNTP (IOmM) O. 5 μ L, Mgcl2 (2. 5mM) I μ L,補(bǔ)足 ddH20至50 μ L體積。PCR反應(yīng)條件如下95°C熱啟動5分鐘，95 °C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，35 40循環(huán)。結(jié)果如圖I所示，在其中一例肝癌病人的癌組織中發(fā)現(xiàn)突變位點(C — T)。實施例4免疫檢測I、抗原蛋白獲得
(I)利用基因工程表達(dá)可從Genebank數(shù)據(jù)庫中獲得人CSNK1G3基因的cDNA序列，通過PCR擴(kuò)增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá)CSNK1G3蛋白，并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白。2、抗體制備可采用以下幾種方法制備抗體(I)細(xì)胞融合法用上述制備的CSNK1G3蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)，獲得脾臟細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。(2)利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程單克隆抗體。(3)利用純化的蛋白免疫動物，制備多抗血清。3、檢測(I)用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進(jìn)行肝癌的病理檢測，陽性信號為肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應(yīng)為肝癌可疑病人。(3)將CSNK1G3抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。實施例5全激酶組范圍內(nèi)RNAi篩選肝癌細(xì)胞生長必需激酶基因RNAi作為一種簡單快速、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、效果可預(yù)測的技術(shù)，具有明顯的優(yōu)點，它比反義核酸技術(shù)優(yōu)越，比基因敲除簡單，具有很好的應(yīng)用前景。具體可用于以下幾個方面基因功能分析；研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑；新藥物的研究和開發(fā)；基因治療。RNAi只抑制致病基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，能減少非特異作用引起的副作用。腫瘤發(fā)生是多基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個基因同時沉默的效應(yīng)，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時沉默。針對人類基因組上所有激酶及激酶相關(guān)基因的siRNAs庫通過商業(yè)化途徑獲得(Stealth RNAi Human Kinase Collection, Invitrogen, Catalog no. 12938-200)。每套Stealth RNAi Collection 由若干 96 孔板組成,2nmoles 的 Stealth RNAi 溶解在 100μ1的 IX RNA 退火 / 稀釋溶液中(IOmM Tris-HCl，pH 8. O ；20mM NaCl ；lmM EDTA, pH 8. O)，終濃度為20 μ MoCCK-8測定細(xì)胞活性CCK_8試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為該試劑中含WST-8 [其化學(xué)名稱為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4_ 二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(I-MethoxyPMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲染料(Formazan dye)。細(xì)胞增殖越多越快,則顏色越深；細(xì)胞毒性越大,則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。分光光度計讀數(shù)，產(chǎn)生原始細(xì)胞活性數(shù)據(jù)，實驗流程如圖I所示。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化，數(shù)據(jù)校正、Z值評估等步驟，得到siRNA庫對肝癌細(xì)胞生長影響的數(shù)據(jù)(見圖2-4)。實施例6CSNK1G3基因的小干擾核糖核酸(siRNA)體外化學(xué)合成小干擾核糖核酸(siRNA)具有快速、簡單和特異性強(qiáng)等特點，在抗腫瘤治療等方面有廣泛的應(yīng)用前景。針對CSNK1G3基因mRNA設(shè)計合成三條siRNAs對應(yīng)靶序列，該3條siRNA序列分別如下sil-正義鏈GGCUGACACAUUAAAGGAGAGGUAU(SEQ ID NO :29)；sil-反義鏈AUACCUCUCCUUUAAUGUGUCAGCC(SEQ ID NO :30)；si2-正義鏈UCUUCGUUAUGUAAGAAGGCUAGAU(SEQ ID NO :31)；si2-反義鏈AUCUAGCCUUCUUACAUAACGAAGA(SEQ ID NO :32)；si3-正義鏈GACUUGUUUGACUUGUGUGACAGAA(SEQ ID NO :33)；si3-反義鏈UUCUGUCACACAAGUCAAACAAGUC(SEQ ID NO :34)；另外設(shè)置無關(guān)序列作為陰性對照siRNA，正義鏈，5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO :35)，反義鏈，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO :36)在96孔板中每孔接種3 X IO3個Huh_7、H印3B、MHCC_97H和MHCC-97L細(xì)胞(無血清培養(yǎng)液)，待細(xì)胞密度達(dá)到40%左右時，利用脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染試劑分別將上述3種siRNA按終濃度50nmol/L轉(zhuǎn)染進(jìn)Huh_7、H印3B、MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞中，4h后換成含10%胎牛血清的DMEM。以24h為I個檢測單位培養(yǎng)7d，每天檢測I次該細(xì)胞密度。每孔待測細(xì)胞液中加IOyL CCK-8，37°C孵育lh。利用酶標(biāo)儀在450nm波長下檢測其吸光度以代表細(xì)胞存活能力，繪制生長曲線。實驗結(jié)果，如圖5所示，表明特異性干擾CSNK1G3表達(dá)的小干擾核糖核酸(siRNA)能夠抑制肝癌細(xì)胞系Huh_7、H印3B、MHCC-97H和MHCC-97L的生長，肝癌細(xì)胞的存活率明顯低于對照組的細(xì)胞，說明干擾CSNK1G3基因的表達(dá)能在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞生長。序列表〈110〉上海人類基因組研究中心<120>CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用<130>CPC-NP-11-15130<160>36、
<170>PatentIn version 3. 3<210>1
<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc—feature〈223〉引物<400>1 gcaccacagc tacatttgga20<210>2<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc—feature〈223〉引物<400>2tccaaactag gtcccagcag20<210>3<211>18<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221 >mi sc—f eature〈223〉引物<400>3catcctgcgt ctggacct18<210>4<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<220><221 >mi sc—f eature〈223〉引物<400>4gtacttgcgc tcaggaggag20<210>5<211>20<212>DNA〈213〉人工序列
〈220〉<22 l>misc_f eature〈223〉引物
〈400>5gggatgaaca tgctccagtt20<210>6<211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22 l>misc_f eature〈223〉引物<400>6tggcagctat ttcagcctac t21<210>7<211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22l>misc_feature〈223〉引物<400>7tttttgacca tgcatttgac t21<210>8<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22 l>misc_f eature〈223〉引物<400>8tgtggcacag acaaacatga20<210>9<211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc—feature〈223〉引物
<400>9ttgtgttggg acctagtgct c21<210>10<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature
〈223〉引物<400>10ccccaccaga taatccagaa20<210>11<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>11agcccagctt ttgtccagta20<210>12
