專利名稱：：具有異淀粉酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及具有異淀粉酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關(guān)領域描述異淀粉酶是一種脫支酶(E.C.3.2.1.68)，其水解支鏈淀粉、糖原和β-極限糊精中的1，6-α_連接。支鏈淀粉由α-淀粉酶部分降解，所述酶將1，4-α_糖苷連接水解為支化和直鏈的寡糖，導致α-極限糊精的形成。不似支鏈淀粉酶(pullulanase)，異淀粉酶對支鏈淀粉和糖原具有高活性，而對芽霉菌糖(pullulan)具有非常低的活性。支化的寡糖可由脫支酶水解為直鏈寡糖。剩余的直鏈寡糖可由葡糖淀粉酶迅速地解聚為D-葡萄糖。美國專利號4，335，208公開了通過葡糖淀粉酶和來源于介支淀粉假單胞菌(Pseudomonasamyloderamosa)的嗜酸性異淀粉酶的酶混合物糖化淀粉水解物的工藝。EPl,002，062涉及來自嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)的異淀粉酶及其在淀粉轉(zhuǎn)化工藝中的用途。WO2005/121305(Novozymes)涉及用于產(chǎn)生具有低糖含量的啤酒的工藝，包括a)在酶活性的存在下制備醪液；b)過濾醪液以獲得麥芽汁，和c)發(fā)酵所述麥芽汁以獲得啤酒，其中所述酶活性包括α“淀粉酶、葡糖淀粉酶和異淀粉酶。本發(fā)明的目標是提供具有異淀粉酶活性的多肽，和編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明亦提供所述異淀粉酶用于糖漿制備和其他相關(guān)應用中的用途。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有異淀粉酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(al)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少93%，優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a2)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少94%，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a3)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少93%，優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a4)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少90%，優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNOSEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(cl)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c2)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c3)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO5的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c4)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDN07的成熟多肽編碼序列具有至少84%，優(yōu)選至少86%，更優(yōu)選至少87%，更優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；和(d)SEQIDNO:2、4、6和/或8的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸。更具體而言，在該方面本發(fā)明涉及編碼具有異淀粉酶活性的多肽的分離的多核苷酸，其通過下述方法獲得(a)在至少高嚴格條件下，優(yōu)選至少非常高嚴格條件下，將DNA群體與(i)SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5和/或SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和/或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈雜交；(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有異淀粉酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達載體和重組宿主細胞，和產(chǎn)生具有異淀粉酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生啤酒和糖漿的方法。本發(fā)明還涉及包含編碼此種具有異淀粉酶活性的多肽的分離的多核苷酸的植物。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生此種具有異淀粉酶活性的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)包含編碼此種具有異淀粉酶活性的多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。定義異淀粉酶活性術(shù)語“異淀粉酶活性”在本文中定義為具有糖原α-1,6-葡聚糖水解酶活性(EC編號3.2.1.68)活性的酶，所述活性催化糖原、支鏈淀粉以及其β_極限糊精中的(1，6)-a-D-糖苷支鏈連接的水解。就本發(fā)明而言，異淀粉酶活性是根據(jù)如下文中“材料和方法”部分在標題“確定異淀粉酶活性單位(IAU)，，中所述而確定的。本發(fā)明的多肽具有至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，且甚至最優(yōu)選至少100%的SEQIDNO:2、4、6或8的成熟多肽分別的異淀粉酶活性。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽如通過SDS-PAGE測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。術(shù)語“純”在此語境下的使用涉及本發(fā)明的多肽，且應理解為表明本發(fā)明的多肽與多少其他多肽物質(zhì)相結(jié)合(associated)。基本上純的多肽術(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現(xiàn)通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的具有異淀粉酶活性的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個優(yōu)選的方面，SignalPν3.0程序預測SEQIDNO:2、4、6和8的氨基酸-26至-1均為信號肽，根據(jù)該預測，成熟多肽分別為SEQIDΝ0:2、4、6和8的氨基酸1至750。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有異淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的方面，SignalPν3.0程序預測SEQIDNO1、3、5和7的核苷酸1至78均編碼信號肽，根據(jù)該預測，成熟多肽編碼序列分別為SEQIDNO:1、3、5和7的核苷酸79至2328。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277)(優(yōu)選3.0.0版或更高版本)的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開啟罰分(gapopenpenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最長同一性(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上文)(優(yōu)選3.0.0版或更高版本)的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開啟罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最長同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文中定義為在用Dyellajaponica異淀粉酶(登錄號DSM22712,DSM22713,DSM22714和DSM22715)分別進行的tfasty搜索(Pearson，W.R.,1999,于BioinformaticsMethodsandProtocols中，S.Misener禾口S.A.Krawetz編，PP.185-219)中給出的E值(或期望值)小于0.001的預測蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為分別從SEQIDNO:2、4、6或8的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有異淀粉酶活性。