專利名稱：細(xì)菌(柔膜細(xì)菌)污染的改良檢測的制作方法
細(xì)菌(柔膜細(xì)菌)污染的改良檢測本發(fā)明提供了通過抑制非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物改良的基于PCR的靶序列擴(kuò)增。改良涉及使用被最佳化以在第一種生物的基因組DNA的背景中擴(kuò)增污染物的核酸的引物對。當(dāng)對懷疑包含污染物的來自第二種生物的DNA實施相同的基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)時，當(dāng)?shù)谝环N生物的基因組DNA的量存在于擴(kuò)增反應(yīng)中時，污染物的檢測靈敏度和特異性增強。
背景技術(shù)：
支原體屬(Mycoplasma)是屬于缺乏細(xì)胞壁的柔膜體綱的細(xì)菌屬。沒有細(xì)胞壁， 支原體屬細(xì)菌不受靶向原核細(xì)胞壁合成的許多常見抗生素影響，所述抗生素例如青霉素或其他β-內(nèi)酰胺抗生素。存在超過100種公認(rèn)的支原體屬物種，柔膜體綱(Mollicutes) 中的幾個屬之一。柔膜細(xì)菌是人、其他動物(包括昆蟲)和植物的寄生蟲或共生體；支原體屬通過定義被限定于脊椎動物宿主。膽固醇是支原體屬以及柔膜細(xì)菌(mollicutes)的某些其他屬的物種生長所需的。它們的最佳生長溫度通常是其宿主的溫度，如果是溫血的 (warmbodied)(例如在人中37°C )，或環(huán)境溫度，如果宿主不能調(diào)節(jié)其自身內(nèi)部溫度。16S 核糖體RNA序列的分析以及基因含量強烈暗示柔膜細(xì)菌包括支原體與系統(tǒng)樹的乳桿菌屬 (Lactobacillus)或梭菌屬(Clostridium)分支(在嚴(yán)格意義上厚壁菌門(Firmicutes)) 緊密相關(guān)。支原體屬物種通常在研究實驗室中作為細(xì)胞培養(yǎng)中的污染物發(fā)現(xiàn)。支原體細(xì)胞培養(yǎng)污染可以由于來自個體的污染或污染的細(xì)胞培養(yǎng)基成分而發(fā)生。支原體細(xì)胞物理上是很小的-小于ι μ m-并且它們因此難以用常規(guī)顯微鏡檢測。支原體可以誘導(dǎo)細(xì)胞改變，包括染色體畸變、代謝和細(xì)胞生長中的改變。嚴(yán)重支原體感染具有破壞細(xì)胞系的潛力。支原體還涉及作為許多疾病中的病原體。肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae) 是社區(qū)獲得性肺炎的主要成因劑。螺原體屬(Spiroplasma)物種通過分子和血清學(xué)研究近期已與傳播性海綿狀腦病(TSEs)關(guān)聯(lián)(Bastian, F. 0. , J Neuropathol Exp Neurol 64(2005)833-838)。然而， 螺原體屬物種與TSh的關(guān)系仍是有爭議的，例如考慮到檢測受綿羊瘋癢病感染的倉鼠腦中螺原體的任何足跡的rRNA種類的參與者不知情研究的失敗(Alexeeva，〗.，等人，J Clin Microbiol 44 0006)91-97)。然而，在考慮中的TSh包括綿羊中的綿羊瘋癢病、鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)和人中的克雅氏病。顱內(nèi)接種到綿羊和山羊內(nèi)的從受綿羊瘋癢病侵襲的綿羊腦和受CWD侵襲的鹿腦中分離的螺旋體屬物種誘導(dǎo)非常類似這些動物中的天然TSE 的海綿狀腦病。這些數(shù)據(jù)明確顯示螺原體與TSE相關(guān)。顯示螺原體屬細(xì)菌在含胚卵中生長且可以在此類培養(yǎng)系統(tǒng)中傳代(Bastian， F. 0.，等人，Journal of Medical Microbiology 56(2007) 1235-1242) 含胚卵在疫苗生產(chǎn)中起主要作用。例如，針對流行性感冒的人疫苗已可用幾乎60 年，并且直到最近，幾乎完全由在9到11天齡的含胚雞卵的尿囊腔中生長的病毒進(jìn)行制備。 因此，螺原體的致病性潛力使得柔膜體綱病原體的檢測成為用于確保由含胚卵制備的任何產(chǎn)物的安全的首要重要的工具。此外，在生物藥物生產(chǎn)、細(xì)胞療法和組織工程過程中支原體污染的可能性尤其是主要問題。由全世界的藥典和藥物管理機構(gòu)要求的常規(guī)檢測法使用在培養(yǎng)基上的生長，以鑒定污染生物。這些基于培養(yǎng)的技術(shù)要求長時間以達(dá)到結(jié)果。此外，某些支原體屬物種的培養(yǎng)可能是不可能或不可靠的。因此，需要改良且特別是更快速和可靠的微生物測定。Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193 公開了用于中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)的支原體測試的PCR法。測試的原理是首先分離來自細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞和上清液) 的基因組DNA，并且其次使用對于支原體屬物種的16S-rRNA基因中的區(qū)域特異的引物和分離的DNA作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在陽性結(jié)果的情況下，形成且檢測到對應(yīng)于靶向區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物。當(dāng)未形成擴(kuò)增產(chǎn)物時，獲得陰性結(jié)果。在該方法中使用的引物是先前公開的通用支原體引物(Wong-Lee，J.G.和 Lovett, Μ. , "Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture "in !Diagnostic molecular microbiology-principles and applications ；Persing, DH, Smith, TF, Tenover, FC, White, TJ(編輯),Washington, DC, American Society for Microbiology (1993) 257J60)。Eldering，J. A.，等人(同上)的方法是測定最佳化的結(jié)果且組合了改善支原體檢測的靈敏度和特異性的6個要素(1)用于與支原體基因組的擴(kuò)增物比較具有不同大小的PCR產(chǎn)物的陽性對照質(zhì)粒，(2)從懷疑被支原體細(xì)菌污染的細(xì)胞培養(yǎng)中分離的DNA的純化和濃縮，(3)熱啟動Taq DNA聚合酶的使用，⑷其中應(yīng)用從70到60°C的退火溫度梯度的所謂降落PCR技術(shù)的使用，(5)PCR試劑的凈化，和(6)專用設(shè)備和材料的使用。值得注意的是，關(guān)于所述最佳化PCR法的要素2，作者選擇用于DNA純化和濃縮的方法，其包括步驟(a)裂解細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞和培養(yǎng)基)，和(b)用乙醇沉淀來自裂解物的DNA 且分離沉淀的DNA。進(jìn)一步公開的是此類沉淀法比使用旋轉(zhuǎn)柱的用于DNA純化的可替代方法具有優(yōu)勢。旋轉(zhuǎn)柱一般含有具有二氧化硅表面的過濾材料。例如通過離心，通過使緩沖液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)柱，使溶解于任選還含有醇的高鹽和/或離液緩沖液中的DNA與過濾材料結(jié)合。在后續(xù)步驟中，DNA可以使用非離液低鹽緩沖液或純水從過濾材料中洗脫。在最佳化研究中，獲得與可能存在于旋轉(zhuǎn)柱中的痕量污染物一致的結(jié)果。當(dāng)柱與CHO基因組DNA接觸時，從旋轉(zhuǎn)柱中去除痕量污染物。CHO基因組DNA的可能作用描述為用于污染物的載體的那種作用。基于Eldering，J. Α.，等人(同上)的發(fā)現(xiàn)和其中公開的工作流程，Roche Applied Science (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)已進(jìn)一步最佳化且開發(fā)了 MYC0T00L測試試劑盒。使用測試試劑盒進(jìn)行的測定提供了用于細(xì)胞和無細(xì)胞系統(tǒng)的高度靈敏的支原體測定。