專利名稱：制備2-酮羧酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用發(fā)酵步驟來制備2-酮羧酸，特別是2-酮異戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的方法。
背景技術：
2-酮羧酸是用于制藥的化合物，并且用于合成除草劑和殺真菌劑。已知2-酮羧酸降低血漿中的LDL膽固醇、甘油三酯和自由基水平。特別地，2-酮異戊酸用作腎衰竭患者的食物補充劑。本領域中已知通過化學合成來制備2-酮羧酸，例如2-酮異戊酸(鹽)。例如，在以下兩步驟中通過化學合成制備2-酮異戊酸鹽使用CrO3將各自的2-羥基異戊酸乙酯氧化，隨后將該酯皂化以獲得2-酮異戊酸鹽。該方法存在使用高溫、有毒的CrO3和各種對環(huán)境有危險的溶劑的缺點。在生物合成中，2-酮羧酸是用于各自的氨基酸的直接前體例如2-酮異戊酸是氨基酸纈氨酸的直接前體。在微生物中，2-酮異戊酸鹽在細胞中產(chǎn)生并分泌至培養(yǎng)基中。 在現(xiàn)有技術中描述了 2-酮酸用作前體通過發(fā)酵來制備各自的氨基酸(GB 2，161，159 ；GB 2，147，579)。盡管文獻中已知微生物產(chǎn)生2-酮羧酸如2-酮異戊酸(鹽)，但目前沒有描述通過利用發(fā)酵以高純度制備和分離2-酮羧酸的方法，而僅提及2-酮羧酸作為制備氨基酸的中間產(chǎn)物或離析物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備2-酮羧酸，特別是2-酮異戊酸(鹽)、2_酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的方法，所述方法避免了化學合成的缺點。這一問題通過制備2-酮羧酸或其鹽的方法得到了解決，所述2-酮羧酸具有通式 (I)R1-CO-COOH,其中R1為具有3-7個碳原子的支鏈烷基，所述方法包括以下步驟a)發(fā)酵步驟，其中使微生物在培養(yǎng)基中生長以提供包含2-酮羧酸或其鹽的培養(yǎng)液(culture broth)；b)將步驟a)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液進行選自離子交換、提取過程和蒸餾過程的一個或多個步驟。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法包括以下步驟a)發(fā)酵步驟，其中使微生物在培養(yǎng)基中生長以提供包含2-酮羧酸或其鹽的培養(yǎng)液；b)將步驟a)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液進行離子交換；c)優(yōu)選地將步驟b)中獲得的流出物進行選自離子交換、提取或蒸餾的一個或多個進一步的純化步驟；d)優(yōu)選地將步驟C)中獲得的產(chǎn)物進行進一步濃縮、沉淀或結(jié)晶步驟或者它們的組合并獲得2-酮羧酸或其鹽。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法包括以下步驟a)發(fā)酵步驟，其中使微生物在培養(yǎng)基中生長以提供包含2-酮羧酸或其鹽的培養(yǎng)液；b)發(fā)酵培養(yǎng)液的初始pH變化(酸化至pH值為1)后，將步驟a)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液僅進行蒸餾過程(加入水進行蒸汽蒸餾直至蒸餾池完全蒸干(impoverishment))。該實施方案避免使用離子交換處理。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，利用這一步驟可以從發(fā)酵培養(yǎng)液中完全選擇性地除去酮酸，而其它有機酸則保留在蒸餾池中。在優(yōu)選的方法中，2-酮羧酸是具有通式R1-CO-COOH的化合物或其鹽，其中R1是具有3、4或5個碳原子的支鏈烷基。進一步優(yōu)選地，R1選自異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基-丁基、3-甲基丁基。甚至更優(yōu)選地，R1選自異丙基、異丁基、仲丁基。在特別優(yōu)選的方法中，2-酮羧酸為2-酮異戊酸或其鹽。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，步驟a)中獲得的培養(yǎng)液包含至少10g/l、優(yōu)選至少15g/l、和更優(yōu)選至少20g/l、并且最優(yōu)選至少40g/l的2-酮羧酸或其鹽，所述2-酮羧酸優(yōu)選2-酮異戊酸。