專利名稱：Xa10與AvrXa10之間的分子相互作用的制作方法
XaIO與AvrXaIO之間的分子相互作用
序列表提交本申請(qǐng)與電子形式的序列表一起遞交。序列表命名為2577_204_Sequence_Listing, txt, 2010年8月27日創(chuàng)建。電子形式的序列表的信息全部引入本文。
背景技術(shù)：
本發(fā)明一般而言涉及植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)，以及賦予植物細(xì)菌性疾病抗性的方法。本發(fā)明還涉及可用于控制在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子序列。本發(fā)明中說明本發(fā)明背景或者關(guān)于實(shí)施本發(fā)明提供另外的詳細(xì)描述的出版物及其它材料并入本文作參考，方便起見分別在參考文獻(xiàn)中示出。革蘭氏陰性致病菌使用III型分泌系統(tǒng)(TTSS)將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)位進(jìn)植物細(xì)胞中，在此其調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞功能以有益于侵入過程(He et al., 2004)。黃單胞菌(Xanthomonas)和青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的致病變型具有大的AvrBs3效應(yīng)子(effector)家族(Schornack et al., 2006; Heuer et al.，2007)。AvrBs3_ 樣效應(yīng)子,也稱作轉(zhuǎn)錄激活子樣(TAL)III型效應(yīng)子(Yang et al.，2006)，是顯著相似的。每個(gè)均具有重復(fù)數(shù)目不同的34個(gè)氨基酸序列的中心近完美重復(fù)，不完美的七個(gè)一組的亮氨酸拉鏈(LZ)重復(fù)，三個(gè)高保守的C-末端核定位信號(hào)(NLS)，以及C-末端酸性轉(zhuǎn)錄激活子樣結(jié)構(gòu)域(AAD)。一些研究表明來自稻黃單胞菌稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv oryzae) (Xoo)和野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變之種(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria) (Xcv)的 TAL 效應(yīng)子特異性激活關(guān)聯(lián)宿主基因以促進(jìn)疾病易感性(Yang et al., 2006; Sugio et al., 2007; Kayet al.，2007)或者引發(fā)疾病抗性(Gu et al., 2005; Romer et al.，2007)。近來，TAL效應(yīng)子的DNA結(jié)合特異性的密碼被破解，其基于來自胡椒(Capsicum annuum)的關(guān)聯(lián)Bs3和upa基因的啟動(dòng)子中保守的AvrBs3結(jié)合位點(diǎn)以及一些其它TAL效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)的詳細(xì)鑒定(Kayet al., 2009; Romer et al., 2009a; Boch et al.，2009)。根據(jù)建議的模型，包括最 C-末端半重復(fù)(most C-terminal half repeat)的每個(gè)TAL效應(yīng)子重復(fù),其在位置12和13示出超變氨基酸，特異性識(shí)別宿主基因啟動(dòng)子的DNA結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)核苷酸及在5’末端的保守的 T(Boch et al.，2009)。由Xoo導(dǎo)致的稻細(xì)菌枯萎病(bacterial blight)是稻的最具破壞性的細(xì)菌性疾病之一，在全亞洲的灌溉和降雨低地稻生長(zhǎng)區(qū)域中流行(Mew，1987)。宿主遺傳抗性的利用是控制這種疾病的最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。在栽培的和野生的稻中鑒別了超過30個(gè)對(duì)Xoo具有種族特異性抗性的抗性(R)基因或基因座(Nino-Liu et al.，2006)。其中六個(gè)已經(jīng)被克隆，其基因產(chǎn)物不出顯著多樣性(Chu et al.2006;Gu et al.2005; Iyer andMcCouch, 2004; Song et al., 1995; Sun et al., 2004; Yoshimura et al.，1998)。發(fā)現(xiàn)R基因Xa27 (Gu et al., 2005)和疾病易感基因0s8N3或者隱性R基因xal3的易感等位基因(Yanget al., 2006)分別被TAL效應(yīng)子AvrXa27和PthXol特異性誘導(dǎo)。近來鑒別了其關(guān)聯(lián)宿主基因的啟動(dòng)子中兩個(gè)TAL效應(yīng)子的結(jié)合位點(diǎn)(Romer et al., 2009b;Boch et al., 2009).近來的遺傳學(xué)研究表明一般性轉(zhuǎn)錄因子OsTFIIA Y 5是AvrXa27完全激活稻中的Xa27轉(zhuǎn)錄及Xa27-介導(dǎo)的對(duì)細(xì)菌枯萎病的疾病抗性所需的(Gu et al.2009)。
細(xì)菌枯萎病R基因XalO最初從稻栽培種Cas209中鑒別(Mew et al., 1982 ；Yoshimura et al.，1983),隨后漸滲入易感稻品種 IR24 中(Ogawa et al.，1988)。來自Xoo菌株P(guān)X086的關(guān)聯(lián)avrXalO基因編碼TAL III型效應(yīng)子的一個(gè)成員(Hopkins etal.，1992)。XalO基因座最初作圖到染色體11的長(zhǎng)臂(IlL)，在近端(proximal) RAPD標(biāo)記0072000(5.3cM)與遠(yuǎn)端(distal) RFLP 標(biāo)記 CD0365 (16.2cM)之間的區(qū)域中(Yoshimura etal.，1995)。近來其被作圖到近端標(biāo)記M491與遠(yuǎn)端標(biāo)記M419之間的遺傳距離0.28cM,并且與標(biāo)記 S723 和 M604 共分離(Gu et al.，2008)。因此，希望揭示賦予稻及其它植物細(xì)菌性疾病抗性的核酸和方法。也希望揭示可用于稻及其它植物物種的遺傳工程中的分離的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子序列。發(fā)明概述本發(fā)明一般性涉及植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)，及涉及賦予植物細(xì)菌性疾病抗性的核酸及方法。本發(fā)明還涉及可用于在轉(zhuǎn)基因植物中控制表達(dá)的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子序列。根據(jù)本發(fā)明，描述了編碼抗性基因XalO的基因的克隆和鑒定，其賦予細(xì)菌枯萎病抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗性是針對(duì)由黃單胞菌導(dǎo)致的細(xì)菌枯萎病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是稻。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述植物是大麥、燕麥、小麥、玉米、甘藍(lán)、花椰菜、馬鈴薯、番茄、胡椒、辣椒、大豆或油菜籽。因此，第一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其編碼:具有SEQ ID N0:37所示氨基酸序列的XalO多肽，或者(ii)與所述XalO多肽具有至少50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽當(dāng)轉(zhuǎn)染進(jìn)植物中時(shí)為植物提供了黃單胞菌抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少60%相同性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少70%相同性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Qi)的多肽具有至少80%相同性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少90%相同性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少95%相同性。在再一個(gè)實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少 98%相同性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少99%相同性。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼XalO多肽的核酸具有SEQ ID NO:35所示核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼XalO多肽的核酸具有SEQ ID NO: 36所示核苷酸序列。在再一個(gè)實(shí)施方案中，編碼XalO多肽的核酸具有SEQ ID NO: 36的第54-437位核苷酸所示核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，編碼XalO多肽的核酸具有SEQ ID NO:35的第2423-3234位核苷酸所示核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼(i)或(ii)的多肽的分離的核酸可以與編碼如本文所述一異源多肽的核酸可操縱地連接。本發(fā)明還提供了如本發(fā)明所述的XalO多肽。此外，本發(fā)明提供了包含所述分離的核酸的植物細(xì)胞及包含所述植物細(xì)胞的對(duì)黃單胞菌抗性的轉(zhuǎn)基因植物。第二方面，本發(fā)明提供了包含分離的核酸的載體，所述核酸編碼(i)具有SEQ IDNO: 37所示氨基酸序列的XalO多肽，或者(ii)與所述XalO多肽具有至少50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽當(dāng)如本發(fā)明所述轉(zhuǎn)染進(jìn)植物中時(shí)提供了對(duì)黃單胞菌抗性的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體進(jìn)一步包含植物啟動(dòng)子，其與所述分離的核酸可操縱地連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子選自組織特異性啟動(dòng)子，組成性啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。在再一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自具有SEQ ID NO: 38所示核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子，具有SEQID NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子，及具有SEQ ID N0:39所示核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自含有具有SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的AvrXalO框(box)的啟動(dòng)子，及含有AvrXalO框的衍生物的啟動(dòng)子，其中所述AvrXalO框的衍生物選自:具有SEQ ID NO: 26所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ IDNO:28所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:30所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQID N0:31所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:68所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:72所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:73所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 74所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO:82所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID N0:83所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID N0:84所示核苷酸序列的衍生物及具有SEQ ID N0:85所示核苷酸序列的衍生物。本發(fā)明還提供了包含所述載體的植物細(xì)胞及包含所述植物細(xì)胞的對(duì)黃單胞菌抗性的轉(zhuǎn)基因植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體中編碼(i)或(ii)的多肽的分離的核酸如本發(fā)明所述可以與編碼異源多肽的核酸可操縱地連接。第三方面，本發(fā)明提供了(i)使植物對(duì)黃單胞菌有抗性的方法，(b)增強(qiáng)植物中黃單胞菌抗性的方法，及(C)賦予植物黃單胞菌疾病抗性的方法。這些方法每種均包括將本發(fā)明所述分離的核酸或載體轉(zhuǎn)染至一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中，以及使所轉(zhuǎn)染的一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞生長(zhǎng)植物的步驟，其中所述分離的核酸在所述植物中表達(dá)。將所述核酸或載體轉(zhuǎn)染進(jìn)植物細(xì)胞中在本發(fā)明中有時(shí)也稱作用核酸或載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。第四方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其在植物中具有啟動(dòng)子活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO:38所示核苷酸或者SEQ ID NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸序列序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸具有SEQ ID N0:39所示核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:23所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:28所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:30所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:31所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ IDN0:68所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:72所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:73所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:74所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:82所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:83所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:84所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含含有SEQ ID N0:85所示核苷酸序列的植物可操縱的啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了核酸構(gòu)建體，其包含與編碼感興趣的核酸的第二種核酸可操縱地連接的具有啟動(dòng)子活性的核酸。此外，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物，在其基因組中含有所述核酸構(gòu)建體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的方法。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞通過將所述核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞中而產(chǎn)生。轉(zhuǎn)基因植物通過從轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生植物而產(chǎn)生。
