專利名稱：蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶c的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的磷脂酶C是用于油脂工業(yè)生產(chǎn)的植物油脂脫膠工段。植物油中的磷脂主要有磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰絲氨酸(PQ。磷脂酶C分為PC-PLC (特異性水解PC和PE)和PI-PLC (特異性水解PI)。磷脂酶C廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，但從動(dòng)物、植物中進(jìn)行提取的工藝復(fù)雜，由于伴隨物多且性質(zhì)比較復(fù)雜，使得在提取的過程中磷脂酶C的活性損失大。微生物發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短的優(yōu)勢，且發(fā)酵產(chǎn)物易于分離，是獲得磷脂酶C的首選。由蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵得到的磷脂酶C中，PC-PLC(特異性水解PC和PE)和PI-PLC(特異性水解PI)都有， 非常適合作為用于植物油脫膠的磷脂酶C的生產(chǎn)菌種。目前在國內(nèi)市場上沒有能夠用于植物油脫膠的磷脂酶C供應(yīng)，而Sigma試劑級(jí)磷脂酶C的價(jià)格10毫克在2000元人民幣左右，在經(jīng)濟(jì)上不合算，不能作為植物油脫膠之用。 考慮到磷脂酶C的實(shí)際用途是為了能夠用于植物油脫膠，所需的磷脂酶C純度不需要特別高，只要能夠達(dá)到植物油脫膠的效果即可。國內(nèi)有研究人員篩選到了能夠產(chǎn)磷脂酶C的菌株，但其篩菌過程繁瑣且周期長， 對其進(jìn)行菌種鑒定后，編號(hào)不是國內(nèi)或國際統(tǒng)一的，根據(jù)這個(gè)編號(hào)買不到該菌株，在推廣上不具有普遍性。我們從國內(nèi)微生物菌種保藏中心現(xiàn)有的菌種中進(jìn)行篩選，所用菌株的編號(hào)明確，大大縮短篩菌周期，且易于推廣。也有研究人員通過基因工程的方法，利用畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)磷脂酶C，但是由于畢赤酵母存在大量包涵體，使得后續(xù)的分離提取過程非常繁瑣。本方法后續(xù)分離操作簡便，非常適合放大生產(chǎn)。目前發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法都是以經(jīng)過多次純化，提高其酶活為目的，并非針對特定應(yīng)用目的進(jìn)行的。本方法所產(chǎn)的磷脂酶C是針對用于植物油脫膠的。利用蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)磷脂酶C的發(fā)酵過程中，都是采用的LB培養(yǎng)基，而本方法則針對性的添加了 ZnSO4 · 7H20或SiCl2,卵磷脂或磷脂混合物(PC、ΡΕ、PI、PS等的混合)，極大的提高了蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)磷脂酶C的能力。該發(fā)明方法采用國內(nèi)微生物菌種保藏中心的蠟狀芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過卵黃平板進(jìn)行篩選，找出能夠產(chǎn)磷脂酶C的菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到能夠用于植物油脫膠的磷脂酶C。實(shí)施例中所列菌株CMCC63302與GIM1. 300是同一種菌株，只是編號(hào)不同， ASl. 196與GIM1. 4是同一種菌株，只是編號(hào)不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種菌株編號(hào)明確，生產(chǎn)能力強(qiáng)的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法。
為了解決上述技術(shù)的問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，是將蠟狀芽孢桿菌接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后得到種子液；將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到發(fā)酵液；對發(fā)酵液進(jìn)行分離即得到磷脂酶C。本發(fā)明也可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)以上所述的發(fā)酵培養(yǎng)基由牛肉膏、蛋白胨、 NaCl、水、ZnSO4 · 7H20和卵磷脂組成。本發(fā)明也可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)以上所述的發(fā)酵培養(yǎng)基由牛肉膏、蛋白胨、 NaCl、水、ZnCl2和磷脂混合物組成。本發(fā)明也可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)以上所述的蠟狀芽孢桿菌為CMCC63302號(hào)菌株。本發(fā)明也可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)以上所述的蠟狀芽孢桿菌為ASl. 196號(hào)菌株。本發(fā)明還可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)以上所述的蠟狀芽孢桿菌為GIMT1. 104號(hào)菌株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是采用蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法具有菌株編號(hào)明確，工藝簡便，生產(chǎn)能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述采用蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，是通過50%卵黃液的制備取新鮮土雞蛋一枚，用75%的酒精擦凈外表，用消毒的鑷子輕輕敲開蛋殼，流出蛋清，用無菌水沖洗卵黃1 2次，用滅菌后的玻璃注射器吸取10毫升卵黃，加入到裝10毫升無菌水的100毫升的三角瓶中搖勻，密封，即可制得50%卵黃液。卵黃平板的組成=NaCl,0. 