MYC0T00L特別涉及藥物質(zhì)量控制。先前研究涉及來自16S rRNA基因特異性引物的PCR生成的人工產(chǎn)物(Osborne， C. Α.，等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 248(2005) 183-187) 得出結(jié)論使用特定引物對生成的人工產(chǎn)物可以通過使用用于擴(kuò)增反應(yīng)的不同引物來避免。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)其中MYC0T00L測定的PCR產(chǎn)生可以是人工產(chǎn)物的片段的偶然情況(參見實施例)。注意到Eldering，J. Α.，等人(同上)的最佳化測定以及特別是其中使用的引物基本上構(gòu)成用于柔膜細(xì)菌的極佳檢測系統(tǒng)的事實，本發(fā)明的目的是改善 PCR方法，從而使得無關(guān)擴(kuò)增物的出現(xiàn)降到最低。特別地達(dá)到這種預(yù)期效應(yīng)而不改變引物的序列。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，一個或多個上述目的通過本發(fā)明的實施方案滿足。本發(fā)明的第一個方面是用于測定具有生物學(xué)材料的液體樣品中細(xì)菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括以下步驟(a)處理樣品且純化來自經(jīng)處理的樣品的核酸，隨后為(b)形成用于基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)的組合物(反應(yīng)混合物)，該組合物包括-根據(jù)SEQ IDNO 1的第一種引物、-根據(jù)SEQ ID NO 2的第二種引物，和_步驟(a)的純化核酸或其測量的部分作為模板；隨后為(c)用步驟(b)的組合物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)；隨后為(d)檢測擴(kuò)增的靶序列的存在或不存在，由此其中所述擴(kuò)增的靶序列的存在指示樣品中細(xì)菌污染物的存在，并且所述擴(kuò)增的靶序列的不存在指示樣品中細(xì)菌污染物的不存在；改良的特征在于相對于樣品的體積，將來自CHO細(xì)胞的預(yù)定量的DNA加入(i)樣品、或(ii)步驟(a)的經(jīng)處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的純化核酸、或(iv)步驟(b)的組合物中，由此所加入的來自CHO細(xì)胞的DNA減少步驟(d)中的非特異性擴(kuò)增。 本發(fā)明的第二個方面是包含來自含胚卵的羊膜液和來自CHO細(xì)胞的DNA的組合物。本發(fā)明的第三個方面是組合物，其包含(i)來自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來自真核細(xì)胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來自CHO細(xì)胞的DNA。本發(fā)明的第四個方面是根據(jù)本發(fā)明的組合物在用于擴(kuò)增來自從樣品中分離的DNA的原核污染物的DNA的方法中的用途，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來自真核細(xì)胞的懸液的上清液。本發(fā)明的第五個方面是試劑盒，其在分開的容器中包含(i)裂解試劑，(ii) 以預(yù)定濃度的來自CHO細(xì)胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNA，和(iii)根據(jù)SEQ IDNO 1的第一種引物和根據(jù)SEQ ID NO :2的第二種引物。本發(fā)明的第六個方面是用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改良方法，其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸形成具有范圍為約IOObp-約1500bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR 中形成來自第一種模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述PCR在預(yù)定條件(R)下在具有預(yù)定組合物的反應(yīng)混合物(Q)進(jìn)行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對在相同條件 (R)下在反應(yīng)混合物⑴)中不形成來自第二種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中在所述第二種模板中， 不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，該改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA ； (c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ； (d)在所述反應(yīng)混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(c)的所述第三種模板、和(b)的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進(jìn)行PCR;其中非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成被抑制。發(fā)明詳述在本發(fā)明的說明書中，某些術(shù)語以特定含義使用，或首次得到定義。為了本發(fā)明的目的，使用的術(shù)語通過其領(lǐng)域公認(rèn)的定義進(jìn)行定義，當(dāng)存在此類情況時，除這些定義與下文所述的定義沖突或部分沖突外。在定義中沖突的情況下，術(shù)語的含義首先通過下文所述的任何定義進(jìn)行定義。術(shù)語“包含”在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求中用于意指“包括但不一定限于”。
冠詞“a”和“an”在本文中用于指冠詞的一個或超過一個(即至少一個)語法目標(biāo)。例如，“微生物”意指一種微生物或超過一種微生物。當(dāng)指定數(shù)值范圍例如濃度范圍時，范圍可以通過單詞“在......之間”指示，隨后
為第一個值Ii1、單詞“和”和第二個值n2。此外，指定范圍可以通過表達(dá)“在Ii1-Ii2的范圍中” 指示。如果沒有另外說明，那么當(dāng)指示指定范圍時，指定范圍的較低邊界應(yīng)理解為該值等于或高于第一個值。指定范圍的較高邊界應(yīng)理解為該值等于或小于第二個值”。因此，在指定范圍中的值χ通過Ii1彡χ彡n2給出。此外，應(yīng)當(dāng)理解與數(shù)值η組合的術(shù)語“約”指示在通過該值的數(shù)值士5%給出的間隔中的值X，即η-ο. 05*η彡χ彡η+0. 05*η。在與數(shù)值η組合的術(shù)語“約”描述本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案的情況下，如果沒有另外說明，那么η的值是最優(yōu)選的。如本文使用的，術(shù)語“樣品”指復(fù)雜樣品，更優(yōu)選生物學(xué)樣品，即具有生物學(xué)材料的樣品。樣品可以含有希望與生物學(xué)材料中包含的核酸分離的多種有機和無機化合物。術(shù)語 “樣品”還涵蓋含有衍生自其他來源的核酸的水溶液，例如來自化學(xué)或酶促反應(yīng)混合物，或來自生物學(xué)樣品材料的先前純化。從其中純化核酸的術(shù)語生物學(xué)樣品涵蓋包含病毒或細(xì)菌細(xì)胞的樣品，以及來自多細(xì)胞生物的分離細(xì)胞例如人和動物細(xì)胞，以及組織的原始培養(yǎng)物和細(xì)胞系的培養(yǎng)物，以及其上清液和沖洗。本發(fā)明還涵蓋生物學(xué)樣品例如來自人或動物體的流體。特別地，樣品可以是全血、血液血清、血液血漿、大腦流體、唾液、糞便、活組織檢查標(biāo)本、骨髓、經(jīng)口沖洗、組織、尿及其混合物。