第五方面，本發(fā)明提供了在轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)的應(yīng)用和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明描述的具有啟動(dòng)子活性的分離的核酸用于在轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼具有SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的AvrXalO多肽的核酸用于在含有具有本文所述啟動(dòng)子活性的分離的核酸的轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，具有SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的AvrXalO多肽用于在含有具有本文所述啟動(dòng)子活性的分離的核酸轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼AvrXalO多肽的核酸具有SEQ ID NO:57所示核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼AvrXalO多肽的核酸具有GenBank登錄號(hào)U50552所示核苷酸序列。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1D示出基于作圖的XalO基因的克隆。圖1A = XalO基因座的遺傳學(xué)圖和物理圖(physical map)。上部分是使用分子標(biāo)記M491、S723和M419確定的XalO基因座的遺傳學(xué)圖，如先前Gu et al.(2008)所述。44M10是BAC克隆，通過標(biāo)記M491和S723而鑒另O。在下面示出了用于互補(bǔ)檢測(cè)的二元載體PC1300中44M10的亞克隆。垂直線連接M491和XalO基因座的遺傳位置與其在物理圖的位置。產(chǎn)生細(xì)菌枯萎病(BB)抗性植物的亞克隆用“ + ”表示，其它的標(biāo)示為XalO基因的位置用箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向的短粗線表示。圖1B:在用稻黃單胞菌稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv oryzae) (Xoo)菌株接種后兩周野生型和轉(zhuǎn)基因植物的表型。LI，用PX099接種的IR24 ;L2，用PX099 (pHMlavrXalO)接種的 IR24 ;L3，用 PX099 接種的 IRBBIOA ;L4，用 PX099 (pHMlavrXalO)接種的 IRBBIOA ;L5，用PX099 接種的 Nipponbare ;L6，用 PX099 (pHMlavrXalO)接種的 Nipponbare ;L7，用 PX099 接種的XalO轉(zhuǎn)基因品系L198 ;L8，用PX099 (pHMlavrXalO)接種的L198.圖lC:Xal0基因的基因結(jié)構(gòu)。圖中示出了編碼區(qū)(黑色條)，5’和3’UTR的位置(陰影框)，翻譯起始密碼子(ATG)，翻譯終止密碼子(TGA)，5’和3’剪接點(diǎn)(ga和eg)。數(shù)字表示每個(gè)子結(jié)構(gòu)的堿基對(duì)。圖1D:推定的XalO基因的氨基酸序列(SEQ ID N0:37)。推定的信號(hào)肽以下劃線示出。圖2示出在不同的稻栽培種中XalO基因的檢測(cè)。將大約5 μ g的稻基因組DNA用HindIII消化,并用于在每個(gè)泳道中進(jìn)行Southern印跡分析。Southern濾膜用來自XalO編碼區(qū)的探針檢測(cè)，使用引物SPlF和SP1R。M，用HindIII消化的Lambda DNA標(biāo)記。
`
圖3A和3B示出XalO的異位表達(dá)提供了對(duì)相容的稻黃單胞菌稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv oryzae)菌株的增強(qiáng)的抗性。圖3A:用Xoo菌株接種后兩周的IRBB10A 和轉(zhuǎn)基因植物的表型。LI，用 PX099 接種的 IRBB10A ;L2，用 PX099 (pHMlavrXalO)接種的 IRBBIOA ；L3,用 PX099 接種的 Nipponbare ；L4,用 PX099 (pHMlavrXalO)接種的Nipponbare ;L5，用 PX099 接種的轉(zhuǎn)基因品系 L198 ;L6，用 PX099 (pHMlavrXalO)接種的轉(zhuǎn)基因品系L198 ;L7，用PX099接種的轉(zhuǎn)基因品系L162 ;L8，用PX099 (pHMlavrXalO)接種的轉(zhuǎn)基因品系L162。圖3B:在未接種的和接種的植物中XalO的實(shí)時(shí)PCR分析。稻遍在蛋白I基因的表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。結(jié)果以在用PX099 (pHMlavrXalO)接種后(HAI) 12小時(shí)根據(jù)IRBB10A標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)值示出。XalO的引物是IORT F2和IORT R2，稻遍在蛋白I基因的引物是RBQ3和RBQ4。UI，未接種的植物在12HAI用PX099浸潤(rùn)的植物;“ +，，，在12HAI用 PX099 (pHMlavrXalO)浸潤(rùn)的植物。圖4A和4B不出XAlO中跨膜螺旋的預(yù)測(cè)。圖4A:從〃DAS〃 - TransmembranePrediction server (http: //www.sbc.su.se/ miklos/DAS/)預(yù)測(cè) XAlO 中的跨膜區(qū)的輸出。圖 4B:從 TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè) XAlO中的跨膜螺旋的輸出。圖5A和5B示出在XAlO的N末端區(qū)域信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。XAlO的氨基酸序列中的信號(hào)肽的預(yù)測(cè)通過SignalP-NN預(yù)測(cè)(圖5A)和SignalP-HMM預(yù)測(cè)(圖5B)進(jìn)行。信號(hào)肽的裂解位點(diǎn)位于29和30位置之間。將XAlO的全長(zhǎng)氨基酸序列提交給SignalP3.0服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)以預(yù)測(cè)真核細(xì)胞的信號(hào)肽。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和隱蔽Markov模型方法均用于預(yù)測(cè)。選擇標(biāo)準(zhǔn)輸出形式。圖5A和5B中的氨基酸序列由SEQID NO:37的1-70位氨基酸組成。圖6A-6C不出來自稻黃單胞菌稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv oryzae)的AvrXalO對(duì)XalO的特異性誘導(dǎo)。圖6A:在用Xoo菌株P(guān)X099 (pHMlavrXalO)接種后不同小時(shí)(HAI) IRBB10A中XalO的誘導(dǎo)。稻遍在蛋白I基因在葉中的表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。圖6B:在用Xoo菌株P(guān)X099 (pHMlavrXalO)接種后不同HAI測(cè)量的IRBB10A中的XalO轉(zhuǎn)錄物的實(shí)時(shí)PCR分析。遍在蛋白I基因在葉中的表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。結(jié)果以XalO超過稻遍在蛋白I基因表達(dá)的相對(duì) 值表示。XalO的引物是IORT F2和IORT R2，稻遍在蛋白I基因的引物是RBQ3和RBQ4。圖6C:在12HAI時(shí)用表達(dá)AvrXalO或其突變體的Xoo菌株P(guān)X099對(duì)IRBB10A中 XalO 的誘導(dǎo)。UI，未接種的 IRBB10A ;PX099，用 PX099 接種的 IRBB10A ；PX099/AvrXal0,用 PX099 (pHMlavrXalO)接種的 IRBB10A ；PX099/AvrXal0NLS,用 PX099 (pHMlavrXalONLS)接種的 IRBB10A ;PX099/AvrXal0AD，用 PX099 (pHMlavrXalOAD)接種的 IRBB10A。圖7A-7D示出AvrXalO對(duì)XalO的誘導(dǎo)需要稻轉(zhuǎn)錄因子OsTFIIA Y 5。圖7A:在用Xoo菌株P(guān)X099 (pHMlavrXalO)接種后兩周稻的細(xì)菌枯萎病的表型。LI，IRBB5 ；L2, IRBB10A ；L3, IRBB5X IRBB10A 的雙純合體(Xal0Xal0xa5xa5)。圖 7B:在 14 天中用PX099 (pHMlavrXalO)葉修剪(leaf-clipped)接種的 IRBB5、IRBB10A 及雙純合體的葉中的細(xì)菌群。圖7C:1RBB5、IRBB10A及雙純合體中XalO的表達(dá)。進(jìn)行Northern印跡分析的mRNA分離自未接種的植物(在接種后O小時(shí)或0HAI)或者在12HAI (12HAI)分離自用PX099 (pHMlavrXalO)浸潤(rùn)的植物。圖7D:1RBB5、IRBB10A及雙純合體中XalO的轉(zhuǎn)錄水平。轉(zhuǎn)錄水平通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)量?？俁NA分離自未接種的植物(OHAI)或者在12HAI (12HAI)用PX099 (pHMlavrXalO)浸潤(rùn)的植物。稻遍在蛋白I基因的表達(dá)用作內(nèi)部對(duì)照。結(jié)果以XalO超過稻遍在蛋白I基因的表達(dá)的相對(duì)值表示。XalO的引物是IORT F2和IORT R2，稻遍在蛋白I基因的引物是RBQ3和RBQ4。圖8A-8C示出XalO基因的啟動(dòng)子中AvrXalO框候選。圖8A:AvrXalO含有中心串聯(lián)重復(fù)、核定位信號(hào)(NLS)及酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。圖8B:示出在15.5AvrXalO重復(fù)的位置12和13的超變氨基酸。表示這個(gè)重復(fù)中第13位氨基酸缺失。圖8C:XalO啟動(dòng)子(-220至ATG) (SEQ ID N0:41)和AvrXalO框候選的核苷酸序列?；赥AL效應(yīng)子的DNA-革巴特異性模型推測(cè)AvrXalO框候選(框I至框12) (Boch et al., 2009)。在每個(gè)候選中，匹配該模型的核苷酸用大寫字母表示，其它的用小寫字母表示。XalO的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用“+I”表示。5’非翻譯區(qū)(5’UTR)以斜體字示出，XalO的起始密碼子以下劃線示出。在標(biāo)為-220、-215、-177、-139、-110、-72、-36、+1 和 +39 的行中顯示的 XalO 啟動(dòng)子序列(-220至 ATG)是 SEQ ID NO: 41。其余序列如下所示:框 1: SEQ ID NO: 16;框 4: SEQ ID NO: 19 ;框7:SEQ ID NO:22 ;框10:SEQ ID NO:25 ;框2:SEQ ID NO: 17 ;框5:SEQ ID NO:20 ;框8:SEQ IDNO:23 ;框 11:SEQ ID NO:26 ;框3:SEQ ID NO: 18 ;框6:SEQ ID N0:21 ;框9:SEQ ID NO:24 ；及框 12:SEQ ID NO:27。圖9A和9B示出⑶S報(bào)道基因構(gòu)建體。圖9A:⑶S報(bào)道基因構(gòu)建體的示意圖。圖9B:⑶S報(bào)道基因構(gòu)建體中GATEWAY重組位點(diǎn)之間的DNA序列。AvrXalO框候選插入在最小番茄Bs4啟動(dòng)子序列5’末端的“TAL效應(yīng)子框”位置中(pBs4 ;-50至+25) (Boch etal.，2009)，通過GATEWAY重組轉(zhuǎn)移進(jìn)根癌農(nóng)桿菌T-DNA載體pCGWGUSint中，構(gòu)建與無啟動(dòng)子的含有內(nèi)含子的β -葡糖苷酸酶(⑶SPlus)基因的融合體。attBl和attB2，GATEWAY重組位點(diǎn)；無啟動(dòng)子的⑶SPlus-Tnos，⑶SPlus (包括內(nèi)含子)的編碼序列及來自pC1305.1的胭脂堿合成酶(nos)基因的終止子；LB，左邊界；RB，右邊界?！癮ttBl”與“TAL效應(yīng)子-框”之間的上游pENTER/D-TOPO序列是SEQ ID N0:42。“TAL效應(yīng)子-框”與“attB2”之間的序列是 SEQ ID NO:43。圖1OA和IOB示出AvrXalO框的鑒別和鑒定。圖1OA =AvrXalO框及其衍生物。圖1OB =AvrXalO框由AvrXalO的特異性可誘導(dǎo)性。⑶S報(bào)道構(gòu)建體經(jīng)根癌農(nóng)桿菌分別與35S-驅(qū)動(dòng)的avrXalO (+)和空T-DNA載體(-)共輸送進(jìn)煙草(N.benthamiana)葉細(xì)胞(誤差桿顯示SD ；n=3個(gè)樣品)。在pC1305.1中的35S::⑶SPlus (p35S)作為對(duì)照。為定性測(cè)定，葉盤用X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-葡糖苷酸)染色。為定量測(cè)定，⑶S活性用MUG (4-甲基-傘形酮-P-D-葡糖苷酸)作為底物而檢測(cè)。4-MU，4-甲基-傘形酮。序列如下:pXal0-220:SEQ ID NO:39 ;AvrXal0框(框8):SEQ ID NO: 23 ;框80dT:SEQ ID N0:40 ；框 5:SEQ ID N0:20 ;框 11:SEQ ID N0:26 ;框 8dl5:SEQ ID NO:28 ;框 8dl4:SEQ ID NO:30 ；框 8dl3:SEQ ID NO:31 ;框 8dl2:SEQ ID NO:32 ;框 8dll:SEQ ID NO:33.