66% ；硼酸，1.09% ；硼砂，0. 19% ；瓊脂，1.5% ；卵黃液， 5%。先稱取NaCl、硼酸、硼砂，溶于水中，加入1.5%的瓊脂，加熱使瓊脂充分溶解，用紗布濾去少量未溶解的瓊脂，補(bǔ)水至準(zhǔn)確體積后滅菌。取10毫升50%卵黃液加入至90毫升已滅菌并已冷卻至55度左右的硼砂瓊脂液中，趁熱搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后即得卵黃平板。配置LB培養(yǎng)基NaCl，0. 5% ；蛋白胨，0. 5% ；牛肉膏，0. 3%。調(diào)整pH至7.0 7. 2，121度滅菌20分鐘。將菌種接種到裝有LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37度，搖床培養(yǎng)得到種子液。接種種子液于LB培養(yǎng)基中，37度，180轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)2 30小時(shí)，從第2小時(shí)開始，每隔1小時(shí)取樣一次，室溫，10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心20分鐘，取上清液。在卵黃平板上平放牛津杯，吸取100微升上清液置于杯中，于恒溫培養(yǎng)箱中37度培養(yǎng)M小時(shí)，觀察是否有乳白色暈圈出現(xiàn)，如果有，則說明此菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后可以產(chǎn)生磷脂酶C，可進(jìn)行下一階段的發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵路線如下(1)配置發(fā)酵培養(yǎng)基牛肉膏，3 15克；蛋白胨，5 10克；NaCl，5 8克；水， 1000克；ZnSO4 · 7H20或ZnCl2,0 100毫克；卵磷脂或磷脂混合物(PC、ΡΕ、PI、PS等的混合)，0 10克；pH，4 10。121度滅菌20分鐘。(2)微生物發(fā)酵將菌種接種到裝有LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37度，搖床培養(yǎng)得到種子液。然后將體積比0. 01 15%的種子液接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，20 50 度，70 260轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)1 M小時(shí)，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液可以通過以下幾種方式進(jìn)行分離①發(fā)酵液在4 35度，3000 10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5 45分鐘，取上清，即為磷脂酶C的酶液，測酶活。此法比較環(huán)保，環(huán)境污染小且酶的損失小。②調(diào)整pH至6 8，加固體(NH4)2SO4至55 80%，室溫?cái)嚢?. 5 2小時(shí)，2 15度過夜沉淀，2 15度，3000 10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5 45分鐘，顆粒懸于發(fā)酵液體積 0. 1 10%的10毫摩爾/升Tris-HCl緩沖液中(pH6 8)，用30 1000倍體積的10毫摩爾/升Tris-HCl緩沖液(pH6 8)進(jìn)行2 10次透析，得到磷脂酶C的酶液，測酶活。 此法是在酶的純化中用的最多的，很經(jīng)典的方法，但因?yàn)橐罅渴褂?NH4)2SO4，對環(huán)境是不利的。③發(fā)酵液在4 35度，3000 10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5 45分鐘，取上清，轉(zhuǎn)入截留分子量8000 40000道爾頓的透析袋中，于真空度0. 1 20000帕條件下進(jìn)行抽濾透析，轉(zhuǎn)移出透析袋中的液體，即為磷脂酶C的酶液，測酶活。此法比較環(huán)保，環(huán)境污染小且酶的損失小。下面分別敘述采用三種編號(hào)菌株的生產(chǎn)過程(1)菌株編號(hào)=CMCC633O2從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移一環(huán)菌株于50毫升的LB培養(yǎng)基中，37度，150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，作為種子液。接種1. 5毫升種子液于100毫升LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行37度，180轉(zhuǎn) /分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，室溫，10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心20分鐘，取上清液。在卵黃平板上平放牛津杯，吸取100微升上清液置于杯中，于恒溫培養(yǎng)箱中37度培養(yǎng)M小時(shí)，觀察到有乳白色暈圈出現(xiàn)。從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移一環(huán)菌株于50毫升的LB培養(yǎng)基中，37度，150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，作為種子液。接種1. 5毫升種子液于100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行37度，150 轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，4度，9000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離20分鐘，收集得到的上清，調(diào)整 pH至6. 5，加固體(NH4)2SO4至55%，室溫?cái)嚢?小時(shí)，5度過夜沉淀，4度，8000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心25分鐘，顆粒懸于發(fā)酵液體積10%的10毫摩爾/升Tris-HCl緩沖液中(pH6. 5)，用 300倍體積的10毫摩爾/升Tris-HCl緩沖液(pH6. 5)進(jìn)行3次透析，得到磷脂酶C的酶液，測酶活為8.1單位/毫升。(2)菌株編號(hào)AS1. 