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選樣品是“液體樣品”，即樣品處于流動狀態(tài)，并且樣品流體包含水和生物學(xué)材料。生物學(xué)材料優(yōu)選包含細(xì)胞或細(xì)胞組分。非常優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的液體樣品選自細(xì)胞培養(yǎng)上清液、培養(yǎng)細(xì)胞的懸液和羊膜液。更加優(yōu)選的，羊膜液來自含胚禽類卵。為了本發(fā)明的目的，與“液體樣品”組合的術(shù)語“處理”或“經(jīng)處理的”含義是通過加入一種或多種化合物，并且使一種或多種化合物與液體樣品混合來處理樣品，從而得到 “經(jīng)處理的樣品”?？梢杂糜诖祟愄幚淼膬?yōu)選化合物選自去垢劑、表面活性劑、有機溶劑、離液劑、蛋白酶和核酸酶抑制備物。根據(jù)本發(fā)明的“離液劑”是擾亂液態(tài)水的有序結(jié)構(gòu)的任何化學(xué)物質(zhì)。離液劑還促進(jìn)蛋白質(zhì)的解折疊、延伸和解離(Dandliker，W.，B.和de Saussure, V. , A. , In :The Chemistry of Biosurfaces, Hair, Μ. , L.,編輯，Marcel Dekker, Inc. New York (1971)第 18 頁)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選經(jīng)處理的樣品是裂解物。“裂解物，，或“裂解樣品”可以得自包含細(xì)胞(a comprising cells)，優(yōu)選微生物細(xì)胞，和非常優(yōu)選的細(xì)菌細(xì)胞，其中存在的細(xì)胞的大量部分的結(jié)構(gòu)完整性被破壞。為此，如果存在，那么細(xì)胞壁必須被破壞。為了釋放被破壞的細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)容物，用某些試劑處理材料，以崩解、使得多孔、溶解、降解或變性微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁。此外，細(xì)胞膜必須被破壞。為了釋放細(xì)胞、組織或更一般地來自生物學(xué)樣品中包含的顆粒的內(nèi)容物，材料可以用酶或用化學(xué)制品進(jìn)行處理，溶解、降解或變性此類生物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。在任何此類情況下，裂解(“裂解的”)過程還將破壞細(xì)菌污染物的結(jié)構(gòu)完整性，從而釋放污染物的核酸。對于裂解過程，當(dāng)核酸在該過程中釋放時，通常使用離液劑例如胍鹽和/或陰離子、陽離子、兩性離子或非離子型去污劑。使用快速降解具有溶核活性的酶和其他不需要的蛋白質(zhì)的蛋白酶也是有利的。在殘留微粒即在裂解過程后樣品材料的未溶解物質(zhì)的情況下，粒性物質(zhì)可以與裂解物分開，以導(dǎo)致澄清的裂解物。這可以例如通過過濾或離心完成。 因此，術(shù)語“裂解物”涵蓋澄清裂解液。來自經(jīng)處理的樣品的“核酸的純化”可以使用其為標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的廣泛多樣的方法完成。這些可以包括例如使用醇從水溶液中沉淀核酸(用乙醇或異丙醇的沉淀是本領(lǐng)域眾所周知的)和沉淀物的分離。其他方法包括核酸吸附到固相(例如具有氧化表面例如二氧化硅)上，分離固相，隨后為從固相中洗脫核酸。“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“PCR”)是用于擴(kuò)增特定靶DNA序列的單個或少數(shù)拷貝跨越幾個數(shù)量級的技術(shù)，其中生成DNA序列的拷貝。PCR依賴于熱循環(huán)，由反應(yīng)混合物的反復(fù)加熱和冷卻循環(huán)組成，從而實現(xiàn)DNA解鏈和DNA的酶促復(fù)制。含有與靶DNA序列互補的序列的引物(DNA寡核苷酸)連同DNA聚合酶一起是致使選擇性和反復(fù)擴(kuò)增成為可能的關(guān)鍵組分。隨著PCR進(jìn)展，生成的DNA自身用作模板用于復(fù)制，啟動其中DNA模板指數(shù)擴(kuò)增的鏈反應(yīng)。在這點上的“反應(yīng)混合物”包含DNA聚合酶、dNTP、離子、緩沖液和實現(xiàn)與靶DNA序列雜交(退火)的引物延伸所需的所有其他化合物。本發(fā)明人已得出結(jié)論在由ElderingJ. A·，等人(同上)公開的方法中，對于測定細(xì)菌污染物的存在或不存在關(guān)鍵的PCR條件是對于CHO (中國倉鼠卵巢)細(xì)胞培養(yǎng)和/或培養(yǎng)上清液專一地最佳化的。此外，本發(fā)明人已觀察到根據(jù)SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引物對偶然產(chǎn)生無關(guān)擴(kuò)增或人工產(chǎn)物(即對于大小不同于所需靶DNA片段的片段的非特異性擴(kuò)增)。這特別是當(dāng)從來自衍生自其他動物物種或人的細(xì)胞培養(yǎng)的樣品材料制備的DNA 用作模板時的情況。在此類設(shè)置中，本發(fā)明基于其上的基礎(chǔ)觀察是當(dāng)PCR在CHO細(xì)胞DNA 的存在下進(jìn)行時，PCR人工產(chǎn)物的形成可以被抑制。然而，這種所需技術(shù)效應(yīng)要求CHO細(xì)胞 DNA不含由細(xì)菌DNA的污染，所述細(xì)菌DNA可以通過所述引物對擴(kuò)增。因此，以最廣泛的含義，本發(fā)明的第一個方面是用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改良方法，其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸(PCR)形成具有范圍為約IOObp-約1500bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物各自與一種或多種原核生物的 16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR中形成來自第一種模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物， 所述PCR在預(yù)定條件(R)下在具有預(yù)定組合物的反應(yīng)混合物(Q)進(jìn)行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對在相同條件(R)下在反應(yīng)混合物⑴) 中不形成來自第二種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，該改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA ；(c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(d)在反應(yīng)混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(C)的所述第三種模板、和(b) 的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進(jìn)行PCR;