涉及多肽而使用的術(shù)語“其片段”在本發(fā)明的語境下應理解為與“多肽片段”具有相同含意。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為分別從SEQIDN0:l、3、5或7或其同源序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有異淀粉酶活性的多肽片段。等位變體(allelicvariant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。術(shù)語“純”在此語境下的使用涉及本發(fā)明的多核苷酸，且應理解為表明本發(fā)明的多核苷酸與多少其他多核苷酸物質(zhì)相結(jié)合(associated)?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本8上純的形式，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成或合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段，或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導多肽編碼序列的表達。表達術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等是易感的(susceptible)。修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對分別由SEQIDNO:2、4、6或8的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當用在本文時，術(shù)語“人工變體”的意思是具有異淀粉酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1、3、5或7的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(humanintervention)，通過修飾公開于SEQIDNO:1、3、5和/或7或它們的同源序列的多核苷酸序列來獲得。發(fā)明詳述具有異淀粉酶活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及具有異淀粉酶活性的分離的多肽，選自下組(al)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有9至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a2)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a3)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a4)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少90%，優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5禾口/或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(cl)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c2)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性(下文中稱作“同源多肽”)；(c3)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO5的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c4)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列具有至少84%，優(yōu)選至少86%，更優(yōu)選至少87%，更優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；和(d)SEQIDN0:2、4、6和/或8的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有與SEQIDNO:2、4、6和/或8的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選五個氨基酸，更優(yōu)選四個氨基酸，甚至更優(yōu)選三個氨基酸，最優(yōu)選兩個氨基酸，且甚至最優(yōu)選一個氨基酸的氨基酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列由SEQIDNO:2、4、6、8的氨基酸序列組成，或由與SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸序列相差1-70個氨基酸，如1-65個氨基酸，或1-60個氨基酸，或1-55個氨基酸，或1_50個氨基酸，或1-45個氨基酸，或1-40個氨基酸，或1-35個氨基酸，或1_30個氨基酸，或1_25個氨基酸，或1-20個氨基酸，或1-15個氨基酸，或1-10個氨基酸，或1-9個氨基酸，或1_8個氨基酸，或1-7個氨基酸，或1-6個氨基酸，或1-5個氨基酸，或1-4個氨基酸，或1-3個氨基酸，或1-2個氨基酸或1個氨基酸的氨基酸序列組成，其中術(shù)語“相差”意指與SEQIDN0:2、4、6、8的氨基酸序列相比取代、缺失和/或插入了給定數(shù)量的氨基酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列由SEQIDN0:2、4、6、8的成熟多肽組成，和/或由與SEQIDNO:2、4、6和/或8的成熟多肽相差1-70個氨基酸，如1-65個氨基酸，或1-60個氨基酸，或1-55個氨基酸，或1_50個氨基酸，或1-45個氨基酸，或1-40個氨基酸，或1-35個氨基酸，或1_30個氨基酸，或1_25個氨基酸，或1-20個氨基酸，或1-15個氨基酸，或1-10個氨基酸，或1-9個氨基酸，或1_8個氨基酸，或1-7個氨基酸，或1-6個氨基酸，或1-5個氨基酸，或1-4個氨基酸，或1-3個氨基酸，或1-2個氨基酸或1個氨基酸的氨基酸序列組成，其中術(shù)語“相差”意指與SEQIDN0:2、4、6、8的氨基酸序列相比取代、缺失和/或插入了給定數(shù)量的氨基酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列由SEQIDN0:2、4、6、8的氨基酸1至750組成，或由與SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸1至750相差1-70個氨基酸，如1-65個氨基酸，或1_60個氨基酸，或1_55個氨基酸，或1_50個氨基酸，或1-45個氨基酸，或1-40個氨基酸，或1-35個氨基酸，或1_30個氨基酸，或1_25個氨基酸，或1-20個氨基酸，或1-15個氨基酸，或1-10個氨基酸，或1-9個氨基酸，或1_8個氨基酸，或1-7個氨基酸，或1-6個氨基酸，或1-5個氨基酸，或1-4個氨基酸，或1-3個氨基酸，或1-2個氨基酸或1個氨基酸的氨基酸序列組成，其中術(shù)語“相差”意指與SEQIDNO:2、4、6、8的氨基酸序列相比取代、缺失和/或插入了給定數(shù)量的氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸序列或其變體，或它們具有異淀粉酶活性的片段。所述變體可具體而言為等位變體、人工變體，或包含SEQIDNO:2、4、6和/或8的成熟多肽取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2、4、6和/或8的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽分別包含SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸1至750，或其變體；或它們的具有異淀粉酶活性的變體。所述變體可具體而言為等位變體、人工變體，或包含SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2、4、6和/或8的氨基酸1至750。