圖1lA和IlB示出AvrXalO和AvrXa27分別對(duì)AvrXalO框和AvrXa27框的識(shí)別特異性。圖1lA =AvrXalO和AvrXa27的超變氨基酸12和13及其靶DNA0 AvrXalO框(SEQID NO:23)和 AvrXa27 框(Boch et al., 2009 ；Romer et al, 2009a) (SEQ ID NO:44)克隆在最小Bs4啟動(dòng)子之前進(jìn)入含有內(nèi)含子的⑶S(⑶SPlus)報(bào)道載體。圖1lB =AvrXalO和AvrXa27對(duì)AvrXalO框和AvrXa27框的特異性可誘導(dǎo)性。⑶S報(bào)道構(gòu)建體經(jīng)根癌農(nóng)桿菌分別與 35S-驅(qū)動(dòng)的 avrXalO (AvrXalO)、avrXa27 (AvrXa27)和空 T-DNA 載體(-)共輸送進(jìn)煙草葉細(xì)胞(誤差桿顯示SD ；n=3個(gè)樣品)。35S::⑶SPlus作為對(duì)照。為定性測(cè)定，葉盤用X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-葡糖苷酸)染色。為定量測(cè)定，⑶S活性用MUG (4-甲基-傘形酮-P-D-葡糖苷酸)作為底物而檢測(cè)。4-MU，4-甲基-傘形酮。圖12A-12C示出AvrXalO和AvrXa27分別特異性結(jié)合酵母中的AvrXalO框和AvrXa27。圖12A在用于酵母單雜交測(cè)定的選擇性培養(yǎng)基上的酵母生長(zhǎng)。分別使用4個(gè)串聯(lián)拷貝的有義AvrXalO框和AvrXa27框(4*AvrXalO框和4x AvrXa27框)作為誘餌。與SV40NLS-GAL4AD融合的AvrXalO和AvrXa27分別作為獵物。小鼠p53蛋白的GAL4-AD融合體和含有其靶序列的誘餌(P53DBS)作為對(duì)照。50 μ I單個(gè)轉(zhuǎn)化體在SD液體培養(yǎng)基中的系列稀釋液(10_2，10_3，10_4，10_5)加到含有亮氨酸(L)或200ng/ml金擔(dān)子素A (AbA200)的SD培養(yǎng)基上。每個(gè)實(shí)驗(yàn)分析兩個(gè)轉(zhuǎn)化體。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，具有相似結(jié)果。圖12B使用寡核苷酸 PAbAi F2 和 pAbAi R2 驗(yàn)證誘傅質(zhì)粒插入物(AvrXalO 框:1418bp ；AvrXa27 框:1422bp ；p53DBS:1400bp)的酵母菌落PCR。圖12C:使用a -GAL4AD抗體的Western印跡顯示GAL4-AD 融合獵物蛋白質(zhì)。SV40NLS -GAL4AD-HA 與 AvrXalO (135kDa)，AvrXa27 (139kDa)和p53(61kDa)融合。
圖13示出用于電動(dòng)性遷移測(cè)定(electromobility shift assay, EMSA)中的純化的6xHis表位標(biāo)記的AvrXalO和AvrXa27蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度通過Bradford測(cè)定確定。1.5和 3μ g純化的 6xHis::AvrXalO(117.5kDa)、6xHis:: AvrXa27 (121.0kDa)和 BSA 在8%SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，并且用考馬斯亮藍(lán)染色。星號(hào)分別標(biāo)出6xHis::AvrXalO和6xHis::AvrXa27。圖14A-14D示出在電動(dòng)性遷移測(cè)定(EMSA)中，AvrXalO特異性結(jié)合AvrXalO框而不結(jié)合AvrXa27框。圖14A:用于EMSA中的AvrXalO框探針的DNA序列(SEQ ID NO: 34)和AvrXa27框探針的DNA序列(SEQ ID NO:45)。在探針中的AvrXalO框和AvrXa27框是粗體字。圖14B = AvrXalO以高親和性結(jié)合AvrXalO框探針，而AvrXa27以高親和性結(jié)合AvrXalO框探針和AvrXa27框探針兩者。使用AvrXalO或AvrXa27及生物素標(biāo)記的AvrXalO框或AvrXa27框探針的EMSA在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。圖14C:AvrXalO與AvrXalO框探針的結(jié)合可以被未標(biāo)記的(Cold)AvrXalO框探針勝過(out-competed)但不被未標(biāo)記的AvrXa27框探針勝過。生物素標(biāo)記的AvrXalO框探針和不同量的(以fmol表示)未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)探針之間的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。圖14D:AvrXa27與AvrXalO框或AvrXa27框探針的結(jié)合被未標(biāo)記的AvrXa27框探針高度競(jìng)爭(zhēng)勝過。生物素標(biāo)記的AvrXalO框或AvrXa27框探針和不同量的(以fmol表示)未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)探針之間的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。結(jié)合的和游離的探針的位置在左側(cè)示出。圖15A-15C示出在電動(dòng)性遷移測(cè)定(EMSA)中AvrXalO框的缺失突變體的鑒定。圖15A:EMSA中使用的AvrXalO框及其缺失突變體的探針的DNA序列。圖15B:AvrXalO對(duì)AvrXalO框及其缺失突變體的特異性可誘導(dǎo)性。GUS報(bào)道構(gòu)建體經(jīng)根癌農(nóng)桿菌分別與35S-驅(qū)動(dòng)的avrXal0(+)和空T-DNA載體(-)共輸送進(jìn)煙草葉細(xì)胞(誤差桿顯示SD ;n=3個(gè)樣品)。pC1305.1中的35S::⑶SPlus (p35S)作為對(duì) 照。定量⑶S活性用MUG (4-甲基-傘形酮-P-D-葡糖苷酸)作為底物而檢測(cè)。4-MU，4-甲基-傘形酮。圖15C:AvrXalO以高親和性結(jié)合AvrXalO框缺失突變體的一些探針。使用AvrXalO和AvrXalO框或其缺失突變體的生物素標(biāo)記的探針的EMSA在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。大約200ng的AvrXalO被用于EMSA。結(jié)合的(用箭頭(dart)表示)和游離的探針的位置示于左側(cè)。序列如下:AvrXalO框:SEQ ID NO:34 ;框80dT:SEQ ID NO:46 ;框81dA:SEQ ID N0:47 ;框82dT:SEQ IDNO:48 ;框83dA:SEQ ID NO:49 ;框84dT:SEQ ID NO:50 ;框85dA:SEQ ID N0:51 ;框86dC:SEQID N0:52 ;框 87dA:SEQ ID NO: 53 ;框 88dC: SEQ ID NO: 58 ;框 89dA: SEQ ID NO: 59;框810dC:SEQ ID NO:60 ;框811dG:SEQ ID N0:61 ;框 812dT:SEQ ID NO:62 ;框813dT:SEQ IDN0:63 ;框 814dC:SEQ ID NO:64 ;框815dA:SEQ ID NO:65 ;框 816dC:SEQ ID NO:66.
