專利名稱：一種含復腦素的紅花的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高復腦素含量的紅花的篩選方法。
背景技術(shù)：
紅花Carthmus tinctorius L.為菊科植物紅花的干燥管狀花，臨床應用廣泛。 主要化學成分有黃酮類、吲哚類、木脂素類、烷基二醇類等。其中山奈酚-3-0-蕓香糖苷， 英文名=Nicotiflorin,俗稱復腦素，縮寫為FNS:)是紅花的重要活性成分之一，具有抗心肌缺血、腦缺血、保護腦神經(jīng)元細胞等多種藥理活性，對心腦血管疾病有很好的防治作用，具有很好的應用前景(詳見參考文獻1.郭美麗，張戈，張漢明復腦素在心腦血管疾病中的應用.中專利 ZL01131942. 9 ;2. Runping Li, Meili Guo，Ge Zhang, Xiongfei Xu, QuanLi :Nicotiflorin reduces cerebral ischemic damage and upregulates endothelialnitrie oxide synthase in primarily cultured rat cerebral blood vessel endothelialcells. Ethnopharmacology,2006. 107(1) 143-150 ；3.Runping Li, Meili Guo, GeZhang, Xiongfei Xu, and Quan Li !Neuroprotection of nicotiflorin in permanentfocal cerebral ischemia and in neuronal cultures.Biological & PharmaceuticalBulletin, 2006. 29(9) 1868-1872)。因此，紅花中 FNS 含量的高低，直接影響紅花品質(zhì)的優(yōu)劣。對紅花品質(zhì)相關(guān)功能基因進行研究，對提高紅花的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。目前傳統(tǒng)的篩選含F(xiàn)NS的紅花品種的方法有高效液相方法(張戈，郭美麗，李穎，張漢明，蘇中武不同品種紅花黃酮類成分的HPLC含量測定及其遺傳穩(wěn)定性研究中草藥2004,35(12) 1411-1414)，但此方法需將紅花藥材成品曬干并用含水溶劑提取得到FNS 的提取物后，再用純度高的FNS為對照品進行含量測定后才能檢測到，而直接應用基因條帶篩選可不需對照品，直接從新鮮紅花材料中篩選含F(xiàn)NS的品種。cDNA-AFLP技術(shù)(cDNA amplified fragment length polymorphism)，是Bachem等將AFLP技術(shù)應用于mRNA表達差異分析的mRNA指紋圖譜技術(shù)，廣泛應用于植物生長發(fā)育過程基因分離與差異表達特性的研究。分群分類方法(BSA)，是由Michelmore等(Michelmore R W et al. Identification of markers todisease resistance genes by Bulked Segregant analysis. A rapid method to detectmarders in specific genomic regions by using segregating populations. Proc NatlAcad Sci USA,1991,88 9828-9832) 提出的一種篩選分子標記的高效方法。即按照選擇目標把單交組合產(chǎn)生的F2代、回交群體或者DH群體的個體分成兩個混合群體，這樣在兩個群體之間除了目的性狀以外，遺傳背景是一致的，具有和近等基因系相似的遺傳組成，是對近等基因系的原理的一種突破。通過對這兩個群體進行cDNA-AFLP引物的篩選可以找到與目的基因相連鎖的標記。cDNA-AFLP和 BSA的結(jié)合可以大大地提高篩選的效率。目前尚無應用cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合BSA法對含與不含F(xiàn)NS的紅花進行差異表達分析。本發(fā)明的目的在于利用cDNA-AFLP技術(shù)，結(jié)合BSA法在紅花中找到與FNS緊密連鎖的基因，繼而提供一種篩選FNS的紅花品種的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種 含復腦素(FNS)的紅花的篩選方法。本發(fā)明應用cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合BSA法對含與不含F(xiàn)NS的紅花進行差異表達分析，在紅花中找到與FNS緊密連鎖的1條基因，該基因具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。具體方法如下本發(fā)明以高FNS含量的紅花No. 25為父本，不含F(xiàn)NS的紅花品系No. 16為母本，進行雜交，獲得Fl代種子，F(xiàn)l代種子進行自交加代獲得的F2種子，繼續(xù)種植，從單粒F2種子獲得F2代群體共計215個單株。然后進行以下步驟1.根據(jù)F2代群體的FNS的含量有無，取等量含F(xiàn)NS的F2代個體的花冠混成有池， 另取不含F(xiàn)NS的F2代個體的花冠混成無池；2.提取紅花總RNA，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA ；3.通過cDNA-AFLP對含有FNS與不含F(xiàn)NS的紅花的差異表達分析，在PstI-CG/ MseI-TT引物組合中獲得TDF-2' —條片段4.對TDF-2'片段進行回收，克隆和測序。