在另一個方面，所述多肽由SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸序列或其變體，或它們具有異淀粉酶活性的片段組成。所述變體可具體而言為等位變體、人工變體，或包含SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2、4、6和/或8的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸1至750，或其變體；或它們的具有異淀粉酶活性的片段組成。所述變體可具體而言為等位變體、人工變體，或包含SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸1至750組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及編碼具有異淀粉酶活性的多肽的分離的多核苷酸，其通過下述方法獲得(a)在至少高嚴格條件下，優(yōu)選至少非常高嚴格條件下，將DNA群體與(i)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5禾口/或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5禾口/或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有異淀粉酶活性的多肽。因此，本發(fā)明涉及具有異淀粉酶活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選高嚴格條件下，優(yōu)選非常高嚴格條件下，與下述雜交(i)SEQIDN0:l、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andΤ.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列的亞序列，分別含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。而且，所述亞序列可編碼具有異淀粉酶活性的多肽片段。在一個優(yōu)選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。SEQIDNO:1、3、5和/或7的核苷酸序列，或其亞序列，以及SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸序列，或其片段，可用于設計核酸探針，以根據(jù)本領域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有異淀粉酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以從其中鑒定和分離相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸?？墒褂蒙踔粮L的探針，例如長度為優(yōu)選至少600個核苷酸，更優(yōu)選至少700個核苷酸，甚至更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個氨基酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有異淀粉酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至并且固定于硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料。為了鑒定與SEQIDN0:l、3、5和/或7，或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用于Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在高至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDN0:l、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列；包含SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；其全長互補鏈；或它們的亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針分別為SEQIDN0:l、3、5和/或7的核苷酸79至2328。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2、4、6和/或8的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDN0:l、3、5和/或7。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含于并可得自保藏的菌株DyellajaponicaDSM22712,DyellajaponicaDSM22713,DyellajaponicaDSM22714和/或DyellajaponicaDSM22715中的多核苷酸序列之一，其中其多核苷酸序列編碼具有異淀粉酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于并可得自保藏的菌株DyellajaponicaDSM22712,DyellajaponicaDSM22713、DyellajaponicaDSM22714和/或DyellajaponicaDSM22715的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，高至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，以及對于高和非常高嚴格性為50%的甲酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預雜交和雜交最佳12至M小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選在65°C(高嚴格性)，并且最優(yōu)選在70°C(非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy的計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計算的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40，1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二S1I內(nèi)(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及由多核苷酸編碼的具有異淀粉酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸包含下述，或由下述組成(cl)核苷酸序列，其與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c2)核苷酸序列，其與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c3)核苷酸序列，其與SEQIDNO5的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c4)核苷酸序列，其與SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列具有至少84%，優(yōu)選至少86%，更優(yōu)選至少87%，更優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性。在第四個方面，本發(fā)明涉及SEQIDNO:2、4、6和/或8的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。野生型多肽中的氨基酸取代既包括用20個標準氨基酸的取代，也還包括用非標準氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)的取代。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。能夠根據(jù)本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，異淀粉酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255=306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或W095/2^25公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利No.5，223，409；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從14宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO:2、4、6和/或8的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有異淀粉酶活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的?？