進一步優(yōu)選地，用于發(fā)酵步驟的微生物具有提高的產(chǎn)生通式(I)的化合物的能力，所述通式(I)的化合物優(yōu)選為選自2-酮異戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和2-酮-3-甲基戊酸的化合物或它們的混合物。優(yōu)選地，用于發(fā)酵步驟的微生物為棒桿菌(Corynebacterium)，其具有提高的產(chǎn)生2-酮異戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的能力，所述棒桿菌特別優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)。使用一種或多種蛋白下調(diào)或缺陷的棒桿菌菌株是特別有用的，所述蛋白例如轉(zhuǎn)氨酶B (E. C. 2. 6. 1. 42，由ilvE-基因編碼)、纈氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶AvtA(E. C. 2.6. 1.66，由avtA-基因編碼)或丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (E. C. 2. 6. 1. 2，由alaT-基因編碼)。此外，使用一種或多種蛋白下調(diào)或缺陷的棒桿菌菌株是有用的，所述蛋白例如丙酮酸脫氫酶的El亞基(E. C. 1. 2. 4. 1，由aceE基因編碼)、丙酮酸醌氧化還原酶(E. C. 1. 2. 2. 2，由pqo基因編碼)、葡糖磷酸異構(gòu)酶(E. C. 5. 3. 1. 9，由pgi 基因編碼)。為了獲得良好的產(chǎn)率，棒桿菌菌株在所提及的基因產(chǎn)物中的一些、所有或者所述基因產(chǎn)物的組合中是下調(diào)或缺陷的。aceE的基因產(chǎn)物催化丙酮酸向乙酰輔酶A的反應。 ilvE的基因產(chǎn)物催化2-酮異戊酸轉(zhuǎn)氨成氨基酸纈氨酸(每個轉(zhuǎn)氨反應，其將1摩爾的谷氨酸轉(zhuǎn)化成α -酮戊二酸)。avtA的基因產(chǎn)物催化2-酮異戊酸轉(zhuǎn)氨成氨基酸纈氨酸(每個轉(zhuǎn)氨反應，其將1摩爾的丙氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸)。alaT基因的基因產(chǎn)物催化從丙酮酸向丙氨酸的反應。pqo的基因產(chǎn)物催化從丙酮酸向乙酸的反應。Pgi的基因產(chǎn)物催化從葡糖-6-磷酸向果糖-6-磷酸的反應。此外，棒桿菌菌株可以過表達任意一種或多種或者所有下述優(yōu)選內(nèi)源基因 ilvBN(編碼乙酰羥酸合酶的基因，E. C. 4. 1. 3. 18)、ilvC(編碼乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的基因，E. C. 1. 1. 1.86)和 ilvD(編碼二羥基酸脫水酶的基因，E. C. 4. 2. 1.9)。ilvBN、ilvC 和 ilvD基因編碼代表從丙酮酸向2-酮異戊酸的代謝途徑的酶。對于酮甲基戊酸鹽的產(chǎn)生， 棒桿菌菌株還可以過表達任意一種或多種或者所有下述優(yōu)選內(nèi)源基因ilvA(編碼蘇氨酸
5脫水酶的基因，Ε. C. 4. 2. 1. 16)、hom (編碼高絲氨酸脫氫酶的基因，Ε. C. 1. 1. 1.3)、thrB (編碼高絲氨酸激酶的基因，E. C. 2. 7. 1. 39)、thrC(編碼蘇氨酸合酶的基因，E. C. 4. 2. 3. 1)、 lysC(編碼天冬氨酸激酶的基因，E. C. 2. 7. 2. 4)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aat，Ε. C. 2. 6. 1. 1)、 天冬氨酸半酸脫S酶(aspartate semialdehyse dehydrogenase) (asd, Ε. C. 1. 2. 1. 11)、 丙酮酸羧化酶(pyc，Ε. C. 6. 4. 1. 1)。對于酮異己酸鹽的產(chǎn)生，棒桿菌菌株還可以過表達任意一種或多種或者所有下述優(yōu)選內(nèi)源基因=IeuA(編碼2-異丙基蘋果酸合酶的基因 (E. C. 2. 3. 3. 13)、IeuB (3-異丙基蘋果酸脫氫酶，E. C. 1. 