專利名稱：用于檢測(cè)豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因技術(shù)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)、豬圓環(huán)病毒 2 型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型與美洲型(Porcine Reproductive md RespiratorySyndrome Virus Europe type and America type, PRRSE, PRRSVA)基因芯片及芯片的制備方法，以及采用該基因芯片進(jìn)行檢測(cè)或診斷病毒的方法。
背景技術(shù)：
隨著規(guī)?；i場(chǎng)的增加，豬疫病的種類也在增加，舊的疫病沒(méi)有消滅，新的疫病不斷出現(xiàn)，并且隨著病毒株的變異使豬的疫病日益呈現(xiàn)復(fù)雜化和嚴(yán)重化趨勢(shì)。豬瘟 (ClassicalSwine Fever, CSF)、豬圓環(huán)病毒病 2 型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2) 和豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是目前威脅我國(guó)豬的主要傳染性疾病。對(duì)于危害全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的豬主要疫病，快速準(zhǔn)確診斷是控制該病重要前提。常規(guī)的病毒分離診斷方法雖然準(zhǔn)確，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且需要專門的技術(shù)人員進(jìn)行操作。基于分子生物學(xué)的診斷方法要以RT-PCR和熒光PCR為主。RT-PCR比熒光RT-PCR方法靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)；熒光RT-PCR方法具有高靈敏度的特點(diǎn)，但檢測(cè)成本高，并且不能同時(shí)檢測(cè)幾種疾病。近年來(lái)，豬癌病毒(ClassicalSwine Fever Virus，CSFV)、豬圓環(huán)病毒 2 型 (PorcineCircovirus Virus type 2，PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus,PRRSV)已成為危害世界規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的重要豬病癥候群。這些病原均可導(dǎo)致豬的繁殖障礙，且常成混合感染，不易區(qū)分，給臨床鑒別診斷造成較大困難。在這種情況下，如何快速、靈敏、準(zhǔn)確地對(duì)多種疫病同時(shí)做出診斷以及早制定和采取相應(yīng)防制措施是現(xiàn)代動(dòng)物疫病檢疫新的發(fā)展方向。基因芯片技術(shù)是近年來(lái)興起的一種早期快速檢測(cè)的方法，通過(guò)高通量平行檢測(cè)病原體的多個(gè)基因，可大大提高檢測(cè)的靈敏度和精確度，克服了 PCR擴(kuò)增以單個(gè)基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行檢測(cè)而易出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性的缺點(diǎn)，同時(shí)通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析雜交結(jié)果，降低了結(jié)果判斷的主觀因素，因而能夠快速、準(zhǔn)確、高通量地對(duì)多種疾病進(jìn)行早期的快速診斷與排查。但是，目前未有成熟的基因芯片檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬繁殖與呼吸綜合征(亞型)的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力和成本高，且只能對(duì)單一病種進(jìn)行檢測(cè)之不足， 本發(fā)明的目的是提供一種豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因芯片，以及該芯片的制備方法；進(jìn)一步，本發(fā)明還提供采用該基因芯片對(duì)豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬繁殖與呼吸綜合征三種病同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種用于檢測(cè)豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬繁殖與呼吸綜合征的基因芯片，其特征在于采用如下表所示的探針序列
權(quán)利要求
1. 一種用于檢測(cè)豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬繁殖與呼吸綜合征的基因芯片，其特征在于采用如下表所示的探針序列
2.如權(quán)利要求1所述基因芯片，其制備方法包括如下步驟根據(jù) GenBank 中已發(fā)表的 PCV-2、PRRSVE, PRRSVA, CSFV 的序列，應(yīng)用 DNAMar 的MEGALIGN程序找出各個(gè)病毒的保守區(qū)；寡核苷酸潛在的二聚體和特異性用NCBI 即美國(guó)生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站，http //www. ncbi. nlm. nih. gov的BLAST程序結(jié)合 PrimerPremier5. 0、01igo6. 0進(jìn)行鑒定；根據(jù)探針、引物設(shè)計(jì)的相關(guān)原則及利用上述軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段的引物序列和探針序列，其序列和特性見(jiàn)下表1、表2 ；合成時(shí)在每個(gè)探針的5’加上1個(gè)氨基和15個(gè)T ；正鏈引物用CY-3熒光標(biāo)記；引物用雙蒸水稀釋為 100 μ mol/L, -20°c保存?zhèn)溆?；在氨基化片基上點(diǎn)制的60-mer寡核苷酸探針，質(zhì)量等級(jí)為PAGE級(jí)；寡核苷酸探針用無(wú)菌水溶解后，再與2X上樣緩沖液，按1 1混合，使點(diǎn)樣終濃度調(diào)整為25 μ mol/L，通過(guò)晶 S PerSOnalArrayerTM-16個(gè)人點(diǎn)樣儀將探針片段有序地點(diǎn)制成6行X 5列的陣列，每條探針橫向重復(fù)點(diǎn)3個(gè)點(diǎn)；點(diǎn)制好的基因芯片通過(guò)37°C水浴放置18h以上后經(jīng)洗滌、封閉、干燥后置干燥器中室溫保存；所述上樣緩沖液為pH 7. 4含0. 5% SDS的200 μ mol/L PBS ； 表1基因芯片引物序列