其中非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成被抑制。在本發(fā)明的背景中，PCR的條件(R)反映參數(shù)包括溫度方案、孵育時間、PCR循環(huán)數(shù)目和PCR領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他物理參數(shù)。反應(yīng)混合物(Q)包含PCR過程與之一起進(jìn)行的最終混合物的所有組分，包括引物延伸所需的所有化合物。反應(yīng)混合物(Q)還包括各自以其分別的預(yù)定濃度的引物對。為了明確起見，以這種意義的反應(yīng)混合物(Q)不包含分開添加的模板DNA。模板DNA這樣加入，使得在最終混合物(即在模板DNA的添加后)中，所有其他組分的濃度是等同的，不管使用何種模板。根據(jù)本發(fā)明，含有另一種生物而不是CHO細(xì)胞的基因組DNA的模板另外必須含有以測量的量即以預(yù)定濃度的CHO細(xì)胞DNA。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸對與多個原核物種雜交，并且0-3個錯配可能在引物與其16S-rRNA基因的靶區(qū)域的雜交中發(fā)生。在任何此類情況下，任何錯配 (如果存在的話)排除末端核苷酸，提供分別寡核苷酸的3’ -OH基團(tuán)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述一種或多種原核生物是選自柔膜體綱物種、芽孢桿菌屬(Bacillus)物種、梭菌屬物種、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)物種、微球菌屬(Micrococcus)物種、葡萄球菌屬Staphylococcus)物種和鏈球菌屬 Streptococcus)物種的物種。更加優(yōu)選的，物種是柔膜體綱物種。更加優(yōu)選的，物種是支原體屬物種，更加優(yōu)選的，物種選自豬鼻支原體(M. hyorhinis)、精氨酸支原體(M. arginini)、肺炎支原體、發(fā)酵支原體(M. fermentans)、口腔支原體(M. orale) 和梨形支原體(M.pirum)，或物種是無膽甾原體屬(Achol印lasma)物種，更加優(yōu)選萊氏無膽甾原體(Achol印lasma laidlawii)，或物種是螺原體屬物種，更加優(yōu)選非凡螺原體 (Spiroplasma mirium)。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述第一種真核生物是CHO細(xì)胞或包含多個CHO細(xì)胞的培養(yǎng)物。更加優(yōu)選的，所述引物對包含SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2之一，
或兩者。在本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案中，條件(R)和反應(yīng)混合物(Q)是在 MYC0T00L測試試劑盒的手冊中描述的通過Roche Diagnostics GmbH, Mannheim(德國) MYC0T00L 測定。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實施方案在下述項目列表中給出1.用于測定液體樣品中細(xì)菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括以下步驟(a)處理樣品且純化來自經(jīng)處理的樣品的核酸，隨后為(b)形成用于基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)的組合物，該組合物包括-根據(jù)SEQID NO 1的第一種引物、-根據(jù)SEQID NO 2的第二種引物，和-步驟(a)的純化核酸或其測量的部分作為模板；隨后為(c)用步驟(b)的組合物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，由此擴(kuò)增原核16S-rRNA基因中包含的靶序列，如果存在于模板中的話；隨后為(d)檢測擴(kuò)增的靶序列的存在或不存在，由此所述擴(kuò)增的靶序列的存在指示樣品中細(xì)菌污染物的存在，并且所述擴(kuò)增的靶序列的不存在指示樣品中細(xì)菌污染物的不存在；
改良的特征在于相對于樣品的體積，將來自CHO細(xì)胞的預(yù)定量的DNA加入(i)樣品、或(ii)步驟(a)的經(jīng)處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的純化核酸、或(iv)步驟(b)的組合物中，由此所加入的來自CHO細(xì)胞的DNA減少步驟(d)中的非特異性擴(kuò)增。2.項目1的方法，其特征在于每ml液體樣品的預(yù)定量DNA是來自約5xl06個CHO 細(xì)胞的DNA含量。3.根據(jù)項目1和2中任一項的方法，其特征在于所述液體樣品選自具有培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基、無細(xì)胞的培養(yǎng)上清液和羊膜液。4.根據(jù)項目3的方法，其特征在于所述液體樣品是羊膜液。5.根據(jù)項目4的方法，其特征在于所述羊膜液來自含胚卵。6.根據(jù)項目1-5中任一項的方法，其特征在于所述細(xì)菌污染物是選自無膽留原體屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、支原體屬、螺原體屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的屬。7.根據(jù)項目6的方法，其特征在于所述細(xì)菌污染物是選自豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發(fā)酵支原體、口腔支原體和梨形支原體的支原體屬物種，或所述細(xì)菌污染物是萊氏無膽留原體，或所述細(xì)菌污染物是非凡螺原體。8.組合物，其包含來自含胚卵的羊膜液和來自CHO細(xì)胞的DNA。9.根據(jù)任何項目8的組合物，其進(jìn)一步包含選自離液劑和蛋白酶的裂解試劑。10.組合物，其包含(i)來自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來自真核細(xì)胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來自CHO細(xì)胞的DNA。11.根據(jù)項目10的組合物，其進(jìn)一步包含根據(jù)SEQ ID NO 1的第一種引物、根據(jù) SEQ ID NO :2的第二種引物、核苷酸三磷酸和耐熱的DNA聚合酶。12.根據(jù)項目11的組合物，其進(jìn)一步包含嵌入染料。13.試劑盒，其在分開的容器中包含⑴裂解試劑，(ii)以預(yù)定濃度的來自CHO細(xì)胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNAJP (iii)根據(jù)SEQ ID NO 1的第一種引物和根據(jù)SEQ ID NO 2的第二種引物。14.根據(jù)項目10-12中任一項的組合物用于擴(kuò)增原核污染物的DNA的用途，所述原核污染物的DNA來自從樣品中分離的DNA，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來自真核細(xì)胞的懸液的上清液。15.用于進(jìn)行改良聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改良方法，其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸形成具有范圍為約IOObp-約 1500bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR(P)中形成來自第一種模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述PCR(P)在預(yù)定條件(R)下在具有預(yù)定組合物的反應(yīng)混合物(Q)進(jìn)行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，并且其中在P中，所述寡核苷酸引物對在相同條件(R)下在反應(yīng)混合物⑴)中不形成來自第二種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA，所述改良方法包括以下步驟