196從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移一環(huán)菌株于50毫升的LB培養(yǎng)基中，37度，150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，作為種子液。接種1. 5毫升種子液于100毫升LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行37度，180轉(zhuǎn) /分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，室溫，10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心20分鐘，取上清液。在卵黃平板上平放牛津杯，吸取100微升上清液置于杯中，于恒溫培養(yǎng)箱中37度培養(yǎng)M小時(shí)，觀察到有乳白色暈圈出現(xiàn)。從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移一環(huán)菌株于50毫升的LB培養(yǎng)基中，37度，150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，作為種子液。接種1毫升種子液于100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行37度，150轉(zhuǎn) /分鐘搖床培養(yǎng)12小時(shí)，25度，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離20分鐘，收集得到的上清，測酶活為21. 2單位/毫升。
(3)菌株編號(hào):GIMT 1. 104從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移一環(huán)菌株于50毫升的LB培養(yǎng)基中，37度，150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，作為種子液。接種1. 5毫升種子液于100毫升LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行37度，180轉(zhuǎn) /分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，室溫，10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心20分鐘，取上清液。在卵黃平板上平放牛津杯，吸取100微升上清液置于杯中，于恒溫培養(yǎng)箱中37度培養(yǎng)M小時(shí)，觀察到有乳白色暈圈出現(xiàn)。從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移一環(huán)菌株于50毫升的LB培養(yǎng)基中，37度，150轉(zhuǎn)/分鐘，搖床培養(yǎng)4小時(shí)，作為種子液。接種2毫升種子液于100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行37度，150轉(zhuǎn) /分鐘搖床培養(yǎng)8小時(shí)，25度，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離20分鐘，收集得到的上清，轉(zhuǎn)入截留分子量8000道爾頓的透析袋中，于真空度15000帕條件下進(jìn)行抽濾透析，轉(zhuǎn)移出透析袋中的液體，測酶活為13. 2單位/毫升。
權(quán)利要求
1.一種蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，其特征在于將蠟狀芽孢桿菌接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后得到種子液；將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到發(fā)酵液；對發(fā)酵液進(jìn)行分離即得到磷脂酶C。
2.如權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基由牛肉膏、蛋白胨、NaCl、水、ZnSO4 · 7H20和卵磷脂組成。
3.如權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基由牛肉膏、蛋白胨、NaCl、水、ZnCl2和磷脂混合物組成。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，其特征在于蠟狀芽孢桿菌為CMCC63302號(hào)菌株。
5.如權(quán)利要求1、2或3所述的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，其特征在于蠟狀芽孢桿菌為ASl. 196號(hào)菌株。
6.如權(quán)利要求1、2或3所述的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，其特征在于蠟狀芽孢桿菌為GIMT 1. 104號(hào)菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法。屬于酶催化反應(yīng)的技術(shù)領(lǐng)域。其用于解決在生產(chǎn)磷脂酶C所用菌株和工藝復(fù)雜的的問題。蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，是將蠟狀芽孢桿菌接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后得到種子液，將種子液接種到由牛肉膏、蛋白胨、NaCl、水、ZnSO4·7H2O或ZnCl2和卵磷脂或磷脂混合物(PC、PE、PI、PS等的混合)組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到發(fā)酵液，對發(fā)酵液進(jìn)行分離即得到磷脂酶C。采用這種蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶C的方法，可廣泛地應(yīng)用于植物油脫膠的磷脂酶C生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/085GK102206616SQ201110022039
公開日2011年10月5日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者劉元法, 周紅茹, 宋志華, 李進(jìn)偉, 王興國, 金青哲, 黃健花 申請人:江南大學(xué)