1. 1. 85)、IeuCD (3-異丙基蘋果酸脫水酶，E. C. 4. 2. 1. 33)。在特別優(yōu)選的實施方案中，棒桿菌菌株的基因型為Δ-aceE、Δ-ilvE，并過表達基因ilvBN、ilvC和ilvD，并且用于制備2-酮異戊酸。除棒桿菌之外，其它細菌菌株、酵母和真菌微生物能夠用于本發(fā)明的發(fā)酵過程，所述微生物例如大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌(Bacillus)、短桿菌 (Brevibacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、鏈霉菌(Streptomyces)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，在將培養(yǎng)液進行離子交換步驟(b)之前，進行從所述培養(yǎng)液除去細胞和/或細胞碎片的額外步驟，其中所述除去步驟優(yōu)選通過過濾、離心或沉降、或者所述方法的組合來進行。重組技術是本領域技術人員已知的。下表包含所用基因的登錄號。
權利要求
1.一種制備2-酮羧酸或其鹽的方法，所述2-酮羧酸具有通式(I) R1-CO-COOH,其中R1 為具有3-7個碳原子的支鏈烷基，所述方法包括以下步驟a)發(fā)酵步驟，其中使微生物在培養(yǎng)基中生長以提供包含2-酮羧酸或其鹽的培養(yǎng)液；b)將步驟a)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液進行選自離子交換、提取過程和蒸餾過程的一個或多個步驟；c)將步驟b)中獲得的產(chǎn)物進行進一步濃縮、沉淀或結(jié)晶或者它們的組合并獲得2-酮羧酸或其鹽。
2.如權利要求1所述的方法，所述方法包括以下步驟a)發(fā)酵步驟，其中使微生物在培養(yǎng)基中生長以提供包含2-酮羧酸或其鹽的培養(yǎng)液；b)將步驟a)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液進行蒸餾過程，其伴有所述發(fā)酵培養(yǎng)液的PH值變化。
3.如權利要求1所述的方法，所述方法包括以下步驟a)發(fā)酵步驟，其中使微生物在培養(yǎng)基中生長以提供包含2-酮羧酸或其鹽的培養(yǎng)液；b)將步驟a)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液進行離子交換。
4.如權利要求1或3所述的方法，其中將步驟b)中獲得的流出物進行選自離子交換、 提取或蒸餾的一個或多個進一步純化步驟。
5.如權利要求1、3和4所述的方法，所述方法包括以下步驟a)發(fā)酵步驟，其中使微生物在培養(yǎng)基中生長以提供包含2-酮羧酸或其鹽的培養(yǎng)液；b)將步驟a)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液進行離子交換；和c)將步驟b)中獲得的流出物進行選自離子交換、提取或蒸餾的一個或多個進一步純化步驟；以及d)將步驟c)中獲得的產(chǎn)物進行進一步濃縮、沉淀或結(jié)晶步驟或者它們的組合并獲得 2-酮羧酸或其鹽。
6.如權利要求1-5所述的方法，其中R1為具有3、4或5個碳原子的支鏈烷基，優(yōu)選地， R1選自異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基-丁基、3-甲基丁基，優(yōu)選異丙基、異丁基、 仲丁基。
7.如權利要求1-5所述的方法，其中所述2-酮羧酸為2-酮異戊酸、2-酮-4-甲基戊酸、2-酮-3-甲基戊酸或它們的鹽。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中在步驟a)中獲得的培養(yǎng)液包含至少 10g/l、優(yōu)選至少15g/l、更優(yōu)選至少20g/l、并且最優(yōu)選至少40g/l的2-酮羧酸或其鹽。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述用于發(fā)酵步驟的微生物具有提高的產(chǎn)生通式(I)的化合物的能力，所述通式(I)的化合物優(yōu)選為選自2-酮異戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和2-酮-3-甲基戊酸的化合物或它們的混合物。