(a)提供所述寡核苷酸引物對和所述第一種真核生物的基因組DNA ；(b)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(c)在所述反應(yīng)混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(d)的所述第三種模板、和所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進(jìn)行PCR;其中非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成被抑制。序列表描述SEQ ID NO 1用于檢測支原體屬和相關(guān)物種的通用引物(正向)；先前公開于 Wong-Lee, J. G.禾口 Lovett, Μ. , "Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture，，中Diagnostic molecular microbiology-principles and applications ；Persing, DH, Smith, TF, Tenover, FC, White, TJ (編輯)Washington，DC, American Society for Microbiology (1993) 257-260, 和 Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193。SEQ ID NO :2用于檢測支原體屬和相關(guān)物種的通用引物(反向)；先前公開于 Wong-Lee, J. G.，等人(同上)和 Eldering, J. A.，等人(同上)中。SEQ ID NO 3對于甘油醛3_磷酸脫氫酶基因中的靶序列(對照序列)特異的正向引物。SEQ ID NO 4對于甘油醛3_磷酸脫氫酶基因中的靶序列(對照序列)特異的反向引物。附圖描述

圖1泳道注釋/稀釋度1-5GAPDH對照PCR ；從MDCK細(xì)胞中分離的DNA，無CHO細(xì)胞DNA，用萊氏無膽甾原體DNA摻加1未稀釋的2 KT13 10 24 10 35 10 46大小標(biāo)記(50bp間隔(st印s))7-1IGAPDH對照PCR ；從MDCK細(xì)胞中分離的DNA，無CHO細(xì)胞DNA，未摻加7 KT18 10 29 IO 310 1(Γ411大小標(biāo)記(50bp間隔)圖2泳道注釋/稀釋度1-5GAPDH對照PCR ；從MDCK細(xì)胞中分離的DNA，加入CHO細(xì)胞DNA，用萊氏無膽甾原體DNA摻加1未稀釋的
2 KT13 IO 24 IO 35 IO 46大小標(biāo)記(50bp間隔)7-11 GAPDH對照PCR ；從MDCK細(xì)胞中分離的DNA，加入CHO細(xì)胞DNA，未摻加7 KT18 1(Γ29 IO 310 1(Γ411大小標(biāo)記(50bp間隔)圖3泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2中的引物；從ASC分離的DNA，用口腔支原體 DNA摻加，無CHO細(xì)胞DNA1-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；用8個獨立抽取的等分試樣的PCR6條帶的大小與對于特定靶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物觀察到的大小范圍一致圖4泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2中的引物；從ASC中分離的DNA，用口腔支原體DNA摻加，含加入的CHO細(xì)胞DNA1-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；用8個獨立抽取的等分試樣的PCR9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩沖液的PCR( “無模板”對
昭)13大小標(biāo)記(50bp間隔)圖5泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Tris 緩沖液，無CHO細(xì)胞DNAl_40cfu萊氏無膽甾原體DNA5_81cfu萊氏無膽甾原體DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，未摻加，無CHO細(xì)胞DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，陽性對照質(zhì)粒的約10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無CHO細(xì)胞DNA15大小標(biāo)記(50bp間隔)圖6泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Tris 緩沖液，含加入的CHO細(xì)胞DNAl_410cfu萊氏無膽甾原體DNA5_81cfu萊氏無膽甾原體DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，未摻加，含加入的CHO細(xì)胞DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，陽性對照質(zhì)粒的約10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，含加入的CHO細(xì)胞DNA15大小標(biāo)記(50bp間隔)圖7泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Vero 細(xì)胞懸液，無CHO細(xì)胞DNAl_410cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Vero細(xì)胞懸液，未摻加，無CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩沖液，陽性對照質(zhì)粒的約 10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無CHO細(xì)胞DNA11，12如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩沖液的PCR( “無模板”對
昭)13大小標(biāo)記(50bp間隔)圖8泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Vero 細(xì)胞懸液，含加入的CHO細(xì)胞DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2中的引物；Vero細(xì)胞懸液，未摻加，含加入的 CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩沖液，陽性對照質(zhì)粒的約 10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，含加入的CHO細(xì)胞DNA11，12如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩沖液的PCR( “無模板”對
昭)13大小標(biāo)記(50bp間隔)圖9泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體“接種”的尿囊液，無CHO細(xì)胞DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的，無CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩沖液，陽性對照質(zhì)粒的約 10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無CHO細(xì)胞DNA11大小標(biāo)記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物移動的凝膠區(qū)域圖10泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體“接種”的尿囊液，2. 5 μ g/50 μ 1 CHO 細(xì)胞 DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA
5-8 如 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 中的引物；尿囊液，未接種的，2. 5 μ g/50 μ 1 CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2中的引物；Tris緩沖液，陽性對照質(zhì)粒的約 10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無CHO細(xì)胞DNA11大小標(biāo)記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物移動的凝膠區(qū)域圖11泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體“接種”的尿囊液，5 μ g/50 μ 1 CHO 細(xì)胞 DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO 1禾口 SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的， 5 μ μ g/50 μ ICHO 細(xì)胞 DNA9，10如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩沖液的PCR( “無模板”對