勺云浍@得本發(fā)明的多肽的來源的實例包括但不限于任何如下所述的。本發(fā)明具有異淀粉酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是具有異淀粉酶活性的革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽；或具有異淀粉酶活性的革蘭氏陰性細菌多肽，如Dyella、Fulvimonas、弗拉特氏菌屬(Frateuria)禾口Rhodanobacter，大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)屬多肽。在一個優(yōu)選方面，所述多肽是具有異淀粉酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)S"(Bacillusamyloliquefaciens)^M^^^fM(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulms)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有異淀粉酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有異淀粉酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有異淀粉酶活性的介支淀粉假單胞菌(Pseudomonasamyloderamosa)多月太,例如，(Harada等，1968；Sugimoto等，1974)中所述的15多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有異淀粉酶活性的金黃弗拉特氏菌(Frateuriaaurantia)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有異淀粉酶活性的Dyellajaponica和Dyellakoreensis多月太。在一個更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有異淀粉酶活性的Dyellajaponica多肽。在一個最優(yōu)選的方面，所述多肽是具有異淀粉酶活性的DyellaJaponicaDSM22712、DSM22713、DSM22714和/或DSM22715多肽，例如，分別包含SEQIDNO:2、4、6或8的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的身份(identity)。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠通過使用本領域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合蛋白，就切割所述位點，從融合蛋白質(zhì)釋放具有異淀粉酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-ffiIson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498-503；禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基后通過lector)(a蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Col1ins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989,ProteinsStructure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg后通過凝血酶切割Gtevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln后通過TEV蛋白酶切割Gtevens，2003，見上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln后通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Mevens，2003，見上文)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有異淀粉酶活性的多肽的核苷酸序列，或由編碼本發(fā)明具有異淀粉酶活性的多肽的核苷酸序列組成。本發(fā)明的多肽可具體而言由下述多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含任何SEQIDNO:1、3、5和/或7的核苷酸序列，或其編碼具有異淀粉酶活性的片段的亞序列，或者所述多核苷酸由任何SEQIDNO:1、3、5和/或7的核苷酸序列，或其編碼具有異淀粉酶活性的片段的亞序列組成。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列分別包含SEQIDN0:l、3、5和/或7或由SEQIDN0:l、3、5和/或7組成。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含下述序列，或由下述序列組成，所述序列包含于保藏的菌株DyellajaponicaNN060811(DSM22712)；DyellajaponicaNN060812(DSM22713)；DyellajaponicaNN060813(DSM22714)；DyellajaponicaNN060814(DSM22715)。在另一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列組成。本發(fā)明還涵蓋了編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽分別包含SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸序列，或其成熟多肽，或者所述多肽分別由SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸序列，或其成熟多肽組成，其中所述核苷酸序列與SEQIDN0:l、3、5和/或7，或其成熟多肽編碼序列由于遺傳密碼的簡并性而有差異。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:l、3、5和/或7的亞序列，其分別編碼SEQIDNO:2、4、6和/或8的具有異淀粉酶活性的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由在SEQIDN0:l、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變的組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)。可以從DyelIa屬菌株，或其它或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并且因此可為例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列分別與SEQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列具有一定程度的同一性。本發(fā)明還涉及編碼具有異淀粉酶活性的多肽的分離的多核苷酸，其由下述方法獲得(a)在至少高嚴格條件下，優(yōu)選至少非常高嚴格條件下，將DNA群體與(i)SEQIDNOSEQIDN0:3、SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5禾口/或SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈雜交；(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有異淀粉酶活性的多肽。本發(fā)明的分離的多核苷酸可為SEQIDNO:1、3、5和/或7的核苷酸79-2328中的成熟多肽編碼序列。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95_107。對于本領域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Curminghan^Pflfells，1989，見上文)來鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，并且測試所得突變分子的異淀粉酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術(shù)來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上文；Smith等，1992，見上文；Wlodaver等，1992，見上文)。