圖16A和16B示出AvrXalO對(duì)AvrXalO框、框7及它們的突變體被識(shí)別特異性。圖16A:EMSA中使用的AvrXalO框、框7及它們的突變體的探針的DNA序列。突變的堿基粗體字表示。圖16B:AvrXalO對(duì)AvrXalO框、框7及它們的突變體的特異性可誘導(dǎo)性。⑶S報(bào)道構(gòu)建體經(jīng)根癌農(nóng)桿菌分別與35S-驅(qū)動(dòng)的avrXal0(+)和空T-DNA載體(-)共輸送進(jìn)煙草葉細(xì)胞(誤差桿顯示SD ；n=3個(gè)樣品)。35S::⑶SPlus作為對(duì)照。為定性測(cè)定，葉盤用X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-葡糖苷酸)染色。定量⑶S活性用MUG (4-甲基-傘形酮-P-D-葡糖苷酸)作為底物而檢測(cè)。4-MU，4-甲基-傘形酮。序列如下=AvrXalO框:SEQID NO: 23 ;框8M1:SEQ ID NO:67;框 7: SEQ ID NO: 22 ^7M:SEQ ID NO:68 ;框 7M1: SEQ IDN0:69 ;框 7M2:SEQ ID NO: 70 ;框 7M3: SEQ ID NO: 71 ;框 7M4: SEQ ID NO: 72 ;框 7M5: SEQ IDNO:73 ;框 7M6: SEQ ID NO:74.
圖17A-17D示出在電動(dòng)性遷移測(cè)定(EMSA)中AvrXalO結(jié)合AvrXalO框、框7及它們的突變體。圖17A:EMSA中使用的AvrXalO框、框7及它們的突變體的探針的DNA序列。圖17B:AvrXalO以高親和性結(jié)合AvrXalO框、框7及它們的突變體的探針。使用AvrXalO和生物素標(biāo)記的AvrXalO框、框7及它們的突變體探針的EMSA在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。圖17C:AvrXalO與AvrXalO框探針的結(jié)合被AvrXalO框、框8M1、框7或框7M的未標(biāo)記的探針競(jìng)爭(zhēng)勝出。AvrXalO框和不同量的(以fmol表示)未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)探針之間的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。圖17D:AvrXalO與框8M1、框7或框7M的探針的結(jié)合被未標(biāo)記的AvrXalO框探針競(jìng)爭(zhēng)勝出。框8M1，框7或框7M和不同量的(以fmol表示)未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)探針之間的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。結(jié)合的和游離的探針的位置在左側(cè)示出。序列如下:AvrXalO框:SEQ ID NO:34 ;框8M1:SEQ IDN0:75;框 7:SEQ ID NO:76 ;框 7M:SEQ ID NO:77.
圖18A-18C示出在酵母中AvrXalO結(jié)合框7、AvrXalO框及它們的突變體。圖18A:用于酵母單雜交測(cè)定的選擇性培養(yǎng)基上的酵母生長(zhǎng)。使用4個(gè)串聯(lián)拷貝的有義框7、AvrXalO框或者它們的突變體(4x框7，4x框7M，4x AvrXalO框和4x框8M1)作為誘餌。與SV40NLS-GAL4AD融合的AvrXalO作為獵物。小鼠p53蛋白的GAL4-AD融合體和含有其靶序列的誘餌(P53DBS)作為對(duì)照。50 μ I單個(gè)轉(zhuǎn)化體在SD液體培養(yǎng)基中的系列稀釋液( ο-2, 1(Γ3，1(Γ4，1(Γ5)加到含有亮氨酸(+L)或 200ng/ml 金擔(dān)子素 A (aureobasidin A)(+AbA200)的SD培養(yǎng)基上。每個(gè)實(shí)驗(yàn)分析兩個(gè)轉(zhuǎn)化體。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，具有相似結(jié)果。圖18B:使用引物pAbAi F2和pAbAi R2驗(yàn)證誘餌質(zhì)粒插入物(框7:1418bp ;框7M: 1418bp ；AvrXalO 框:1418bp ；框 8M1:1422bp ；p53DBS: 1400bp)的酵母菌落 PCR。圖 18C:使用抗GAL4AD抗體的Western印跡顯示GAL4-AD融合獵物蛋白質(zhì)。SV40NLS-GAL4AD-HA與AvrXalO (135kDa)和 p53(61kDa)融合。發(fā)明詳述 本發(fā)明一般性地涉及植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)及賦予植物細(xì)菌性疾病抗性的核酸和方法。本發(fā)明還涉及可用于控制在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的啟動(dòng)子和啟動(dòng)子序列。根據(jù)本發(fā)明，描述了編碼抗性基因XalO的基因的克隆和鑒定，其賦予對(duì)細(xì)菌枯萎病的抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗性是針對(duì)由黃單胞菌導(dǎo)致的細(xì)菌枯萎病(blight disease)。在另一實(shí)施方案中，所述植物是稻。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述植物是大麥、燕麥、小麥、玉米、甘藍(lán)、花椰菜、馬鈴薯、番茄、胡椒、大豆或油菜籽。黃單胞菌(Xanthomonas spp)的轉(zhuǎn)錄激活物樣(TAL) III型效應(yīng)子通過祀向宿主基因啟動(dòng)子及激活宿主基因 表達(dá)而導(dǎo)致發(fā)病。根據(jù)本發(fā)明，描述了稻細(xì)菌枯萎病抗性基因XalO的分離及XalO與來自稻黃單胞菌稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv oryzae) (Xoo)的TAL III型效應(yīng)子AvrXalO之間分子識(shí)別的鑒定。如本發(fā)明所描述，XalO基因是通過定位克隆策略和遺傳轉(zhuǎn)化分離自含有XalO的稻品系。所述XalO基因編碼未知的跨膜蛋白。XalO被攜帶AvrXalO基因的Xoo菌株特異性誘導(dǎo)。AvrXalO中核定位信號(hào)(NLS)基序的突變或者在其C-末端區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)的缺失消除了其激活XalO的功能。XalO表達(dá)由AvrXalO的激活需要稻轉(zhuǎn)錄因子OsTFIIA Y 5。通過候選方法在XalO啟動(dòng)子中鑒別了 17_bp 的 AvrXalO 框。在瞬時(shí)測(cè)定中所述 AvrXalO 框在煙草(Nicotiana benthamiana)中由AvrXalO特異性識(shí)別，這種識(shí)別激活報(bào)道基因表達(dá)。AvrXalO框與AvrXalO之間的特異性相互作用在酵母中通過酵母單雜交測(cè)定及在體外通過電動(dòng)性遷移測(cè)定(EMSA)證實(shí)。在0-11位的任一核苷酸的缺失均削弱AvrXalO活性。AvrXalO框中前四個(gè)核苷酸(TATA)的任一個(gè)缺失在EMSA中也消除AvrXalO與突變探針的結(jié)合，表明AvrXalO框中前四個(gè)核苷酸是AvrXalO與XalO啟動(dòng)子結(jié)合所必需的。位置13-17的任一核苷酸的缺失在EMSA中不影響AvrxalO框活性,也不影響AvrXalO與突變探針的結(jié)合。在AvrXalO框中位置13-17的后四個(gè)核苷酸的缺失也不顯著影響AvrXalO框的通過AvrXalO誘導(dǎo)報(bào)道基因的活性。在AvrXalO框中位置9-11的核苷酸“CAC”是通過AvrXalO激活轉(zhuǎn)錄必需的?！癈AC”突變?yōu)椤癟CA”完全消除了 AvrXalO活性，而框7中“TCA”改變?yōu)椤癈AC”增加了突變的框7 (框7M)的AvrXalO活性。這些結(jié)果表明AvrXalO框可具有兩個(gè)功能中心:前四個(gè)核苷酸(TATA)作為AvrXalO結(jié)合中心，轉(zhuǎn)錄激活中心在位置9_11 (CAC)。XalO與AvrXalO以及經(jīng)鑒別由TAL III型效應(yīng)子靶向的其他宿主基因之間的分子相互作用的鑒別使得可以對(duì)由黃單胞菌(Xanthomonas spp)導(dǎo)致的細(xì)菌疾病的廣譜和長(zhǎng)期抗性工程化。如本文所用，術(shù)語“植物細(xì)胞”是指涵蓋衍生自植物包括未分化的組織如愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物以及植物種子、花粉或植物胚的任何細(xì)胞。適合轉(zhuǎn)化的植物組織包括葉組織，根組織，分裂組織，原生質(zhì)體，胚軸，子葉，盾片，苗端，根，不成熟胚，花粉和花藥。本發(fā)明描述了可用于轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞的方法的非限制性實(shí)例?？捎糜诒景l(fā)明的植物例如包括稻、大麥、燕麥、小麥、玉米、甘藍(lán)、花椰菜、馬鈴薯、番茄、胡椒、辣椒、大豆、油菜籽及對(duì)黃單胞菌易感的任何其他植物。如果一單核苷酸或核酸在其天然狀態(tài)或當(dāng)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法處理時(shí)可以被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生mRNA和/或多肽或其片段時(shí)，稱其“編碼”該多肽。 “分離的”或“基本純的”核酸(例如RNA，DNA或者混合的聚合物)或者多肽是與天然伴隨天然人序列或蛋白 質(zhì)的其他細(xì)胞成分基本分離的核酸或多肽，如核糖體，聚合酶，許多其他人基因組序列和蛋白質(zhì)。該術(shù)語包含已經(jīng)從其天然發(fā)生環(huán)境中去除的核酸序列或蛋白質(zhì)，及包括重組或克隆的DNA分離物及化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。本發(fā)明的多核苷酸組合物包括RNA、cDNA、基因組DNA、合成形式，及可以被化學(xué)或生物化學(xué)修飾，或者可含有非天然的或衍生的核苷酸堿基，這些易于為本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到。這種修飾包括例如標(biāo)記，甲基化，用類似物取代一或多個(gè)天然發(fā)生的核苷酸，核苷酸間修飾如不帶電鍵合(例如甲基磷酸酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯等)，帶電荷的鍵合(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，懸垂部分(pendent moieties)(例如多肽)，嵌入劑(例如吖啶，補(bǔ)骨脂素等)，螯合劑，烷化劑，及修飾的鍵合(例如α端基異構(gòu)體核酸等)。也包括模擬多核苷酸通過氫鍵及其他化學(xué)相互作用結(jié)合指定序列的合成分子。這種分子為本領(lǐng)域已知，包括例如其中肽鍵取代分子主鏈中磷酸鍵的那些分子。本發(fā)明的多核苷酸可以是分離的或基本純的。本發(fā)明提供了重組核酸。所述重組構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中能自主復(fù)制。或者，所述重組構(gòu)建體可以整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體DNA中。這種重組多核苷酸包含基因組、cDNA、半合成或合成來源的多核苷酸，通過其來源或操作，其I)與其天然相關(guān)的全部或部分多核苷酸不相關(guān)；2)與除了與其天然連接的多核苷酸之外的多核苷酸連接；或者3)不天然發(fā)生。因此，本發(fā)明提供了包含不是天然發(fā)生的序列的重組核酸。盡管可以使用描述的序列，但其通常如通過缺失、取代或插入而改變。本發(fā)明提供了本發(fā)明所述野生型和突變多肽或其片段的“蛋白質(zhì)修飾或片段”，其與一級(jí)結(jié)構(gòu)序列實(shí)質(zhì)上同源，但是包括例如體內(nèi)或體外化學(xué)或生物化學(xué)修飾，或者摻入非尋常氨基酸。這種修飾包括例如乙?；?羧化,磷酸化,糖基化,遍在蛋白化,標(biāo)記如用放射性核素標(biāo)記，以及各種酶修飾，這些為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。可用于這種目的的標(biāo)記多肽的各種方法及各種取代基或標(biāo)記為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，包括放射性同位素，如P，結(jié)合標(biāo)記的抗配體(如抗體)的配體，熒光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光劑，酶，及可作為標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合配對(duì)成員的抗配體。標(biāo)記的選擇依賴于要求的敏感性，與引物綴合的方便性，穩(wěn)定性需求，以及可利用的儀器設(shè)備。除了基本全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)之外，本發(fā)明提供了多肽的生物活性片段。顯著的生物活性包括蛋白質(zhì)的配體結(jié)合，免疫活性及其他生物活性特征。如本文所用，術(shù)語“多肽”是指全長(zhǎng)蛋白質(zhì)及作為多肽片段的蛋白質(zhì)的一部分。多肽“片段”、“部分”或“節(jié)段”是至少大約5-7個(gè)連續(xù)氨基酸的一段氨基酸殘基序列，通常是至少大約7-9個(gè)連續(xù)氨基酸，典型為至少大約9-13個(gè)連續(xù)氨基酸,最優(yōu)選至少大約20-30個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供了融合多肽，其包含本發(fā)明所述多肽及其片段以及本領(lǐng)域已知的其他蛋白質(zhì)的多肽或片段。同源多肽可以是兩或多個(gè)多肽序列之間或者本發(fā)明所述序列與相關(guān)蛋白質(zhì)之間的融合。同樣，異源融合可以是這樣構(gòu)建的，其呈現(xiàn)出衍生的蛋白質(zhì)的性質(zhì)或活性的組合。例如，配體結(jié)合或其他結(jié)構(gòu)域在不同的新融合多肽或片段之間可以“交換”。這種同源或異源融合多肽可以展示例如改變的結(jié)合強(qiáng)度或特異性，及可包括例如配對(duì)體如免疫球蛋白、細(xì)菌β_半乳糖苷酶，trpE，蛋白質(zhì)Α，β-內(nèi)酰胺酶，α淀粉酶，醇脫氫酶及酵母α交配因子。融合蛋白典型是通過如下文所述重組核酸方法產(chǎn)生，或者可化學(xué)合成。合成多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。