TDF-2'具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供了一種含F(xiàn)NS的紅花的篩選方法，該方法是用cDNA序列分析方法鑒定紅花基因中含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。上述序列分析方法包括RT-PCR方法、Northerning Bloting法以及cDNA末端快速擴增(RACE)法等。上述方法包括以下步驟A、根據(jù)TDF-2' (SEQ ID No. 1)序列設(shè)計并合成RT-PCR引物，TDF-2‘引物S2 :5，-TAGCAGATTGGGAGTT-3，A2 5 ’ -CTAAGAGCAGGGTTTG-3’B、提取紅花的總RNA;C、以紅花總RNA為模板，翻轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA ；D、以第一鏈cDNA為模板加入合成的引物，進行PCR擴增；E、瓊脂糖電泳，紫外顯色；F、測序。在含F(xiàn)NS的紅花中得到與SEQ ID NO. 1相同序列的基因，而在不含F(xiàn)NS的的紅花中未得到，證明cDNA-AFLP實驗的可靠性。按照上述篩選含F(xiàn)NS紅花的方法，在含F(xiàn)NS的紅花品種和不含F(xiàn)NS的紅花品種共 12個不同紅花品種之間應用此方法，均發(fā)現(xiàn)在含有FNS的紅花中有與TDF-2'相同序列的基因片段，而在不含F(xiàn)NS的紅花中不存在。本發(fā)明為篩選含F(xiàn)NS的紅花 品種，進而為實現(xiàn)紅花高品質(zhì)性狀的定向調(diào)控奠定基石出。


圖1 紅花cDNA-AFLP差異表達的銀染結(jié)果。
箭頭代表TDF-2 ‘ ；M =DL 2000 DNA相對分子標記；1-13 不含F(xiàn)NS的F2代單株；14 母本；15-19 含F(xiàn)NS的F2代單株；20 父本；21 不含F(xiàn)NS池；22 含F(xiàn)NS池；引物 Pstl-CG/Msel-TT圖2 :cDNA-AFLP差異表達片段在RT-PCR的驗證結(jié)果。 1-5含F(xiàn)NS的F2代單株；8-14 不含F(xiàn)NS的F2代單株
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細描述。實施例1:本發(fā)明TDF-2'片段的分離1.應用高效液相色譜方法、薄層色譜法測定F2代群體的FNS的含量，檢測其有無。2.根據(jù)測定結(jié)果各取含與不含F(xiàn)NS的紅花花冠，提取總RNA，并轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA。3.構(gòu)建含與不含F(xiàn)NS的近等基因池，取含F(xiàn)NS單株的cDNA各1 μ g，共10株混成有池；另取不含F(xiàn)NS的cDNA單株各1 μ g共10株混成無池。4. cDNA-AFLP差異表達分析(1)限制性酶切與接頭連接采用PstI和MseI兩種限制性內(nèi)切酶對cDNA雙酶切， 酶切時間37°C 6h ；然后用T4DNA連接酶將PstI和MseI接頭與酶切片段連接，16°C 12h。(2)片段的預擴增本研究用連接產(chǎn)物做模板，采用預擴增引物組合Pc^i^G' -G ACTGCGTACATGCAG-3 ‘ /5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAA-3 ‘)。對連接產(chǎn)物稀釋 10 倍。在 Biometra PTC-200 型 PCR 儀上按以下程序擴增:94°C 3min,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)； 72°C 5min ；4°C保溫。預擴增產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠上檢測，-20°C保存?zhèn)溆谩?3)選擇性擴增采用選擇性擴增引物組合P+nn/M+nn(5 ‘ -GACTGCGTACATGCAGNN-3 ‘/5' -GATGAGTCCTGAGTAANN-3 ‘ (N 代表 ACGT，N 代表 ACGT 任意一種，P1-P16 共 16 條引物，M1-M16共16條引物))，對預擴產(chǎn)物稀釋150倍。選擴反應體系根據(jù)Bachem等體系作略微調(diào)整。擴增程序94°C 3min，94°C 30s,65°C 30s每循環(huán)降低0. 7°C，72°C Imin 12個循環(huán)，94°C 30s，退火溫度56°C 30s。72°C Imin 30個循環(huán)，72°C IOmin ；4°C保溫。擴增產(chǎn)物在 1. 5%瓊脂糖檢測，-20°C保存?zhèn)溆谩?4) cDNA-AFLP擴增產(chǎn)物的電泳按30V/cm的電壓進行30min預電泳。擴增產(chǎn)物 溴酚蘭8 3混合，95°C變性8min，立即冰浴。去除在預電泳時擴散出來的尿素后加樣， 1800V電泳，恒壓。(5)銀染檢測固定膠將膠浸在固定液中振蕩20min至電泳染料顏色消失。用超純水洗膠三次，每次8min。染色30min。將膠浸入超純水中、取出浙水、立即放入盛有預冷顯色液顯色膠在搖床上搖動至出現(xiàn)模板帶或可見第一條帶。將膠轉(zhuǎn)至剩余的1升預冷的顯色液中，繼續(xù)顯色3-5min或至全部條帶顯現(xiàn)出來。加入1升固定/終止溶液，在搖床上反應2-3min，終止顯色反應。用超純水漂洗聚丙烯酰胺凝膠兩次，每次5min，室溫放置干膠， 如圖1所示。5. TDF-2'的分離克隆和測序?qū)⒁颬stl-CG/Msel-TT篩選得到的特異性片段 TDF-2'，從PAGE膠上回收，并以此片段為模板作PCR。