3.采用權(quán)利要求1或2所述基因芯片檢測(cè)豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬繁殖與呼吸綜合征的方法，包括如下步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)病毒基因的擴(kuò)增按照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)提取標(biāo)準(zhǔn)豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的DNA或RNA，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行多重PCR體系的構(gòu)建及優(yōu)化，對(duì)優(yōu)化好的體系進(jìn)行帶標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增，體系如下PCR體系I 包括PCV-2、PRRSVA、CSFV的三種模板DNA或者cDNA各1 μ L ； 10XPCRBuffer2. 5 μ L ；濃度 25mmol/L 的 MgCl22 μ L ；濃度為 10mmol/L 四種 dNTPsO. 8 μ L ； Taq DNA聚合酶0. 4 μ L ;5端代CY-3標(biāo)記的10 μ mol/L四種引物各1 μ L，加入無(wú)菌水至 25 μ L體系；PCR 體系 II 包括 PRRSVA、PRRSVE 的 cDNA 各 1 μ L ;10XPCR Buffer2. 5 μ L ；濃度 25mmol/L 的 MgCl22 μ L ；濃度為 10mmol/L 四種 dNTPsO. 8 μ L ；Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L ;5 端代CY-3標(biāo)記的10 μ mol/L兩種引物各1 μ L，加入無(wú)菌水至25 μ L體系；PCR反應(yīng)程序用PCR儀在94°C溫度環(huán)境下變性6min ；循環(huán)步驟為94°C變性30s， 54°C /581退火308，721延伸lmin，進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，PCR產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳；(2)基因芯片雜交配制15 μ L的雜交體系5 μ L的帶標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和10 μ L芯片雜交液，芯片雜交液含25%甲酰胺、10XSSC、0. 2% SDS，將兩者混合均勻后放入PCR儀進(jìn)行高溫變性；變性條件為95°C變性5min后，立即置于冰浴上快速冷卻3min ；將15 μ L雜交體系小心地加入到如權(quán)利要求2所述基因芯片的小孔里，組裝上雜交盒，放入40 42°C的水浴鍋進(jìn)行雜交2 4h ；(3)對(duì)雜交好的芯片清洗及掃描結(jié)果分析對(duì)雜交好的芯片要進(jìn)行洗片；將洗好的芯片置于50ml離心管中在臺(tái)式冷凍離心機(jī)離心aiiin以甩干，再利用晶芯 LUX&an10K-A微陣列芯片共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析；(4)對(duì)被檢病毒基因的檢測(cè)用設(shè)計(jì)的引物對(duì)被檢病毒基因進(jìn)行擴(kuò)增、基因芯片雜交和對(duì)雜交好的芯片清洗及掃描結(jié)果分析，即將標(biāo)有熒光染料的擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上寡核苷酸探針雜交，掃描、分析芯片上熒光信號(hào)；其具體操作方法同步驟(1)、(2)和(3)；并與標(biāo)準(zhǔn)病毒基因掃描結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，獲得檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型與美洲型基因芯片檢測(cè)方法，基因芯片采用如下表所示的探針序列本發(fā)明采用該基因芯片對(duì)豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬繁殖與呼吸綜合征三種疾病同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的方法。解決了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力和特異性差，或只能對(duì)單一病種進(jìn)行檢測(cè)的問(wèn)題。本發(fā)明設(shè)計(jì)的所有探針在5’端均合成一個(gè)連接氨基，并設(shè)計(jì)有一段15bp長(zhǎng)度的多聚T連接臂，結(jié)果表明其具有較高的固定效率。本發(fā)明建立的帶標(biāo)記引物的多重PCR擴(kuò)增技術(shù)能夠一次性擴(kuò)增出多種與對(duì)應(yīng)探針互補(bǔ)的熒光標(biāo)記DNA，保證固液相中核酸雜交的高度特異性和靈敏性。此外，采用此種標(biāo)記分法，可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間，降低芯片檢測(cè)的成本，更適合推廣到臨床應(yīng)用中。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102234693SQ20111005947
公開(kāi)日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者葉芬, 吳勝昔, 李應(yīng)國(guó), 溫海霞, 胡仁建, 蔡家利, 項(xiàng)錦欣 申請(qǐng)人:重慶理工大學(xué)