昭)11大小標(biāo)記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物移動的凝膠區(qū)域圖12泳道注釋/稀釋度1-4如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體“接種”的尿囊液，10 μ g/50 μ 1 CHO 細(xì)胞 DNAl_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；尿囊液，未接種的，10 μ g/50 μ 1 CHO細(xì)胞DNA9，10如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用緩沖液的PCR( “無模板”對
昭)11大小標(biāo)記(50bp間隔)箭頭指出其中非特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物移動的凝膠區(qū)域5圖13泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；用萊氏無膽甾原體DNA摻加的Tris 緩沖液l-43cfu萊氏無膽甾原體DNA，無小牛胸腺DNA5-8Icfu萊氏無膽甾原體DNA，含加入的小牛胸腺DNA9-12如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2中的引物；未摻加的Tris緩沖液，含加入的小牛胸腺DNA13，14如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，陽性對照質(zhì)粒的約10個拷貝(MYC0T00L試劑盒的部分)/PCR反應(yīng)混合物，無小牛胸腺DNA15大小標(biāo)記(50bp間隔)圖14泳道注釋/稀釋度1-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用萊氏無膽甾原體“接種”的尿囊液，含加入的小牛胸腺DNA
l_43cfu萊氏無膽甾原體DNA5-8如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；尿囊液，未接種的，含加入的小牛胸腺DNA9-12如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中的引物；Tris緩沖液，無接種物，含加入的小牛胸腺DNA13，14如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中的引物；用緩沖液的PCR( “無模板”對
昭)15大小標(biāo)記(50bp間隔)實施例1MYC0T00L試劑盒和測定MYC0T00L PCR支原體檢測試劑盒是對于屬于柔膜體綱的細(xì)菌檢測最佳化的體外核酸擴(kuò)增測試。這些包括豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發(fā)酵支原體、口腔支原體、梨形支原體、唾液支原體(M. salivarum)、人型支原體(M. hominis)、滑液囊支原體 (M. synoviae)、非凡螺原體、檸檬螺原體(S. citri)和萊氏無膽甾原體。MycoTool試劑盒包含2個亞試劑盒(subkits)亞試劑盒1 ( "Detection Prep Kit" ；Roche Applied Science 目錄號 05184592001)和亞試劑盒 2 ( “Detection Amplification Kit" ；Roche Applied Science 目錄號 05184240001)。試劑盒確切地根據(jù)制造商的說明書使用。如果沒有另外說明，那么通過下述裂解選自(i)細(xì)胞培養(yǎng)上清液、(ii)培養(yǎng)細(xì)胞的懸液和(iii)羊膜液的液體樣品加入含有胍鹽和蛋白酶K的水性緩沖液，將緩沖液與樣品混合，且孵育混合物以實現(xiàn)裂解。在裂解后，一般將10-250 μ g/lml樣品CHO細(xì)胞DNA加入裂解物中且混合。CHO細(xì)胞DNA不含如分開測試的任何污染原核DNA。隨后，通過加入醇從混合物中沉淀核酸。通過離心回收沉淀物，用70%乙醇洗滌且干燥。將干燥的團(tuán)塊溶解于預(yù)先制備的緩沖液中且實施PCR分析。作為內(nèi)部對照，MYC0T00L試劑盒還包括用于GAPDH持家基因的引物對。在PCR擴(kuò)增前，通過應(yīng)用尿嘧啶-N-糖基化酶(試劑盒的組分)減少擴(kuò)增子污染的危險。在下文每個實施例中，根據(jù)通過制造商的說明書確切地進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行電泳。條帶用RES0LIGHT化合物和UV照明進(jìn)行顯現(xiàn)，條帶檢測在520nm。用于檢測柔膜體綱的MYC0T00L試劑盒的引物是SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的那些引物。還提供了對于GAPDH特異的對照引物(SEQID NO 3禾P SEQ ID NO :4)。每個MYC0T00L試劑盒進(jìn)一步包含含有支原體屬DNA的對照質(zhì)粒，然而，產(chǎn)生具有與由分離的細(xì)菌DNA(陽性對照)擴(kuò)增的PCR片段相比較可區(qū)分的不同大小的PCR片段。為此,參考 Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193，其公開了質(zhì)粒。實施例2用于樣品摻加的來自柔膜體綱物種的DNA在本實施例中使用的所有樣品來自不含原核污染物的培養(yǎng)物。
代替由柔膜體綱物種感染的樣品材料，由萊氏無膽留原體或口腔支原體制備的 DNA在裂解前被摻加到樣品材料，或被摻加到由樣品材料制備的分離的DNA中(如果沒有另外說明)。為了摻加的目的，由萊氏無膽甾原體(ATCC27556)和口腔支原體(ATCC23714)的參考培養(yǎng)物(標(biāo)準(zhǔn)條件)制備DNA。對于每種培養(yǎng)物，測定表示為菌落形成單位(cfu)的細(xì)胞滴度。應(yīng)用的摻加的DNA的數(shù)量反映對于由其制備DNA的各自培養(yǎng)物測定的cfu數(shù)目。如上所述的柔膜細(xì)菌DNA用于下文描述的摻加實驗中。由柔膜體綱DNA擴(kuò)增的一般特定PCR片段(特異性擴(kuò)增產(chǎn)物)的大小在約430-470bp的范圍中。實施例3在來自MDCK細(xì)胞培養(yǎng)(懸浮細(xì)胞)的樣品中GAPDH基因組靶序列的檢測使用不含任何原核生物且具有0，79 · IO6細(xì)胞/ml的細(xì)胞滴度的MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)物。將萊氏無膽甾原體DNA以3個菌落形成單位(cfu)/lml樣品的濃度加入樣品中。如 MYC0T00L試劑盒(還參見實施例1)的指導(dǎo)手冊中說明的，從摻加的樣品材料中分離核酸。 制備2種不同核酸制備物，第一種不含CHO細(xì)胞DNA的添加，第二種含加入樣品材料中的 CHO 細(xì)胞 DNA (50mg/lml 樣品)。然而，進(jìn)行不摻加萊氏無膽留原體DNA的樣品的重復(fù)制備。再次，制備含或不含 CHO細(xì)胞DNA的核酸。在TE緩沖液中制備DNA制備物的幾個稀釋度。根據(jù)MYC0T00L指導(dǎo)手冊，對每個稀釋度的等分試樣實施GAPDH特異性PCR。圖1和2顯示具有指出獲得的PCR產(chǎn)物的條帶的凝膠。圖1描述了不含加入的 CHO細(xì)胞DNA而獲得的結(jié)果，圖2顯示了含加入的CHO細(xì)胞DNA的PCR產(chǎn)物?？梢悦鞔_觀察到含加入的CHO DNA,即使當(dāng)用10_4稀釋度進(jìn)行PCR時，GAPDH對照條帶也是可檢測的。