其它蛋白質(zhì)修飾包括氨基酸取代。取代變體典型含有在蛋白質(zhì)內(nèi)的一或多個(gè)位點(diǎn)一個(gè)氨基酸置換為另一個(gè)氨基酸，及可以設(shè)計(jì)為調(diào)節(jié)所述多肽的一或多種性質(zhì)，如針對(duì)蛋白酶解的穩(wěn)定性，不喪失其它功能或性質(zhì)。氨基酸取代可以基于涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性性質(zhì)的相似性進(jìn)行。優(yōu)選地取代是保守的，即一個(gè)氨基酸由相似形狀和電荷的氨基酸置換。保守取代為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，典型包括但不限于在如下基團(tuán)內(nèi)的取代:甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；及酪氨酸，苯丙氨酸。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以被取代為其他氨基酸，而不顯著喪失與如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上結(jié)合位點(diǎn)或者與多肽相互作用的蛋白質(zhì)上結(jié)合位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力。因?yàn)檫@是定義蛋白質(zhì)生物功能活性的蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)，因此某些氨基酸取代可以在蛋白質(zhì)序列及其潛在的DNA編碼序列中進(jìn)行，仍然獲得具有同樣性質(zhì)的蛋白質(zhì)。在產(chǎn)生這種改變中，可以考慮氨基酸的親水(hydropathic)指數(shù)。疏水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)的相互作用生物功能中的重要性通常為本領(lǐng)域已知。或者，氨基酸取代可以基于親水性而有效進(jìn)行。親水性在賦予蛋白質(zhì)的相互作用生物功能中的重要性通常為本領(lǐng)域已知(見例如美國(guó)專利4，554，101)。疏水性指數(shù)或者親水性在設(shè)計(jì)多肽中的應(yīng)用在美國(guó)專利5，691，198中進(jìn)一步論述?！爸亟M核酸”是非天然發(fā)生的核酸，或者是通過人工組合序列的兩個(gè)其它分離的節(jié)段而產(chǎn)生。這種人工組合通常通過化學(xué)合成方式實(shí)現(xiàn)，或者通過人工操縱核酸的分離的節(jié)段實(shí)現(xiàn)，例如通過遺傳工程技術(shù)進(jìn)行。這個(gè)短語也涵蓋從其正常調(diào)節(jié)表達(dá)限制中除去的基因，在這種情況中及基因產(chǎn)物由于存在所述基因的多個(gè)拷貝或者正調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子信號(hào)而過表達(dá)，增加的mRNA或蛋白質(zhì)半衰期等。本發(fā)明的大量單核苷酸可以由用編碼本發(fā)明的突變的或藝術(shù)性蛋白質(zhì)的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞產(chǎn)生。編碼所述肽或希望的片段的天然或合成的單核苷酸片段可以摻入能導(dǎo)入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中及在其中復(fù)制的重組多核苷酸構(gòu)建體(載體)中，通常為DNA構(gòu)建體。通常地，所述載體適于在單細(xì)胞宿主如酵母或細(xì)菌中復(fù)制，但是也可用于導(dǎo)入(整合或不整合在基因組內(nèi))培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物或植物或其它真核細(xì)胞系中。最常用的原核宿主是大腸桿菌，但是也可以使用其它原核生物如枯草桿菌或假單胞菌屬。哺乳動(dòng)物或其它真核宿主細(xì)胞，如酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲或兩棲動(dòng)物或禽類動(dòng)物，也可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。正如相關(guān)領(lǐng)域所熟知，調(diào)節(jié)多核苷酸表達(dá)可以導(dǎo)致由所述多核苷酸編碼的多肽的調(diào)節(jié)。載體，如克隆和表達(dá)載體，包括合適的啟動(dòng)子及在選擇的宿主中起作用的其它必需的載體序列，如本文所述那些序列。適當(dāng)?shù)乜砂ㄅc本發(fā)明描述的核酸和蛋白質(zhì)表達(dá)天然關(guān)聯(lián)的那些序列，及可包括與所述核酸可操縱地連接的可選的或其它的調(diào)節(jié)序列，以控制該核酸的表達(dá)，這些為本領(lǐng)域熟知。許多可用的載體為本領(lǐng)域已知，可得自商家?！翱刹倏v地連接”是指并置，其中所述成分處于使其以指定方式起作用的關(guān)系。例如，啟動(dòng)子如果影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則該啟動(dòng)子與所述編碼序列式可操縱地連接的。所述載體也可包含選擇標(biāo)記基因，如本發(fā)明所述。第一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其編碼:(i)具有SEQ ID NO: 37所示氨基酸序列的XalO多肽，或者(ii)與所述XalO多肽具有至少50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽當(dāng)轉(zhuǎn)染進(jìn)植物中時(shí)提供黃單胞菌抗性植物。如本發(fā)明所述，所述XalO多肽提供了表達(dá)這種蛋白質(zhì)的對(duì)黃單胞菌具有抗性的植物。在一個(gè)實(shí)施方案`中，(ii)的多肽具有至少60%相同性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，( )的多肽具有至少70%相同性。在再一個(gè)實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少80%相同性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少90%相同性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少95%相同性。在再一個(gè)實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少98%相同性。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，(ii)的多肽具有至少99%相同性。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼XalO多肽的核酸具有SEQ ID NO:35所示核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼XalO多肽的核酸具有SEQ ID NO: 36所示核苷酸序列。在再一個(gè)實(shí)施方案中，編碼XalO多肽的核酸具有SEQ ID NO: 36的第54-437位核苷酸所示核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，編碼XalO多肽的核酸具有SEQ ID NO: 35的第2423-3234位核苷酸所示核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼⑴或(ii)的多肽的分離的核酸可以與編碼異源多肽的核酸可操縱地連接。異源多肽可包括R基因的蛋白質(zhì)或者來自稻或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它植物的防御基因的蛋白質(zhì)。非限制性實(shí)例可包括稻細(xì)菌枯萎病R蛋白質(zhì)Xal，Xa2，Xa5，Xal3，Xa21，Xa26，Xa27，或者防御蛋白質(zhì)如來自稻的PR1。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述XalO多肽。此外，本發(fā)明提供了包含所述分離的核酸的植物細(xì)胞及包含所述植物細(xì)胞的黃單胞菌抗性轉(zhuǎn)基因植物。第二方面，本發(fā)明提供了包含分離的核酸的載體，所述核酸編碼(i)具有SEQ IDNO: 37所示氨基酸序列的XalO多肽，或者(ii)與所述XalO多肽具有至少50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽當(dāng)轉(zhuǎn)染進(jìn)本發(fā)明所述植物中時(shí)提供黃單胞菌抗性植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體進(jìn)一步包含與所述分離的核酸可操縱地連接的植物啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子選自組織特異性啟動(dòng)子，組成性啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是XalO啟動(dòng)子或者衍生自XalO啟動(dòng)子或者含有XalO啟動(dòng)子的一部分，包括本發(fā)明描述的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體也可以包含如本發(fā)明所述其它調(diào)節(jié)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本發(fā)明所述，編碼(i)或(ii)的多肽的分離的核酸可以與編碼異源多肽的核酸可操縱地連接。許多啟動(dòng)子均可用于實(shí)施本發(fā)明。所述啟動(dòng)子是基于希望的結(jié)果選擇的。也就是說，所述核酸可以與組成型、組織優(yōu)選的或者其它啟動(dòng)子組合以在感興趣的宿主細(xì)胞中表達(dá)。這種組成性啟動(dòng)子包括例如Rsyn7的核心啟動(dòng)子(W099/48338和美國(guó)專利N0.6，072，050)，核心 CaMV35S 啟動(dòng)子(Odell et al.，1985)，稻肌動(dòng)蛋白(McElroy etal., 1990),遍在蛋白(Christensen and Quail, 1989and Christensen et al., 1992),pEMU (Last et al.，1991)，MAS (Velten et al.，1984)，ALS 啟動(dòng)子(美國(guó)專利N0.5, 659, 026)等。其它 組成性啟動(dòng)子包括例如在美國(guó)專利N0.5，608，149,5,608, 144、5，604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680,5, 268，463 和 5，608，142 中揭示的那些。其它啟動(dòng)子包括可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，特別是來自病原體的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子包括來自發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)(PR蛋白質(zhì))的那些啟動(dòng)子，其在病原體感染后被誘導(dǎo)，例如PR蛋白，SAR蛋白，β-1，3-葡聚糖酶，殼多糖酶等。其它啟動(dòng)子包括在病原體感染部位局部或附近表達(dá)的那些啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子可以是傷口可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方案中，化合物調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子可用于在植物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通過應(yīng)用外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行。所述啟動(dòng)子可以是化學(xué)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中化合物的應(yīng)用誘導(dǎo)基因表達(dá)，或者所述啟動(dòng)子可以是化合物可抑制的啟動(dòng)子，其中化合物的應(yīng)用抑制基因表達(dá)。此夕卜，組織優(yōu)選的啟動(dòng)子可用于在特定植物組織內(nèi)靶向增強(qiáng)感興趣的單核苷酸的表達(dá)。每一個(gè)這些啟動(dòng)子均在美國(guó)專利N0.6，506，962,6, 575，814,6, 972，349和7，301，069及在美國(guó)專利申請(qǐng)出版物N0.2007/0061917和2007/0143880中描述。在再一個(gè)的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自具有SEQ ID NO:38所示核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子，具有SEQ ID NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子及具有SEQ ID Ν0:39所示核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自含有具有SEQ ID NO: 23所示核苷酸序列的AvrXalO框的啟動(dòng)子，及含有AvrXalO框衍生物的啟動(dòng)子，其中所述AvrXalO框的衍生物選自如下衍生物:具有SEQ ID NO: 26所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 28所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 30所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 31所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 72所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 73所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 74所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 82所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 83所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列的衍生物，及具有SEQ ID N0:85所示核苷酸序列的衍生物。本發(fā)明還提供了包含所述載體的植物細(xì)胞及包含所述植物細(xì)胞的黃單胞菌抗性轉(zhuǎn)基因植物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸被穩(wěn)定整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的基因組中。