在一個優(yōu)選的方面，所述互補鏈是SEQIDN0:l、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。本發(fā)明還涉及包含分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸包含編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在表達宿主中指導多肽的產(chǎn)生?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領域熟知的。調(diào)控序列可以是適當?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α_淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),\)JsRtac(DeBoerφ,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。亦可使用啟動子的組合，如描述于W099/43835或本申請實施例1中的三重啟動子系統(tǒng)(triplepromotersystem)，其由來自地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)的啟動子和包含穩(wěn)定序列的蘇云金芽孢桿菌cryIIIA啟動子組成。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"TScientificAmerican，1980，242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見上文中描述。用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(lihizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Asperillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(TO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(TO96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動子(來自對于黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。用于細菌宿主細胞的終止子的實例包括但不限于從地衣芽孢桿菌BPN’和地衣芽孢桿菌amyl的基因獲得的那些。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的?；蛘?，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)、克勞氏芽孢桿菌alcaline蛋白酶(aprH)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993，MicrobiologicalReviews57:109-137描述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。在一個優(yōu)選的方面，信號肽分別包含SEQIDNO:2、4、6和/或8的氨基酸-26至-1，或者分別由SEQIDΝ0:2、4、6和/或8的氨基酸至-1組成。在另一個優(yōu)選方面，信號肽編碼序列分別包含SEQIDN0:l、3、6和/或8的核苷酸1至78，或者分別由SEQID而1、3、6和/或8的核苷酸1至78組成。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、xyl和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組表達載體。本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達本發(fā)明的多核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)粒或兩個或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予21抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’-磷酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霄(Aspergillusnidulans)或米曲霄的amdS禾口pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或允許載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質(zhì)粒復制子(r印licator)，其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復制起點”或“質(zhì)粒復制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復制的核苷酸序列。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米復制起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成。可以將多于一個拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝，且由此含有所述多核苷酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞22本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，可有利地用于多肽的重組產(chǎn)生中。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體導入宿主細胞，使載體如前所述作為染色體整體或者作為自復制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細胞”包括親本細胞的任何后代，其由于復制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細胞。宿主細胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組宿主細胞。宿主細胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本發(fā)明的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是天藍鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5771—5278)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，R)liaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，hfect.Immun.321295_1四7)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本領域已知的將DNA引入宿主細胞的任何方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上文)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Cori0Ius)JIl球菌屬、Filikisidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Wianerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬Gchizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFiffllif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽角質(zhì)金包子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、ChrysosporiumIucknowense>熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、粗金包子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、_畐射射脈菌(Phlebiaradiata)、朿Ijff偵U耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢殼、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霄(Trichodermaharzianum)、康寧木霄(Trichodermakoningii)>長枝7^(Trichodermalongibrachiatum)(Trichodermareesei)或參錄^^7^(Trichodermaviride)細胞?？