實施例4在來自脂肪干細(xì)胞(ASC)的細(xì)胞上清液的摻加的樣品中原核DNA的16S_rRNA互補體中靶序列的檢測通過離心沉積不含任何原核生物的ASC。如MYC0T00L試劑盒的指導(dǎo)手冊中說明的 (還參見實施例1)，澄清上清液(細(xì)胞培養(yǎng)基)用于DNA分離。在裂解步驟之前，將口腔支原體DNA以3個菌落形成單位(cfu)/lml樣品的濃度加入樣品中。隨后將樣品分成2個相等體積。向一個等分試樣中加入以100mg/lml上清液濃度的CHO細(xì)胞DNA。從2個等分試樣中分開地分離總DNA。用每種DNA制備物的等分試樣進(jìn)行幾次PCR反應(yīng)。圖3和4顯示通過PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物和在電泳泳動后的DNA片段的凝膠。明確地，CHO細(xì)胞DNA的添加使得MYC0T00L測試更有效(robust)，因為支原體屬 DNA在測試的所有摻加的樣品中檢測到。另一方面，不含CHO細(xì)胞DNA，8次PCR反應(yīng)中僅1 次成功擴(kuò)增對于支原體屬靶DNA特異的片段。在其中不存在CHO細(xì)胞DNA的情況下，可以看出(圖3)非特異性PCR片段基本上不存在(圖3中的泳道1是可能的例外)。這強調(diào)本發(fā)明人的PCR人工產(chǎn)物通常不通過 MYC0T00L測定產(chǎn)生的觀察。有趣的是，CHO細(xì)胞DNA的添加還不導(dǎo)致如在圖4中可以看出的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。實施例5
在摻加的水性緩沖液中原核DNA的16S_rRNA互補體中靶序列的檢測不含任何污染物的IOmM TrisHCl緩沖液pH7. 5用萊氏無膽甾原體DNA以1或 10cfu/lml緩沖液的濃度進(jìn)行摻加。摻加和未摻加的緩沖液與CHO細(xì)胞DNA混合，以獲得 80 μ g/lml緩沖液的濃度。此外，制備不含CHO細(xì)胞DNA的摻加和未摻加的緩沖液。根據(jù) MYCOTOOL方案，從每種摻加和未摻加的制備物來制備DNA。用每種DNA制備物的等分試樣進(jìn)行幾次PCR反應(yīng)。此外，用含有其為MYCOTOOL試劑盒的一部分(陽性對照)的對照質(zhì)粒的約10個拷貝的Tris緩沖液的等分試樣進(jìn)行PCR。圖5和6顯示具有通過PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物和在電泳泳動后的DNA片段的凝膠。雖然PCR檢測對應(yīng)于IOcfu的萊氏無膽甾原體DNA沒有問題，但I(xiàn)cfu的檢測在 CHO細(xì)胞DNA的存在下得到顯著改善。具有陽性對照質(zhì)粒的泳道舉例說明與萊氏無膽留原體靶序列的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物比較的可區(qū)分的大小差異。實施例6 在來自培養(yǎng)的Vero細(xì)胞培養(yǎng)(懸浮細(xì)胞)的摻加樣品中原核DNA的16S_rRNA互補體中靶序列的檢測向具有來自不含任何原核生物的培養(yǎng)物在IO5-IO6細(xì)胞/ml范圍中的細(xì)胞滴度的Vero細(xì)胞懸液中以3或lOcfu/lml細(xì)胞懸液的濃度摻加萊氏無膽留原體或口腔支原體DNA。向用3cfu/mlCH0細(xì)胞DNA摻加的培養(yǎng)物中，加入以10、30、50、70、85、100和 150 μ g/lml細(xì)胞懸液濃度的DNA。根據(jù)MYCOTOOL方案，由每種摻加的懸液以及僅Vero細(xì)胞的未摻加的懸液制備 DNA。用每種DNA制備物的等分試樣進(jìn)行幾次PCR反應(yīng)。此外，用含有其為MYCOTOOL試劑盒的一部分(陽性對照)的對照質(zhì)粒的約10個拷貝的Tris緩沖液(IOmM TrisHCl緩沖液 PH7.5)的等分試樣進(jìn)行PCR。圖7和8顯示具有通過PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物和在電泳泳動后的DNA片段的凝膠。圖8中所示的樣品含有以150 μ g/lml細(xì)胞懸液的濃度的CHO細(xì)胞 DNA。當(dāng)使用10、30、50、70、85和100 μ gCHO細(xì)胞DNA/Iml細(xì)胞懸液的濃度時，獲得可比較的結(jié)果。值得注意的是，在不存在CHO細(xì)胞DNA的情況下獲得某些非特異性(人工產(chǎn)物) PCR產(chǎn)物(參見圖7)。注意到在某些情況下這些人工產(chǎn)物條帶的大小與特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的大小的相似性(圖7中的泳道1-4)。令人驚訝的是，在CHO細(xì)胞DNA的存在下沒有產(chǎn)生非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖8，泳道1-4)。實施例7在來自含胚雞卵的尿囊液的“接種”樣品中原核DNA的16S-rRNA互補體中靶序列的檢測不含支原體污染的尿囊液從用病毒疫苗株接種的含胚雞卵(9-11天)中收獲。用TE緩沖液1 1，000稀釋具有2.45xl03cfu滴度的萊氏無膽留原體的液體培養(yǎng)物。用尿囊液1 10稀釋這個稀釋度的等分試樣。加入這種1 10，000接種物的12. 2μ1 體積/Iml尿囊液，以獲得3cfu/lml接種的尿囊液的等價滴度。對接種的尿囊液實施DNA 分離而無進(jìn)一步孵育，即細(xì)菌不允許在尿囊液中生長。提供了 4種不同樣品(i)不含CHO細(xì)胞DNA的接種的尿囊液，(ii)不含CHO細(xì)
17胞DNA的非接種的尿囊液，(iii)含加入的CHO細(xì)胞DNA的接種的尿囊液，和(iv)含加入的CHO細(xì)胞DNA的非接種的尿囊液。在(iii)和(iv)的樣品中，CHO細(xì)胞DNA的濃度是 208mg/lml 尿囊液。根據(jù)MYC0T00L方案，由每種接種和非接種的樣品(i_iv)制備DNA。用每種DNA制備物的等分試樣進(jìn)行幾次PCR反應(yīng)。此外，用含有其為MYC0T00L試劑盒的一部分(陽性對照)的對照質(zhì)粒的約10個拷貝的Tris緩沖液(IOmM TrisHCl緩沖液pH7. 5)的等分試樣進(jìn)行PCR。再次，可以驗證下述效應(yīng)CH0細(xì)胞DNA的存在(a)抑制非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和 (b)增加PCR檢測的靈敏度。實施例8在來自含胚雞卵的尿囊液的“接種”樣品中原核DNA的16S-rRNA互補體中靶序列的檢測，其中將不同濃度的CHO細(xì)胞DNA加入PCR反應(yīng)混合物中如實施例7中所述的進(jìn)行實驗，除在DNA純化前不加入CHO細(xì)胞DNA。相反，在起始PCR之前，將CHO細(xì)胞DNA加入反應(yīng)混合物中。在反應(yīng)混合物中CHO細(xì)胞DNA的濃度是 0、2. 5、5和10 μ g/50 μ 1 (PCR反應(yīng)混合物的體積)。這對應(yīng)于最終反應(yīng)混合物中的Oyg/ μ 1、0. 05μ g/μ 1、0. 1 μ g/μ 1和0. 2μ g/μ 1，即僅在起始PCR反應(yīng)前的反應(yīng)混合物。圖 9-12顯示結(jié)果。實施例9在摻加的水性緩沖液中原核DNA的16S_rRNA互補體中靶序列的檢測如實施例5中所述的進(jìn)行實驗，除萊氏無膽甾原體DNA的濃度是3cfu/lml緩沖液夕卜，并且代替CHO細(xì)胞DNA，在DNA純化前加入以200 μ g/lml緩沖液的濃度的小牛胸腺。圖 13顯示結(jié)果。值得注意的是，在小牛胸腺DNA的存在下生成的PCR片段顯示大小中的某些變動， 不像在CHO細(xì)胞DNA的存在下產(chǎn)生的片段，例如圖6中所示的那些(具體地)。因此，小牛胸腺DNA不適合于抑制PCR人工產(chǎn)物的形成。考慮到這些結(jié)果，得出結(jié)論CHO細(xì)胞DNA而不是小牛胸腺DNA(和其他真核基因組DNA)的能力可以提供所需效應(yīng)， 原因在于最初基于SEQ IDNO :1和SEQ ID NO 2的引物的MYC0T00L PCR適合于CHO細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)上清液的事實。在做出最佳化時，CHO細(xì)胞的基因組DNA提供對于引物看起來是有利的“本底”并不顯而易見，因為“本底”看起來抑制人工產(chǎn)物的形成。