第三方面，本發(fā)明提供了如下方法:(i)使植物對(duì)黃單胞菌有抗性的方法，(b)增強(qiáng)植物對(duì)黃單胞菌抗性的方法，及(C)賦予植物黃單胞菌疾病抗性的方法。每一種這些方法均包括將本發(fā)明所述分離的核酸或載體轉(zhuǎn)染至一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中，并使所轉(zhuǎn)染的一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞生長(zhǎng)為植物，由此所述分離的核酸在該植物中表達(dá)。將核酸或載體轉(zhuǎn)染進(jìn)植物細(xì)胞中在本發(fā)明中有時(shí)也稱作用所述核酸或載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸被穩(wěn)定整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的基因組中。第四方面，本發(fā)明提供了在植物中具有啟動(dòng)子活性的分離的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO:38所示核苷酸序列或者SEQ ID NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述核酸具有SEQ ID N0:39所示核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:23所示核苷酸序列。對(duì)于這個(gè)實(shí)施方案及如下實(shí)施方案合適的植物可操縱的啟動(dòng)子包括本發(fā)明所述那些啟動(dòng)子，及為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那些啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:26所示核苷酸序列。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:28所示核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:30所示核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:31所示核苷酸序列。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:68所示核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:72所示核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID NO:73所示核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQID N0:74所示核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:82所示核苷酸序列。 在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:83所示核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:84所示核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，所述核酸包含植物可操縱的啟動(dòng)子，其含有SEQ ID N0:85所示核苷酸序列。本發(fā)明還提供了核酸構(gòu)建體，其包含含有啟動(dòng)子活性的與編碼感興趣的核酸的第二個(gè)核酸可操縱地連接的核酸。此夕卜，本發(fā)明提供了在其基因組中含有核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是通過將所述核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)植物細(xì)胞中而產(chǎn)生的。所述轉(zhuǎn)基因植物是通過從轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞再生植物而產(chǎn)生的。本發(fā)明的啟動(dòng)子可特別用于制備轉(zhuǎn)基因植物，包括本發(fā)明描述的那些，以含有感興趣的核酸或DNA。插入植物中的核酸或DNA (感興趣的核酸或DNA)對(duì)于轉(zhuǎn)化過程不是關(guān)鍵的。通常地，導(dǎo)入植物中的DNA是構(gòu)建體的一部分。所述DNA可以是感興趣的基因，例如蛋白質(zhì)編碼序列，或者其可以是能調(diào)節(jié)基因表達(dá)的序列，如反義序列，有義阻抑序列，轉(zhuǎn)錄后基因沉默序列(RNAi序列如siRNA, shRNA或dsRNA)或者micro-RNA (miRNA)序列。所述構(gòu)建體典型包括調(diào)節(jié)區(qū)，其與感興趣的DNA的5’側(cè)和/或感興趣的DNA的3’側(cè)可操縱地連接。含有所有這些元件的盒(cassette)在本發(fā)明也稱作表達(dá)盒。所述表達(dá)盒可在表達(dá)盒構(gòu)建體另外含有5’前導(dǎo)序列。所述調(diào)節(jié)區(qū)(即啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或編碼信號(hào)錨的多核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞或者彼此可以是天然/類似(analogous)的。在此鑒別的啟動(dòng)子可特別用于制備轉(zhuǎn)化本發(fā)明所述植物物種的構(gòu)建體。或者，所述調(diào)節(jié)區(qū)和/或編碼信號(hào)錨的單核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞或者彼此是異源的異源的。見美國(guó)專利N0.7，205，453和美國(guó)專利申請(qǐng)出版物N0.2006/0218670,2006/0248616和20090100536及其中列舉的參考文獻(xiàn)所述。所述表達(dá)盒在表達(dá)盒構(gòu)建體中可另外含有5’前導(dǎo)序列。這種前導(dǎo)序列可增強(qiáng)翻譯。翻譯前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知，及包括在國(guó)際出版物N0.W02008/094127及其中列舉的參考文獻(xiàn)中描述的那些序列。在如本發(fā)明所述的啟動(dòng)子控制下的感興趣的DNA可以是如本發(fā)明所述任何DNA，及可用于改變其被導(dǎo)入之中的植物物種的任何特性或性狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，感興趣的DNA被導(dǎo)入植物中以增強(qiáng)植物的性狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增強(qiáng)的農(nóng)藝學(xué)性狀可以通過增強(qiáng)的植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生長(zhǎng)和發(fā)育、產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)增加、疾病或病蟲害抗性、或者環(huán)境或化學(xué)耐受性而鑒定。在一些方面中，增強(qiáng)的性狀選自增強(qiáng)的水使用效力，增強(qiáng)的溫度耐受性，增加的產(chǎn)量，增強(qiáng)的氮使用效力，增加的種子蛋白質(zhì)，增加的種子油及增加的生物量。增加的產(chǎn)量可包括在非應(yīng)激(non-stress condition)條件下增加的產(chǎn)量,及在環(huán)境應(yīng)激條件下增加的產(chǎn)量。應(yīng)激條件可包括例如干旱，陰暗(shade)，真菌性疾病，病毒性疾病，細(xì)菌性疾病，昆蟲蟲害，線蟲蟲害，極端溫度暴露(冷或熱)，滲透性應(yīng)激，降低的氮養(yǎng)分有效性，降低的磷養(yǎng)分有效性，以及高植物密度。在一些實(shí)施方案中，感興趣的DNA可用于修飾代謝途徑，如種子中脂肪酸生物合成或者脂質(zhì)生物合成途徑，或者在植物物種中修飾病原體抗性，特別是黃單胞菌抗性。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以由本發(fā)明所述AvrXalO蛋白或者編碼這個(gè)蛋白質(zhì)的核酸誘導(dǎo)或激活。通常，所述表達(dá)盒可另外包含選擇標(biāo)記基因以選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇標(biāo)記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。通常地，植物選擇標(biāo)記基因編碼抗生素抗性，及合適的基因包括至少一系列的編碼抗生素奇霉素抗性的基因，編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPt)基因，編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptll)基因，編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt或aphiv)基因，乙酰乳酸合酶(als)基因?；蛘?，植物選擇標(biāo)記基因編碼除草劑抗性，如磺脲型除草劑、草銨膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、銨、溴苯腈(bromoxynil)、咪唑啉酮類和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D)抗性,包括編碼除草劑抗性的基因，其作用是抑制谷氨酰胺合酶如草丁膦(phosphinothricin)或Basta的作用(如bar基因)。通常見國(guó)際出版物N0.W002/36782，美國(guó)專利N0.7，205，453及美國(guó)專利申請(qǐng)出版物 N0.2006/0218670,2006/0248616,2007/0143880 和 20090100536 及其中列舉的參考文獻(xiàn)所述。列舉的選擇標(biāo)記基因不是限制性的?？梢允褂萌魏芜x擇標(biāo)記基因。所述選擇標(biāo)記基因也在載轉(zhuǎn)化的植物物種中可操縱的啟動(dòng)子控制下。這種啟動(dòng)子包括在國(guó)際出版物N0.W02008/094127及其中列舉的參考文獻(xiàn)中描述的那些啟動(dòng)子。在適當(dāng)情況中，感興趣的 DNA可以被優(yōu)化以增加在轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)。即所述編碼序列可以使用植物優(yōu)選的密碼子合成以改良表達(dá)。本領(lǐng)域可獲得合成植物優(yōu)選的基因的方法。見例如美國(guó)專利N0.5，380，831,5, 436，391和7，205，453及美國(guó)專利申請(qǐng)出版物N0.2006/0218670 和 2006/0248616。
在制備表達(dá)盒中，可以處理多種DNA片段，以正確方向及在適當(dāng)情況中以正確讀框提供DNA序列。為此，可以使用適體或接頭以連接DNA片段，或者可包括其它操作以提供便利的限制位點(diǎn)，除去過多的DNA，除去限制位點(diǎn)等。為此目的，可以包括體外誘變，引物修復(fù)，限制，退火，再取代，例如轉(zhuǎn)換和顛換。一旦核酸已經(jīng)克隆進(jìn)表達(dá)載體中，可以使用常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入植物細(xì)胞中。術(shù)語“植物細(xì)胞”是指涵蓋衍生自植物包括未分化的組織如愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物以及植物種子、花粉或植物胚的任何細(xì)胞。適于轉(zhuǎn)化的植物組織包括葉組織，根組織，分裂組織，原生質(zhì)體，胚軸，子葉，盾片，苗端，根，未成熟的胚，花粉及花藥。“轉(zhuǎn)化”是指通過外部應(yīng)用來自不同基因型的另一細(xì)胞的重組DNA直接修飾細(xì)胞基因組，使其吸收劑整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組中。以此方式，可獲得遺傳修飾的植物、植物細(xì)胞、植物組織、種子等。含有本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化任何植物，包括本發(fā)明所述那些植物。所述構(gòu)建體可以通過各種常規(guī)技術(shù)導(dǎo)入希望的植物宿主的基因組中。轉(zhuǎn)化多種高等植物物種的技術(shù)為本領(lǐng)域熟知并在技術(shù)和學(xué)術(shù)文獻(xiàn)中描述。轉(zhuǎn)化方案可根據(jù)靶向轉(zhuǎn)換的植物或植物細(xì)胞的類型而不同，即單子葉或雙子葉植物，這些為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如，所述DNA構(gòu)建體可以直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組DNA中，使用如植物細(xì)胞原生質(zhì)體的電穿孔和顯微注射等技術(shù)進(jìn)行，或者所述DNA構(gòu)建體可以直接導(dǎo)入植物組織中，使用沖擊(ballistic)方法進(jìn)行，如DNA微粒轟擊。或者，所述DNA構(gòu)建體可以組合合適的T - DNA側(cè)翼區(qū)，及導(dǎo)入常規(guī)的根癌農(nóng)桿菌宿主載體中。當(dāng)植物細(xì)胞被根癌農(nóng)桿菌感染時(shí)，根癌農(nóng)桿菌宿主的毒力功能將指導(dǎo)所述構(gòu)建體和相鄰標(biāo)記插入該植物細(xì)胞DNA中。因此，可以使用提供有效轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的任何方法。見例如美國(guó)專利N0.7，241，937,7, 273，966和7，291，765及美國(guó)專利申請(qǐng)出版物N0.2007/0231905和2008/0010704及其中列舉的參考文獻(xiàn)所述。也見國(guó)際公開申請(qǐng)N0.W02005/103271和W02008/094127及其中的參考文獻(xiàn)所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，外植體組織可以與攜帶含有感興趣的基因或核酸的DNA構(gòu)建體的農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)，使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的組織可以使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)選擇。在另一實(shí)施方案中，胚性液體懸浮培養(yǎng)物可以與攜帶含有感興趣的基因或核酸的DNA構(gòu)建體的農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)，使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的組織可以使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)選擇。