梢詫⒄婢毎ㄟ^涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細胞是Dyella屬的細胞。在一個更優(yōu)選的方面，所述細胞是DyellaJaponica0在一個更優(yōu)選的方面，所述細胞分別為DyellajaponicaDSM22712、DyellajaponicaDSM22713、DyellajaponicaDSM22714和/或DyellajaponicaDSM22715。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)如本文所述，在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO=U3、5和/或7的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽分別包含SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽或由SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I域已知的對于多肽是特異性的方法來檢測所述多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本發(fā)明的多肽可在一個具體實施方案中通過淀粉親和層析來純化，例如，通過使用淀粉酶瓊脂糖作為親和材料。其實施方法包括但不限于下文實施例2中所述的方法。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有異淀粉酶活性的多肽，從而以可回收的量表達和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于破壞抗營養(yǎng)因子。本發(fā)明還涉及用編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植26物細胞。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tcAacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模式生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(calIus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)禾口細胞質(zhì)(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發(fā)明的應用的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細胞的子代。表達本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細胞將編碼本發(fā)明多肽的一個或多個(幾個)表達構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞。表達構(gòu)建體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該核苷酸序列所需的適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構(gòu)建體可以包含對于鑒定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了表達構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對于組成型表達，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck等，1980,Cell21:285_294，Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675-689；Zhang等，1991,PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303),或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889)，來自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiologyl52:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術(shù)領域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在W091/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology洸85-93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995,Molecularandgeneralgenetics248:668-674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動子增強子元件也可以用于實現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉(zhuǎn)化、病毒介導的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990，Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和khilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物常常使用其他的轉(zhuǎn)化方法。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162；Vasilφ,1992,Bio/Technology10667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-428所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領域熟知的方法選擇具有并入的表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩個獨立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有異淀粉酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語“富含”表示所述組合物的異淀粉酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)±曾力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的異淀粉酶作為主要酶成分，例如，單成分組合物。在一個實施方案中，所述組合物可進一步包含一種或多種葡糖淀粉酶，具體而言其來源于曲霉屬、木霉屬、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)或栓菌屬菌株，包括黑曲霉、里氏木霉、埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)禾口辦環(huán)檢菌(Trametescingulata)。在另一個實施方案中，所述組合物進一步包含一種或多種選自下組的其他的酶蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(maltogenicamylase),α-葡糖苷酶、支鏈淀粉酶(pullulanase)、己糖(hexosyltransferase)禾口分$61。其他的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉?？梢砸勒毡绢I域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本領域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領域內(nèi)已知的方法確定。用途本發(fā)明還涉及使用具有異淀粉酶活性的多肽或其組合物的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明的異淀粉酶可用于飲料如啤酒的糖化(mashing)工藝。