<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>12tggatcccag aaagacaaca20<210>13<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈223〉引物<400>13aggctagtca aagcccaaaa20<210>14
〈211 >21<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22 l>misc_f eature〈223〉引物〈400〉14
tgcatcccca taactgtatc a21<210>15<211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22l>misc_feature〈223〉引物<400>15gaacaaactc tccattcttc ca22<210>16<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22 l>mi sc_f eature〈223〉引物〈400〉16caaagtgtcc ctgtgggttc20<210>17<211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22 l>mi sc_f eature〈223〉引物<400>17cctcccattt ttcttgtgtc tc22<210>18<211>20<212>DNA〈213〉人工序列
〈220〉<22 l>misc_f eature〈223〉引物〈400〉18acggcactac ctgcagaaat20<210>19<211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc—feature〈223〉引物<400>19ttctttttgc tttaccttct tagc24〈210>20<211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22 l>mi sc_f eature〈223〉引物<400>20gggtatccaa atacttccat tct23<210>21<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<22 l>mi sc_f eature〈223〉引物<400>21tgggtggact tctagtgtgc20<210>22<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉
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<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_f eature〈223〉引物
<400>27tcagggagaa agggtgagaa20〈210>28<211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_f eature〈223〉引物<400>28atgggcaaag cactcatgtt20〈210>29<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA<400>29ggcugacaca uuaaaggaga gguau25<210>30<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I). . (25)<223>siRNA<400>30auaccucucc uuuaaugugu cagcc25<210>31<211>25
<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25) <223>siRNA<400>31ucuucguuau guaagaaggc uagau25〈210>32<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I)·· (25)<223>siRNA<400>32aucuagccuu cuuacauaac gaaga25<210>33<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I)·· (25)<223>siRNA<400>33gacuuguuug acuuguguga cagaa25<210>34<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA〈400>34uucugucaca caagucaaac aaguc25<210>35
<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I)·· (21)<223>siRNA<400>35 uucuccgaac gugucacgut t21<210>36<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA<400>36acgugacacg uucggagaat t2權(quán)利要求
1.ー種CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于所述CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、激酶活性檢測、原位雜交、基因芯片或基因測序診斷肝癌的產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增CSNK1G3基因的引物。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用實時定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括ー對特異擴(kuò)增CSNK1G3基因的引物。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括與CSNK1G3蛋白特異性結(jié)合的抗體。
6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用激酶活性檢測的產(chǎn)品包括特異性檢測CSNK1G3激酶活性的底物及反應(yīng)體系。
7.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與CSNK1G3基因的核酸序列雜交的探針。
8.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在干所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與CSNK1G3基因的核酸序列雜交的探針。
9.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用基因測序診斷肝癌的產(chǎn)品包括用于CSNK1G3基因的測序引物。
10.ー種CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于所述CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療肝癌的藥物及方式包括通過RNA干擾抑制CSNK1G3基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體，能夠抑制CSNK1G3蛋白激酶活性的化合物、多肽、單克隆抗體。
12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾特異性抑制CSNK1G3基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸及其不同修飾狀態(tài)、不同遞送方式。
13.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療肝癌的藥物包括攜帶特異性針對CSNK1G3基因干擾其表達(dá)的DNA載體、病毒載體。
14.用于制備用RT-PCR診斷肝癌產(chǎn)品的ー對特異擴(kuò)增CSNK1G3基因的引物，其特征在干所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO :1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互補(bǔ)序列。
15.用于制備用基因測序診斷肝癌的產(chǎn)品中的CSNK1G3基因的測序引物，其特征在于所述測序引物序列具有如SEQ ID NO :5-28所示的序列或其互補(bǔ)序列。
16.用于制備治療肝癌藥物的ー對CSNK1G3基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO :29所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO :30所示序列。
17.用于制備治療肝癌藥物的ー對CSNK1G3基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 31所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO 32所示序列。
18.用于制備治療肝癌藥物的ー對CSNK1G3基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO :33所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID N0:34所示序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，用于制備肝癌診斷及治療的產(chǎn)品。本發(fā)明的CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物，可作為診斷肝癌的特異性標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速；本發(fā)明的CSNK1G3基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為制備治療肝癌藥物的靶基因，提供新的肝癌治療途徑。
文檔編號C12Q1/48GK102690876SQ20111007054
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者李坤雨, 鄧慶, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心