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述DNA可以通過使用常規(guī)技術(shù)如微粒轟擊技術(shù)導(dǎo)入外植體組織或胚性液體懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化的組織可以使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)選擇。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因的植物可以使用本領(lǐng)域熟知的方法再生?？梢耘囵B(yǎng)通過上述任何轉(zhuǎn)化技術(shù)衍生的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以再生具有轉(zhuǎn)化的基因型及因此希望的表型的整個(gè)植物，如轉(zhuǎn)基因植物。“轉(zhuǎn)基因植物”是其中導(dǎo)入外來DNA的植物。“轉(zhuǎn)基因植物”涵蓋所有后代、雜種及其雜交體，無論是有性還是無性繁殖的，其繼續(xù)攜帶所述外來DNA。再生技術(shù)依賴于在組織培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中某些植物激素的處理，典型依賴于已經(jīng)與希望的核苷酸序列一起導(dǎo)入的生物殺滅劑(biocide)和/或除草劑標(biāo)記。見例如國(guó)際公開的申請(qǐng)N0.W02008/094127及其中列舉的參考文獻(xiàn)。如下轉(zhuǎn)化 方法典型用于產(chǎn)生其中穩(wěn)定摻入所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因品種。在所述表達(dá)盒穩(wěn)定摻入轉(zhuǎn)基因植物中后，可以通過有性雜交將其轉(zhuǎn)移至其它植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因品種可以與另一(非轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)化的)品種雜交，以產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)基因品種?；蛘撸ㄟ^使用前述轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)工程化進(jìn)特定棉花品系中的遺傳性狀可以通過使用植物育種領(lǐng)域熟知的傳統(tǒng)回交技術(shù)移至另一品系中。例如，回交方法可用于將工程化的性狀從公開的非良種(non-elite variety)中移至良種(elite variety)中，或者從其基因組中含有外來基因的品種中移至不含有該基因的品種中。如本發(fā)明所用，“雜交”可以根據(jù)情況是指簡(jiǎn)單的X與Y雜交，或者回交。根據(jù)雜交的物種，可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)栽培技術(shù)。一旦產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，可以根據(jù)常規(guī)方法栽培所述植物自身。當(dāng)然，可以從所述轉(zhuǎn)基因植物中收獲轉(zhuǎn)基因種子。然后將這些種子種植在土壤中，使用常規(guī)方法栽培以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。第五方面，本發(fā)明提供了在轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)的應(yīng)用和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的具有啟動(dòng)子活性的分離的核酸用于在轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，編碼具有SEQ ID NO: 54所示氨基酸序列的AvrXalO多肽的核酸用于在含有本發(fā)明所述具有啟動(dòng)子活性的分離的核酸的轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，具有SEQ ID N0:54所示氨基酸序列的AvrXalO多肽用于在含有本發(fā)明所述具有啟動(dòng)子活性的分離的核酸的轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼AvrXalO多肽的核酸具有SEQ ID NO:57所示核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼AvrXalO多肽的核酸具有GenBank登錄號(hào)U50552所示核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生具有本發(fā)明的啟動(dòng)子及具有編碼AvrXalO多肽的核酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是通過將含有所述啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中而產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，與本發(fā)明所述啟動(dòng)子可操縱地連接的編碼AvrXalO多肽的核酸也被轉(zhuǎn)染進(jìn)一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中。所述轉(zhuǎn)基因植物是通過從轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞中再生植物而產(chǎn)生的。在第二個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物，其含有具有在植物細(xì)胞中的啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體，及產(chǎn)生第二個(gè)轉(zhuǎn)基因植物，其含有編碼AvrXalO多肽的與啟動(dòng)子可操縱地連接的核酸。然后使第一個(gè)和第二個(gè)轉(zhuǎn)基因植物雜交產(chǎn)生既含有具有啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體也含有編碼AvrXalO多肽的與啟動(dòng)子可操縱連接的核酸的轉(zhuǎn)基因植物。
除非特別指出，實(shí)施本發(fā)明使用常規(guī)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。見例如 Maniatis et al, 1982, Molecular Cloning (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)、Sambrook et al, 1989, MolecularCloning, 2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork)、Sambrook and Russell,2001, Molecular Cloning, 3rd Ed.(Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)、Ausubel et al, 1992), CurrentProtocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodicupdates)、Glover,1985, DNA Cloning(IRL Press, Oxford)、Russell,1984, Molecularbiology of plants:a laboratory course manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.) > Anand,Techniques for the Analysis ofComplex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)、Guthrie and Fink, Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press, New York, 1991) >Harlow and Lane, 1988,Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, New York)、Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames& S.J.Higginseds.1984)、Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)、Culture Of Animal Cells (R.1.Freshneyj Alan R.Lissj Inc.，1987)、ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press, 1986) Λ B.Perbalj A Practical Guide To MolecularCloning (1984)、Methods In Enzymology (Academic Press，Inc.，N.Y.)、Methods InEnzymologyjVols.154andl55(Wu et al.eds.), Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press,London, 1987)、HandbookOf Experimental Immunology, Volumes 1-1V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)、Riottj Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell ScientificPublications，Oxford， 1988、 Fire et al，RNA Interference Technology:From BasicScience to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge,2005、Schepers，RNA Interference in Practice, Wiley-VCHj2005、EngeIke,RNAInterference(RNAi):The Nuts & Bolts ofsiRNA Technology, DNA Press，2003、GottjRNA Interference, Editing, and Modification:Methods and Protocols(Methodsin Molecular Biology)，Human Press，Totowa，NJ，2004、Sohail，Gene Silencing by RNAInterference:Technology and Application，CRC，2004。
實(shí)施例通過如下實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例只是舉例說明本發(fā)明，不以任何形式限制本發(fā)明。使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或下文特別描述的技術(shù)。實(shí)施例1:材料和方法稻品系和生長(zhǎng)條件:IRBB10攜帶在IR24遺傳背景中的細(xì)菌枯萎病抗性基因XalO (Ogawa et al.，1988)。IRBB10A是在IR24遺傳背景中的XalO的改良的近等基因品系(near-1sogenic line) (Gu et al.，2008)。Nipponbare 是日本產(chǎn)稻品種,其易感于大多數(shù)Xoo菌株。IRBB5攜帶在IR24背景中的隱性細(xì)菌枯萎病抗性基因xa5 (Ogawa et al, 1988) 0稻植物在溫室中在32°C溫度生長(zhǎng)12.5小時(shí)(光照)及11.5小時(shí)(黑暗處)。細(xì)菌枯萎病接種:將稻黃單胞菌稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv oryzae)菌株在補(bǔ)加適當(dāng)抗生素的蛋白胨鹿糖瓊脂(PSA)平板上培養(yǎng)。根據(jù)剪葉法(leaf-clippingmethod) (Kauffman et al, 1973 ；Gu et al., 2008)進(jìn)行細(xì)菌枯萎病接種。如先前所述檢測(cè)量疾病評(píng)分(Gu et al.，2004 ；2008)。稻轉(zhuǎn)化:將XalO基因的亞克隆克隆進(jìn)二元載體pC1300 (CAMBIA, Canberra, Australia)中，并將該二元構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至根癌農(nóng)桿菌AGLl中。根據(jù)如Yin et al.(2000)所述方法進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Nipponbare轉(zhuǎn)化。