在一個實施方案中，本發(fā)明的異淀粉酶可用于從淀粉產(chǎn)生食物成分。異淀粉酶通常與其他淀粉水解酶如α-淀粉酶、淀粉酶和葡糖淀粉酶組合使用。取決于具體的應用，異淀粉酶以50-5000IAU每克淀粉的水平使用。在從淀粉產(chǎn)生葡萄糖糖漿中，使用α-淀粉酶如細菌α-淀粉酶，例如一種或多種芽孢桿菌屬α-淀粉酶來液化淀粉。接著，可添加葡糖淀粉酶以將淀粉水解物轉(zhuǎn)化為葡萄糖糖漿。本發(fā)明的異淀粉酶的添加可隨之導致具有較高葡萄糖含量的糖漿，同時減少了添加的葡糖淀粉酶的量。因此本發(fā)明還涉及本發(fā)明的異淀粉酶或本發(fā)明的組合物用于產(chǎn)生葡萄糖糖漿的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的異淀粉酶或本發(fā)明的組合物用于產(chǎn)生高果糖糖漿，特別是產(chǎn)生HFCS的工藝中的用途。對于使用葡糖淀粉酶和異淀粉酶的混合物產(chǎn)生高DX葡萄糖糖漿(例如97-98DX)所涵蓋的方法的具體實例描述于美國專利4，335，208-Α，特別是實施例1、3、4、5、6和7，其通過提述并入本文。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的異淀粉酶或本發(fā)明的組合物在用于產(chǎn)生麥芽糖或麥芽糖醇的工藝中的用途。本發(fā)明的異淀粉酶還可用于產(chǎn)生麥芽糖和麥芽糖醇。在此種實施方案中，將異淀粉酶添加至經(jīng)α-淀粉酶處理之后的液化的淀粉。與此同時，可添加β-淀粉酶。水解可在大約50-60°C，例如在50-55°C的溫度，和大約pH4_6，例如約5.0的pH實施?？山又兓饪s所得的高麥芽糖糖漿，并對其進行結(jié)晶以獲得結(jié)晶麥芽糖。然后可通過催化氫化將麥芽糖轉(zhuǎn)化為麥芽糖醇。麥芽糖醇在非致齲的(non-cariogenic)硬糖果(hardcandy),口香糖和其他糖果(confectionary)的生產(chǎn)中用作糖替代物。本發(fā)明的異淀粉酶亦可與環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTase)、麥芽寡糖基海藻糖合酶(malto-oligosyltrehalosesynthase)和麥芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(malto-oligosyltrehalosetrehalohydrolase)一同用于從液化的淀粉產(chǎn)生二糖海藻糖。其反應產(chǎn)物為海藻糖糖漿，然后將其純化并濃縮。海藻糖在食品中(例如，在烘烤產(chǎn)品、飲料、糖果和早餐谷物食品(breakfastcereal))中用作組織形成劑、穩(wěn)定劑、保濕劑和增甜劑。本發(fā)明的異淀粉酶亦可與CGTase—同用于增強從淀粉產(chǎn)生環(huán)糊精。舉例而言，通過在大約PH6和25°C施用異淀粉酶、CGTase和環(huán)癸酮的混合物，從支鏈淀粉獲得了90%收率的β-環(huán)糊精。環(huán)癸酮是絡合劑，其與環(huán)糊精分子形成不可溶的包合絡合劑。環(huán)糊精作為成膠囊劑(encapsulatingagent)用于食物添加劑、調(diào)味料和維生素。一般而言，異淀粉酶活性優(yōu)選以1至l，000，000，000IAU/kgDS，更優(yōu)選10至100,000,000IAU/kgDS，甚至更優(yōu)選100至10，000，000IAU/kgDS，且最優(yōu)選50，000至5，000，000IAU/kgDS的量使用，或以0.OOlmg至100000mgEP/kgDS,優(yōu)選以0.Olmg至IOOOOmgEP/kgDS的量，更優(yōu)選以0.Img至IOOOmgEP/kgDS的量，最優(yōu)選以Img至IOOmgEP/kgDS的量使用。本發(fā)明還涉及使用異淀粉酶、分支酶和淀粉麥芽糖酶(EC2.4.1.25)產(chǎn)生糖原的方法，例如，Kajuura等(2008),BiocatalysisandBiotransformation,26(1-2):133-140所述的方法。材料和方法材料α-淀粉酶LS兩份雜合α-淀粉酶與一份嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的混合物，前者包含地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的445個C端氨基酸殘基(示于W099/19457的SEQIDNO4)和來源于解淀粉芽孢桿菌的α淀粉酶的37個N端氨基酸殘基(示于WO99/19467的SEQIDNO:5)，具有下述取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S；后者具有下述突變I181*+G182*+N193F。葡糖淀粉酶AN來源于黑曲霉的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶T來源于埃默森踝節(jié)菌的葡糖淀粉酶，其公開于W099/28448中的SEQIDNO:7，并可從NovozymesA/S，Denmark獲得。生物材料的保藏下述的生物材料已經(jīng)依據(jù)布達佩斯條約的條款保藏于德意志微生物和細胞培養(yǎng)保藏中心(DSMZ)，Inffenstr.7B，D-38124Braunschweig，Germany，并給予下述的登錄號保藏物登錄號保藏曰期DyellajaponicaNN060811DSM227122009年6月24日DyellajaponicaNN060812DSM227132009年6月24日DyellajaponicaNN060813DSM227142009年6月24日DyellajaponicaNN060814DSM227152009年6月24日所述菌株于下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，依據(jù)該外國專利法律的授權(quán)的人能夠獲得所述培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本，或其后續(xù)文本的國家，依據(jù)該外國專利法律進行要求可以獲得所述保藏物。然而，應當理解，保藏物的可獲得性并不構(gòu)成對實施本發(fā)明的許可，實施本發(fā)明是對政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。保藏的供體株的來源保藏物來源國家年份DyellajaponicaNN060811丹麥2007DyellajaponicaNN060812中國2007DyellajaponicaNN060813中國2007DyellajaponicaNN060814中國2007方法確定異淀粉酶活性單位(IAU)淀粉的脫支是作為碘結(jié)合的增加，以及由此由于直鏈葡聚糖比支化的葡聚糖(支鏈淀粉)對碘的結(jié)合更強而致的藍色的增加來測量的。1單位⑶異淀粉酶活性(IAU)為在40°C，pH4.5，每分鐘導致在610處的吸光度增加0.01的酶的量。底物75mM乙酸鈉pH4.5,2mMCaCl2中的1%蠟狀玉米淀粉(waxycornstarch)(支鏈淀粉)。底物應煮沸10-15分鐘以溶解淀粉。碘/中止試劑(stopreagent)=MQH2O中的IOmMI2/KI硫酸溶液MQH2O中的20mMH2SO4測定法步驟？昆合1.600微升底物2.100微升酶溶液(包括應為100微升MQH2O的對照)3.在40°C溫育30分鐘4.在30分鐘之后，取50微升至已經(jīng)含有50微升碘溶液的Eppendorf試管。5.接著添加1.5mL硫酸溶液并將200微升轉(zhuǎn)移至MTP平板。6.在5分鐘之后，在610nm讀取吸光度?；钚杂嬎鉛/mL=0D610(樣品)-0D610(對照)/0.01/30分鐘/50微升*1000微升31葡糖淀粉酶活件(AGU)Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在37°C，pH4.3，底物麥芽糖23.2mM，緩沖液乙酸0.1M，反應時間5分鐘的標準條件下，每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量?？墒褂米詣臃治鰞x系統(tǒng)。將變旋酶添加至葡糖脫氫酶試劑從而使得任何存在的α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)棣?D-葡萄糖。葡糖脫氫酶與β-D-葡萄糖在上述提及的反應中特異性反應，形成NADH，使用光度計在340nm處確定NADH作為起始葡萄糖濃度的量度。權(quán)利要求1.