專利名稱：piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)生產(chǎn)體內(nèi)合成半胱氨酸轉(zhuǎn)基因山羊的載體構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因載體，具體涉及轉(zhuǎn)基因羊的PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
piggyBac轉(zhuǎn)座子是一類來源于鱗翅目昆蟲夜粉蛾的DNA轉(zhuǎn)座子，在哺乳動物細(xì)胞及小鼠中具有很高活性，2005年上海復(fù)旦大學(xué)丁昇等人在piggyBac轉(zhuǎn)座子研究方面取得了重大突破，他們的研究結(jié)果表明PiggyBac轉(zhuǎn)座子可以在人和小鼠細(xì)胞中高效導(dǎo)入基因并穩(wěn)定表達(dá)，并具有攜帶基因容量大，操作簡便等優(yōu)點，他們利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子建立了高效小鼠基因插入突變及篩選技術(shù)，在不到一年內(nèi)培育了數(shù)百個小鼠突變體。復(fù)旦大學(xué)丁昇等人的研究證明利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子在小鼠等哺乳動物中高效、大規(guī)模研究基因功能和轉(zhuǎn)基因已成為可能(丁昇.piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)-哺乳動物遺傳分析的新工具Q)].上海 復(fù)旦大學(xué)，2007)。隨著piggyBac轉(zhuǎn)座子研究的深入，2009年Knut Woltjen借助piggyBac 轉(zhuǎn)座子將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞經(jīng)nature報道后更引起研究著對piggyBac轉(zhuǎn)座子極大興趣和研究熱情(NATURE，2009，458 :766-770)，piggyBac轉(zhuǎn)座子現(xiàn)已被廣泛用于基因誘變、基因治療和轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域。目前，國際、國內(nèi)還未見報道利用piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建載體進(jìn)行羊轉(zhuǎn)基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的piggyBac轉(zhuǎn)座子載體構(gòu)建方法。用本發(fā)明所構(gòu)建的PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)染羊胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊。為了實現(xiàn)上目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案本發(fā)明一方面涉及一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的piggyBac轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建方法，其包括如下步驟合成一段PB堿基序列，將該序列克隆到pBluSKm載體中構(gòu)建成pBluSKm-PB載體；再將Neomycin抗性基因和綠色熒光蛋白基因克隆到pBluSKm-PB載體中，最終構(gòu)建成 pBluSKm-PB-NEO-EGFP轉(zhuǎn)座子載體，所述的PB堿基序列為CCCCCCGGTACCCCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGAT
TATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCGTCGACCCCCCCCATCGATCCCCCCCCCACGCGTTAAAAGTTTTGTTACTTTATAG
AAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGTAAGTGTAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACAGACCGATAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGGGCCGCGGCCCCCCC。在本發(fā)明的一個實施方式中，在克隆Neomycin抗性基因時所用到的引物序列為NEO-F GTCGACCTGTGGAATGTGTGTCAG ；NEO-R ATCGATCAGACATGATAAGATACATTG。在本發(fā)明的另外一個實施方式中，在克隆綠色熒光蛋白基因時所用到的引物序列為EGFP-F ATCGATTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC ；EGFP-R ACGCGTGCAGTGAAAAAAATGCTTTATT。本發(fā)明還涉及上述構(gòu)建方法所構(gòu)建的載體，所述載體優(yōu)選具有6563bp。本發(fā)明還涉及上述載體的用途，其中所述用途為在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的用途。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述細(xì)胞為羊的細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)選為絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞。piggyBac轉(zhuǎn)座子只有在轉(zhuǎn)座酶的輔助作用下才能發(fā)生作用， PBluSKm-PB-NEO-EGFP轉(zhuǎn)座子載體可以在能編碼轉(zhuǎn)座酶的Helper質(zhì)粒協(xié)助下發(fā)生高效轉(zhuǎn)座，因此將目的基因轉(zhuǎn)座到羊基因組上就可以形成轉(zhuǎn)基因羊。本發(fā)明的有益效果還在于構(gòu)建的piggyBac轉(zhuǎn)座子可將EGFP基因和NEO抗性基因共表達(dá)于羊成纖維細(xì)胞，便于后續(xù)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系穩(wěn)定篩選和在倒置熒光顯微鏡下核移植操作。


圖 1 構(gòu)建 pBluSKm-PB-NEO-EGFP 載體示意圖；圖2 =PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)轉(zhuǎn)染45日齡絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)示意圖。圖3 =PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)轉(zhuǎn)染45日齡絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，細(xì)胞中目的NEO基因PCR擴增結(jié)果。其中M為TakaRa公司DL 2000DNA Ladder, 1為陰性細(xì)胞擴增結(jié)果，2為陽性細(xì)胞基因擴增結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例1 :pBluSKm-PB載體構(gòu)建合成一段piggyBac轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座所必需的PB5’端和PB3’端堿基序列，并在 PB5，端和PB3，端之間設(shè)計加上Sail, ClaI, MluI酶切位點的序列，同時在PB5，起始端加 KpnI酶切位點，PB3’末尾端加SacII酶切位點，然后將該段序列克隆到載體pBluSKm中，構(gòu)建成pBluSKm-PB載體。具體序列如下CCCCCC IGGTACd CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCG TGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTT TACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATA TATATATTTTCTTGTTATAGATATC :|GTCGA0 CCCCCCC |ATCGAl| CCCCCCCCC IACGCGT] TAAAAGT
TTTGTTACTTTATAGAAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTT GAATTTATTATTAGTATGTAAGTGTAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATA CAGACCGATAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGG
g IccgcggI ccccccc實施例2 :pBluSKm-PB-NE0 載體構(gòu)建以pcDNA3. 1⑴載體為模板，設(shè)計擴增Neomycin抗性基因引物，并在引物兩端分別添加Sail、ClaI酶切位點。引物序列為NEO-F IgtcgacI ctgtggaatgtgtgtcagNEO-R ^ATCGAlj CAGACATGATAAGATACATTG在25 μ 1反應(yīng)體系中PCR擴增Neomycin抗性基因序列，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 5min，95°C /30sec,60°C /30sec,72°C /90sec，反應(yīng) 35 個循環(huán)，在 72°C延長 lOmin。PCR 產(chǎn)物和實施例3所得質(zhì)粒pBluSKm-PB分別用Sail、ClaI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后用T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建成pBluSKm-PB-NEO載體。實施例3 :pBluSKm-PB-NEO-EGFP 載體構(gòu)建以pEGFP-m載體為模板，設(shè)計引物擴增綠色熒光EGFP報告基因，在引物兩端分別添加ClaKMluI酶切位點。引物序列為egfp-f |atcgai| tagttattaatagtaatcaattacEGFP-R ^CGCGl] GCAGTGAAAAAAATGCTTTATT在25 μ 1反應(yīng)體系中PCR擴增EGFP基因，反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性5min， 95°C /30sec,60°C /30sec,72°C /lOOsec，反應(yīng) 35 個循環(huán)，在 72°C延長 lOmin。PCR 產(chǎn)物和實施例4所得質(zhì)粒pBIuSKm-PB-NEO分別用Clal、MluI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后用T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建成pBluSKm-PB-NEO-EGFP載體。實施例4 :pBluSKm-PB-NEO-EGFP轉(zhuǎn)座載體在絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用將45日齡絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞解凍進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，利用脂質(zhì)體 2000 將 pBluSKm-PB-NEO-EGFP 載體和 Helper 載體(Nat. Biotechnol.，2000,18 81-84)按照3 1比例共轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)G418篩選23d后用熒光顯微鏡檢測綠色熒光表達(dá)情況(見說明書附圖2)實施例5 =NEO抗性基因檢測取經(jīng)pBluSKm-PB-NEO-EGFP載體和Helper載體共轉(zhuǎn)染并用G418篩選23d的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組DNA，設(shè)計引物擴增NEO抗性基因，約1500bp。引物序列為NEO-F CTGTGGAATGTGTGTCAGNEO-R CAGACATGATAAGATACATTG
PCR 反應(yīng)體系為 25 μ 1，95 °C 預(yù)變性 5min，然后 95 °C /30sec，58 V /30sec, 72°C /90sec，35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。結(jié)果如附圖3所示，在陰性細(xì)胞中未擴增出目的條帶，在陽性細(xì)胞中擴增出目的條帶。由此表明目的基因NEO已成功轉(zhuǎn)入到絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞基因組中。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟合成一段PB堿基序列，將該序列克隆到pBluSKm載體中構(gòu)建成pBluSKm-PB載體； 再將Neomycin抗性基因和綠色熒光蛋白基因克隆到pBIuSKm-PB載體中，最終構(gòu)建成 pBluSKm-PB-NEO-EGFP轉(zhuǎn)座子載體，所述的PB堿基序列為CCCCCCGGTACCCCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTT TCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGT CAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGA CTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATAT TTTCTTGTTATAGATATCGTCGACCCCCCCCATCGATCCCCCCCCCACGCGTTAAAAGTTTTGTTACTTTATAGAAG AAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGT AAGTGTAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACAGACCGATAAAACACATG CGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGGGCCGCGGCCCCCCC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建載體的方法，其中在克隆Neomycin抗性基因時所用到的引物序列為NEO-F GTCGACCTGTGGAATGTGTGTCAG ；NEO-R ATCGATCAGACATGATAAGATACATTG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建載體的方法，其在在克隆綠色熒光蛋白基因時所用到的引物序列為EGFP-F ATCGATTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC ；EGFP-R ACGCGTGCAGTGAAAAAAATGCTTTATT。
4.權(quán)利要求1-3任意一項所述構(gòu)建方法所構(gòu)建的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于所述載體的長度為6563bp。
6.權(quán)利要求4或5所述的載體的用途，其特征在于所述用途在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述細(xì)胞為羊的細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述羊的細(xì)胞為絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的piggyBac轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建方法，主要步驟包括①合成一段包含piggyBac轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座所必需的PB5′端和PB3′端堿基序列，合成時在PB5′端和PB3′端中間預(yù)留出多克隆位點，然后將該序列克隆到pBluSKm載體中構(gòu)建成pBluSKm-PB載體；再將Neomycin抗性基因和綠色熒光蛋白基因克隆到pBluSKm-PB載體中最終構(gòu)建成pBluSKm-PB-NEO-EGFP轉(zhuǎn)座子載體。本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)座子載體能夠滿足細(xì)胞篩選、倒置熒光顯微鏡下顯微操作和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊等要求。
文檔編號C12N5/10GK102181466SQ201110041480
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者何曉琳, 方堃, 楊明明, 白丁平, 陳玉林 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)