BAC文庫構(gòu)建:構(gòu)建XalO的細(xì)菌人工文庫(BAG),根據(jù)D.G.Peterson etal.(http://www.ncgr.0rg/research/jag/paper300/indexpage300.html)所述方案進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將IRBBlO植物在溫室中生長(zhǎng)7-10天。分離高分子量(HMW)核DNA，并包埋進(jìn)低熔點(diǎn)瓊脂糖塞中，用HindIII部分消化。然后將部分消化的HMW DNA使用Pulse-Field GelElectrophoresis (PFGE)裝置(CHEF Mapper II, Bio-Rad)進(jìn)行大小分級(jí)分離。經(jīng)大小分級(jí)分離的DNA(100-300kb)通過電洗脫(Strong et al.，1997)從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收，與 HindIII 消化的去磷酸化 BAC 載體 pIndigoBAC-5 (EPICENTRE, Madison, WI53713, USA)連接。使用Cell-Porator系統(tǒng)(GIBC0-BRL)將連接混合物電穿孔進(jìn)大腸桿菌DHlOB細(xì)胞中。人工挑取BAC克隆，在每孔具有60 μ I冷凍培養(yǎng)基的384孔平板中排成陣列。將BAC克隆在37°C培養(yǎng)14-16小時(shí)，在_80°C貯存。所述BAC文庫由大約50，000個(gè)克隆組成，插入體大小在30-60kb范圍，平均大小為40kb。這個(gè)文庫的規(guī)模是稻基因組的至少3倍。Southern印跡分析:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行Southern印跡分析(Sambrook etal.1989) 0將大約2-5 μ g稻基因組DNA用合適的限制酶消化，并在0.8%瓊脂糖凝膠中分離。將Southern印跡與用32P_dCTP標(biāo)記的DNA探針雜交(GE Healthcare, LittleChalfont, Buckinghamshire, UK)。Northern印跡分析:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行Northern印跡分析(Sambrook etal.1989) ο 使用 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)從葉中分離總 RNA。在northern印跡分析中每條泳道使用5 μ g信使RNA (mRNA)。通過將RNA印跡與稻遍在蛋白基因I (Ubi)雜交評(píng)估RNA荷載。進(jìn)行northern印跡分析的DNA探針用32P_dCTP標(biāo)記(GEHealthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)。實(shí)時(shí)PCR分析 :將大約I μ g的DNase 1-處理的總RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂渃DNA，使用iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, USA)進(jìn)行。在 IQ5Multicolor Real-Time PCRDetection System (Bio-Rad, USA)上使用 SsoFast EvaGreen supermix (Bio-Rad, USA)進(jìn)行定量反應(yīng)。反應(yīng)混合物(15μ )含有2XSsoFast EvaGreen supermix, 0.9 μ M每種正向和反向引物，及I μ L模板cDNA。在如下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增:95°C進(jìn)行30秒，隨后40次如下循環(huán):95°C進(jìn)行5秒，60°C進(jìn)行10秒。在擴(kuò)增后立即進(jìn)行解鏈曲線方案，即加熱10秒，自65°C開始，每次增加0.5°C。稻遍在蛋白I基因用作內(nèi)部對(duì)照。在這項(xiàng)研究中使用的所有引物在表I中示出。表1:DNA寡聚物
權(quán)利要求
1.分離的核酸，其編碼⑴具有SEQID NO:37所示氨基酸序列的XalO多肽或者(ii)與所述XalO多肽具有至少50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽在轉(zhuǎn)染至植物中時(shí)提供對(duì)黃單胞菌(Xanthomonas)具有抗性的植物。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中編碼所述XalO多肽的核酸具有SEQID NO:35所示的核苷酸序列或者SEQ ID NO: 35的第2423-3234位核苷酸所示的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中編碼所述XalO多肽的核酸具有SEQID NO:36所示核苷酸序列或者SEQ ID NO:36的第54-437位核苷酸所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1的分離的核酸，還與編碼異源多肽的核酸可操縱地連接。
5.包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的分離的核酸的載體。
6.權(quán)利要求5的載體，其還包含與所述分離的核酸可操縱地連接的植物啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求6的載體，其中所述啟動(dòng)子選自組織特異性啟動(dòng)子、組成性啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求6的載體，其中所述啟動(dòng)子選自具有SEQID N0:38所示的核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子、具有SEQ ID NO:38的第1-2422位核苷酸所示的核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子、和具有SEQ ID N0:39所示的核苷酸序列的XalO啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求6的載體，其中所述啟動(dòng)子選自含有具有SEQID N0:23所示核苷酸序列的Avr XalO框的啟動(dòng)子及含有所述AvrXalO框的衍生物的啟動(dòng)子，其中所述衍生物選自:具有SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID NO:28所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID NO: 30所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID NO: 31所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列的衍生物，具有SEQ ID NO: 72所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID NO: 73所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID NO: 74所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID NO:82所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID N0:83所示核苷酸序列的衍生物、具有SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列的衍生物、和具有SEQ ID NO: 85所示核苷酸序列的衍生物。
10.包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的分離的核酸或者權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)的載體的植物細(xì)胞。
11.包含權(quán)利要求10的細(xì)胞的黃單胞菌抗性轉(zhuǎn)基因植物。
12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是稻。
13.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自大麥、燕麥、小麥、玉米、甘藍(lán)、花椰菜、馬鈴薯、番茄、胡椒、辣椒、大豆和油菜籽。
14.產(chǎn)生黃單胞菌抗性植物的方法，包括將權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的分離的核酸或者權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)染至一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中，并使所轉(zhuǎn)染的一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞生長(zhǎng)為植物，其中所述分離的核酸在所述植物中表達(dá)。
15.增強(qiáng)植物中黃單胞菌抗性的方法，包括將權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的分離的核酸或權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)染至一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中，并使所轉(zhuǎn)染的一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞生長(zhǎng)為植物，其中所述分離的核酸在所述植物中表達(dá)。
16.賦予植物黃單胞菌疾病抗性的方法，包括將權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的分離的核酸或者權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)染至一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞中，并使所轉(zhuǎn)染的一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞生長(zhǎng)為植物，其中所述分離的核酸在所述植物中表達(dá)。
17.權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是稻。
18.權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的方法,其中所述植物選自大麥、燕麥、小麥、玉米、甘藍(lán)、花椰菜、馬鈴薯、番茄、胡椒、辣椒、大豆和油菜籽。
19.分離的多肽，其選自(i)具有SEQID N0:37所示氨基酸序列的XalO多肽、或者(ii)與所述XalO多肽具有至少50%相同性的多肽，其中(ii)的多肽在轉(zhuǎn)染至植物中時(shí)提供具有黃單胞菌抗性的植物。
20.在植物中具有啟動(dòng)子活性的分離的核酸，其選自: (a)具有SEQID NO:38所示核苷酸序列的核酸； (b)具有SEQID NO:38的第1-2422位核苷酸所示核苷酸序列的核酸； (c)具有SEQID NO:39所示核苷酸序列的核酸； (d)包含含有SEQID NO:23所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (e)包含含有SEQID NO:26所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (f)包含含有SEQID NO:28所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (g)包含含有SEQID NO:30所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (h)包含含有SEQID NO:31所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (i)包含含有SEQID NO:68所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (j)包含含有SEQ ID NO:72所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (k)包含含有SEQ ID NO:73所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (I)包含含有SEQ ID NO:74所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (m)包含含有SEQ ID NO:82所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (η)包含含有SEQ ID ΝΟ:83所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸； (ο)包含含有SEQ ID Ν0:84所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸；和 (P)包含含有SEQ ID ΝΟ:85所示核苷酸序列的植物可操縱啟動(dòng)子的核酸。
21.包含權(quán)利要求20的具有啟動(dòng)子活性的核酸的核酸構(gòu)建體，所述具有啟動(dòng)子活性的核酸與編碼感興趣核酸的第二核酸可操縱地連接。
22.在基因組內(nèi)含有權(quán)利要求21的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
23.在基因組內(nèi)含有權(quán)利要求21的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物。
24.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或者權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是稻。
25.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或者權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自大麥、燕麥、小麥、玉米、甘藍(lán)、花椰菜、馬鈴薯、番茄、胡椒、辣椒、大豆和油菜籽。
26.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求21的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞。
27.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用權(quán)利要求21的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞，并從所轉(zhuǎn)染的一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
28.權(quán)利要求26或27的方法，其中所述植物是稻。
29.權(quán)利要求26或27，其中所述植物選自大麥、燕麥、小麥、玉米、甘藍(lán)、花椰菜、馬鈴薯、番茄、胡椒、辣椒、大豆和油菜籽。
30.權(quán)利要求的20的分離的核酸用于在轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)的應(yīng)用。
31.編碼具有SEQID N0:54所示氨基酸序列的AvrXalO多肽的核酸用于在含有權(quán)利要求20的分離的核酸的轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)的應(yīng)用。
32.具有SEQID NO:54所示氨基酸序列的分離的AvrXalO多肽用于在含有權(quán)利要求20的分離的核酸的轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)的應(yīng)用。
33.權(quán)利要求30-32任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述植物是稻。
34.權(quán)利要求30-32任一項(xiàng)的方法,其中所述植物選自大麥、燕麥、小麥、玉米、甘藍(lán)、花椰菜、馬鈴薯、番茄、胡椒、 辣椒、大豆和油菜籽。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于賦予植物中對(duì)細(xì)菌疾病抗性的核酸及方法。本發(fā)明還提供了用于在轉(zhuǎn)基因植物中控制表達(dá)的啟動(dòng)子及啟動(dòng)子序列。
文檔編號(hào)C12N5/14GK103210087SQ201080069968
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者Z·C·尹, K·Y·古, D·S·田 申請(qǐng)人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司