來自其他物種的基因組DNA在組成中是不同的，并且看起來不能抑制非特異性人工產(chǎn)物的形成(或在實現(xiàn)這點時較不有效)。實施例10在來自含胚雞卵的尿囊液的“接種”樣品中原核DNA的16S-rRNA互補體中靶序列的檢測，其中添加小牛胸腺DNA如實施例7中所述的進(jìn)行實驗，除代替CHO細(xì)胞DNA，在DNA純化前加入小牛胸腺外。提供了 4種不同樣品(i)不含小牛胸腺DNA的接種的尿囊液，(ii)不含小牛胸腺DNA的非接種的尿囊液，(iii)含加入的小牛胸腺DNA的接種的尿囊液，和(iv)含加入的小牛胸腺DNA的非接種的尿囊液。在(iii)和(iv)的樣品中，小牛胸腺DNA的濃度是200mg/lml 尿囊液。 圖14顯示結(jié)果。基本上，結(jié)論與實施例9相似。再次，與在CHO細(xì)胞DNA的存在下的PCR形成對比，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種用于測定具有生物學(xué)材料的樣品中細(xì)菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括步驟(a)處理所述樣品且純化來自所述經(jīng)處理的樣品的核酸，隨后為(b)形成用于基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)的組合物(反應(yīng)混合物)，所述組合物包括-根據(jù)SEQ ID NO 1的第一種引物、-根據(jù)SEQ ID NO 2的第二種引物，和-步驟(a)的所述純化核酸或其測量的部分作為模板；隨后為(c)用步驟(b)的所述組合物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；隨后為(d)檢測擴(kuò)增的靶序列的存在或不存在，其中所述擴(kuò)增的靶序列的存在指示所述樣品中所述細(xì)菌污染物的存在，并且所述擴(kuò)增的靶序列的不存在指示所述樣品中所述細(xì)菌污染物的不存在；所述改良的特征在于相對于所述樣品的體積，將來自CHO細(xì)胞的預(yù)定量的DNA加入(i) 所述樣品、或(ii)步驟(a)的所述經(jīng)處理的樣品、或(iii)在步驟(a)中獲得的所述純化核酸、或(iv)步驟(b)的所述組合物中，由此所加入的來自CHO細(xì)胞的DNA減少步驟(d) 中的非特異性擴(kuò)增。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于每ml液體樣品的DNA預(yù)定濃度在10yg/lml樣品-250 μ g/Iml樣品的范圍中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項的方法，其特征在于所述液體樣品選自具有培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基、無細(xì)胞的培養(yǎng)上清液和羊膜液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述液體樣品是羊膜液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述羊膜液來自含胚卵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其特征在于所述細(xì)菌污染物是選自無膽留原體屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、支原體屬、螺原體屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述細(xì)菌污染物是選自豬鼻支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、發(fā)酵支原體、口腔支原體和梨形支原體的支原體屬物種，或所述細(xì)菌污染物是萊氏無膽留原體，或所述細(xì)菌污染物是非凡螺原體。
8.一種組合物，其包含來自含胚卵的羊膜液和來自CHO細(xì)胞的DNA。
9.根據(jù)任何權(quán)利要求8的組合物，其進(jìn)一步包含選自離液劑和蛋白酶的裂解試劑。
10.一種組合物，其包含(i)來自樣品的純化核酸，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來自真核細(xì)胞的懸液的上清液，和(ii)不含原核DNA的來自CHO細(xì)胞的DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其進(jìn)一步包含根據(jù)SEQID NO :1的第一種引物、根據(jù) SEQ ID NO 2的第二種引物、核苷酸三磷酸和耐熱的DNA聚合酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其進(jìn)一步包含嵌入染料。
13.—種試劑盒，其在分開的容器中包含(i)裂解試劑，(ii)以預(yù)定濃度的來自CHO細(xì)胞的純化DNA，所述DNA不含原核DNAJP (iii)根據(jù)SEQ ID NO 1的第一種引物和根據(jù)SEQ ID NO 2的第二種引物。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項的組合物用于擴(kuò)增原核污染物的DNA的用途，所述原核污染物的DNA來自從樣品中分離的DNA，所述樣品選自羊膜液、真核細(xì)胞的懸液和來自真核細(xì)胞的懸液的上清液。
15. 一種用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的改良方法，其中通過DNA聚合酶催化的一對寡核苷酸引物延伸形成具有范圍為約IOObp-約 1500bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物各自與一種或多種原核生物的16S-rRNA的基因組互補體中包含的靶序列雜交，其中所述寡核苷酸引物對能夠在PCR中形成來自第一種模板的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，所述 PCR在預(yù)定條件(R)下在具有預(yù)定組合物的反應(yīng)混合物(Q)中進(jìn)行，并且所述第一種模板包含第一種真核生物的基因組DNA和所述一種或多種原核生物的基因組DNA，并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物對在相同條件(R)下在反應(yīng)混合物(Q)中不形成來自第二種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中在所述第二種模板中，不存在所述一種或多種原核生物的基因組DNA，但包含第一種真核生物的基因組DNA， 所述改良方法包括以下步驟(a)提供所述寡核苷酸引物對；(b)提供所述第一種真核生物的基因組DNA；(c)提供包含第二種真核生物的基因組DNA的第三種模板，所述第二種真核生物被懷疑含有所述一種或多種原核生物的基因組DNA ；(d)在所述反應(yīng)混合物(Q)中混合(a)的所述引物對、(c)的所述第三種模板、和(b) 的所述第一種真核生物的所述基因組DNA的測量的量，和在條件(R)下進(jìn)行PCR;其中非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的形成被抑制。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過抑制非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物改良的基于PCR的靶序列擴(kuò)增。改良涉及使用被最佳化以在第一種生物的基因組DNA的背景中擴(kuò)增污染物的核酸的引物對。當(dāng)對懷疑包含污染物的來自第二種生物的DNA實施相同的基于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)時，當(dāng)?shù)谝环N生物的基因組DNA的量存在于擴(kuò)增反應(yīng)中時，污染物的檢測靈敏度和特異性增強。
文檔編號C12Q1/68GK102471804SQ201080033520
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月1日
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