一種具有異淀粉酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(al)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a2)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a3)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(a4)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少90%，優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%的同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和/或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈；(cl)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c2)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c3)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDN0:5的成熟多肽編碼序列具有至少86%，優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；(c4)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDN0:7的成熟多肽編碼序列具有至少84%，優(yōu)選至少86%，更優(yōu)選至少87%，更優(yōu)選至少88%，更優(yōu)選至少89%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%，且甚至最優(yōu)選至少99%的同一性；和(d)SEQIDNO:2、4、6和/或8的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。2.權(quán)利要求1的多肽，包含任意的SEQIDN0:2、4、6和/或8的氨基酸序列，或其具有異淀粉酶活性的片段，或者由任意的SEQIDN0:2、4、6和/或8的氨基酸序列，或其具有異淀粉酶活性的片段組成。3.權(quán)利要求2的多肽，包含SEQIDN0:2、4、6和/或8的成熟多肽，或者由SEQIDNO:2、4、6和/或8的成熟多肽組成。4.權(quán)利要求1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含任意的SEQIDN0:l、3、5和/或7的核苷酸序列，或其編碼具有異淀粉酶活性的片段的亞序列，或者所述多核苷酸由任意的SEQIDNO:1、3、5和/或7的核苷酸序列，或其編碼具有異淀粉酶活性的片段的亞序列組成。5.權(quán)利要求4的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDN0:1、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列，或者所述多核苷酸由SEQIDN0:l、3、5和/或7的成熟多肽編碼序列組成。6.權(quán)利要求1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含于并可得自DyellajaponicaDSM22712、DyellajaponicaDSM22713、DyellajaponicaDSM22714或DyellajaponicaDSM22715。7.權(quán)利要求1-6任一項的多肽，其中所述成熟多肽為SEQIDN0:2、4、6和/或8之任一的氨基酸1至750。8.權(quán)利要求1-7任一項的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:1、3、5和/或7之任一的核苷酸79至2328。9.一種分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1-8任一項的多肽的核苷酸序列。10.一種核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求9的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個(幾個)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列在表達宿主中指導所述多肽的產(chǎn)生。11.一種重組表達載體，其包含權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體。12.—種重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體。13.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-8任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。14.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-8任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。15.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求9的多肽，通過下述方法獲得(a)在至少高嚴格條件下，優(yōu)選至少非常高嚴格條件下，將DNA群體與(i)SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5和/或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1、SEQIDNO3、SEQIDNO:5禾Π/或SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈雜交；(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有異淀粉酶活性的多肽。16.權(quán)利要求15的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:l、3、5和/或7的核苷酸79-2328。17.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-8任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。18.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，其經(jīng)編碼權(quán)利要求1-8任一項的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。19.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-8任一項的異淀粉酶。20.權(quán)利要求19的組合物，進一步包含一種或多種葡糖淀粉酶，特別是來源于曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)或栓菌屬(Trametes)的菌株，包括黑曲霉(Aspergillusniger)、里氏木霉(Trichodermareesei)、埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)禾口瓣環(huán)栓菌(Trametescingulata)的菌株。21.權(quán)利要求19或20的組合物，進一步包含一種或多種選自下組的酶蛋白酶、α_淀粉酶、β-淀粉酶、產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、支鏈淀粉酶、己糖基轉(zhuǎn)移酶和分支酶。22.權(quán)利要求19的組合物，進一步包含埃默森踝節(jié)菌葡糖淀粉酶。23.權(quán)利要求1-8任一項的異淀粉酶或權(quán)利要求19-21任一項的組合物用于產(chǎn)生葡萄糖糖漿的用途。24.權(quán)利要求1-8任一項的異淀粉酶或權(quán)利要求19-21任一項的組合物用于產(chǎn)生高果糖糖漿，特別是產(chǎn)生HFCS的工藝的用途。25.權(quán)利要求1-8任一項的異淀粉酶或權(quán)利要求19-21任一項的組合物在用于產(chǎn)生麥芽糖或麥芽糖醇的工藝中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及來源于Dyellajaponica、具有異淀粉酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。本發(fā)明還涉及所述具有異淀粉酶活性的多肽用于產(chǎn)生葡萄糖糖漿、果糖糖漿、麥芽糖糖漿或麥芽糖醇中的用途。文檔編號C12P19/16GK102482658SQ201080037158公開日2012年5月30日申請日期2010年8月20日優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日發(fā)明者B.E.諾曼,C.斯朱霍爾姆,T.霍夫申請人:諾維信公司