瓊脂糖擴增產(chǎn)物采用Axygen生物技術(shù)(杭州)有限公司AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進行回收，回收的多態(tài)性片段連接至 PMD-18T vector中，并轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α。通過氨芐抗性篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性克隆，將陽性克隆擴倍后送往Introgen公司測序，測得序列為292bp如SEQ ID No. 1所示。SEQ ID No. 1 (TDF-2 ‘ ) 292bpCGTTCTTAGATGTAGCCTATCTTTTATTGTATGGGAACTTACCTTCTCAGAGCCAGTTAGCAGATTGGGAGTTCACTGTAGCACAACATTCAGCTGTTCCACAGGGAATCTTGGAT
ATCATACATGCCATGCCTCATGATGCTCATCCAATGGGTGTTCTGGTCAGTGCAATGAGCGCCCTTTCTGTACTTCATCCTGATGCAAACCCTGCTCTTAGAGGTCAAGATCTGTACAAGTCTAAGCCAGTGCGAGATAAGCAAATAGTGCGCATACTTGGGAAGGCACCAACTAT實施例2 RT-PCR對TDF-2 ‘基因表達驗證A、根據(jù)TDF-2' (SEQ ID No. 1)序列設(shè)計并合成RT-PCR引物如下S2 :5，-TAGCAGATTGGGAGTT-3，(SEQ ID No. 2)A2 :5，-CTAAGAGCAGGGTTTG-3，(SEQ ID No. 3)B、提取石河子紅花的總RNA ；C、以紅花總RNA為模板，翻轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA ；D、以第一鏈cDNA為模板，加入合成的引物，進行PCR擴增；E、瓊脂糖電泳，紫外顯色。F、測序。在含F(xiàn)NS的紅花中得到與SEQ ID No. 1相同序列的基因，而在不含F(xiàn)NS的紅花中未得到，證明cDNA-AFLP實驗的可靠性，如圖2所示。實施例3 本篩選方法的應用1.分別提取各產(chǎn)地含與不含F(xiàn)NS紅花總RNA，轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA。2.應用Pstl-CG/Msel-TT引物組合，用實施1的方法對含有FNS與不含F(xiàn)NS紅花進行cDNA-AFLP差異表達分析，在石河子紅花，塔城紅花，若羌紅花，烏魯木齊紅花，上海紅花，崇明紅花，清徐紅花，海南紅花中獲得1條特異性片段，而在哈密紅花，吳中古城紅花， 芮城紅花，新鄉(xiāng)紅花，菏澤紅花，毫州紅花，簡陽紅花，開封紅花，鄭州紅花，四川重慶紅花中未獲得。3.含有該條特異性片段的上述紅花品種經(jīng)用高效液相方法測定，均含F(xiàn)NS ；而不含上述片段的品種，均不含F(xiàn)NS。4.對該條片段進行回收，克隆和測序，與TDF-2'序列相同。5.用實施2的方法進行RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)在含有FNS的紅花品種如石河子紅花， 塔城紅花，若羌紅花，烏魯木齊紅花，上海紅花，崇明紅花，清徐紅花，海南紅花中存在；在不含F(xiàn)NS的紅花品種如哈密紅花，吳中古城紅花，芮城紅花，菏澤紅花，簡陽紅花，開封紅花， 鄭州紅花，四川重慶紅花中不存在。
權(quán)利要求
1.一種含復腦素的紅花的篩選方法，其特征在于該方法是用CDNA序列分析方法鑒定紅花基因中含有如SEQ ID No. 1核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含復腦素的紅花的篩選方法，其特征在于其中的cDNA序列分析方法是RT-PCR方法、Northerning Bloting法或cDNA末端快速擴增法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種含復腦素的紅花的篩選方法，其特征在于該方法包括以下步驟A、設(shè)計并合成下述RT-PCR引物； 5' -TAGCAGATTGGGAGTT-3‘5’ -CTAAGAGCAGGGTTTG-3，B、提取紅花的總RNA；C、以紅花總RNA為模板，翻轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；D、以第一鏈cDNA為模板加入合成的引物，進行PCR擴增；E、瓊脂糖電泳，紫外顯色；F、測序。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物科學技術(shù)領(lǐng)域，由于紅花的重要活性成分復腦素含量的高低，直接影響紅花品質(zhì)。本發(fā)明采用cDNA-AFLP對兩者的表達特性進行分析，分離與復腦素密切相關(guān)的差異表達基因，通過RT-PCR進一步驗證其特征基因型及cDNA-AFLP方法的正確性。本發(fā)明獲得的特異性DNA片段具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本發(fā)明將上述特異性DNA片段用于篩選含復腦素的紅花品種，進而為實現(xiàn)紅花高品質(zhì)性狀的定向調(diào)控提供有效途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102154465SQ20111000364
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者劉宏艷, 王章建, 郭美麗 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學