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述用于發(fā)酵步驟的微生物為棒桿菌 (Corynebacterium)，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述棒桿菌菌株在選自以下組中的任何一種或多種或者所有蛋白中是缺陷或下調(diào)的轉(zhuǎn)氨酶B(E. C. 2. 6. 1. 42，由ilvE-基因編碼)、纈氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶AvtA(E. C. 2. 6. 1.66，由avtA-基因編碼)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶AlaT(E. C. 2.6. 1.2，由alaT-基因編碼)、丙酮酸脫氫酶的El亞基(E. C. 1.2.4. 1，由aceE基因編碼)、丙酮酸醌氧化還原酶(E.C. 1.2. 2.2，由pqo基因編碼)和葡糖磷酸異構(gòu)酶(Ε. C. 5. 3. 1. 9，由 pgi 基因編碼)。
12.如權利要求10和11所述的方法，其中在所述棒桿菌菌株中，一種或多種選自以下組的基因是過表達的乙酰羥酸合酶，Ε. C. 4. 1.3. 18)、ilvC(編碼乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的基因，E. C. 1. 1. 1.86)和ilvD (編碼二羥基酸脫水酶的基因，E. C. 4. 2. 1.9) 2-酮異戊酸，并產(chǎn)生2-酮異戊酸。
13.如權利要求10和11所述的方法，其中在所述棒桿菌菌株中，一種或多種選自以下組的基因是過表達的ilvA(編碼蘇氨酸脫水酶的基因，E. C. 4. 2. 1. 16)、hom(編碼高絲氨酸脫氫酶的基因，E. C. 1. 1. 1.3)、thrB(編碼高絲氨酸激酶的基因，E. C. 2. 7. 1.39)、thrC (編碼蘇氨酸合酶的基因，E. C. 4. 2. 3. 1)、IysC (編碼天冬氨酸激酶的基因，E. C. 2. 7. 2. 4)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aat，E. C. 2. 6. 1. 1)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd，E. C. 1. 2. 1. 11)和丙酮酸羧化酶(pyc, E. C. 6. 4. 1. 1)，并產(chǎn)生酮甲基戊酸鹽。
14.如權利要求10和11所述的方法，其中在所述棒桿菌菌株中，一種或多種選自包括以下基因的組的基因是過表達的leuA(編碼2-異丙基蘋果酸合酶的基因 (E. C. 2. 3. 3. 13)、IeuB (3-異丙基蘋果酸脫氫酶，E. C. 1. 1. 1. 85)和IeuCD (3-異丙基蘋果酸脫水酶，E. C. 4. 2. 1. 33)，并產(chǎn)生酮異己酸鹽。
15.如權利要求1和3-14中任一項所述的方法，其中在將所述培養(yǎng)液進行離子交換步驟(b)之前，進行從所述培養(yǎng)液除去細胞和/或細胞碎片的額外步驟，其中所述除去步驟優(yōu)選通過過濾、離心或沉降、或者所述方法的組合來進行。
16.如權利要求15所述的方法，其中在從所述培養(yǎng)液除去細胞和/或細胞碎片之后和在步驟b)之前，使用離子交換樹脂或活性炭進行預純化。
17.如權利要求1和3-16中任一項所述的方法，其中在步驟b)中，使用陽離子樹脂進行離子交換。
18.如權利要求1和3-17所述的方法，其中在步驟c)中，將陰離子樹脂用于離子交換。
19.如權利要求1和3-17中任一項所述的方法，其中步驟c)的蒸餾為蒸汽蒸餾。
20.如權利要求18所述的方法，其中在10-100°C、優(yōu)選20-75°C、更優(yōu)選25-70°C、并且甚至更優(yōu)選35-65°C的溫度下進行所述蒸餾。
21.如權利要求19或20所述的方法，其中在10-100mbar、優(yōu)選20_80mbar、更優(yōu)選 20-65mbar、并且特別優(yōu)選20-25mbar的壓力下進行所述蒸餾。
22.如權利要求1和5-20中任一項所述的方法，其中在步驟d)的沉淀和結(jié)晶步驟中， 以選自Ca2+、Mg2+、Na+、K+的鹽的形式或者與氨基酸的鹽的形式獲得所述2_酮羧酸。
23.通過權利要求1至21中任一項所述的方法獲得的權利要求1-7中任一項所定義的2-酮羧酸或其鹽，優(yōu)選2-酮異戊酸、2-酮-4-甲基戊酸或2-酮-3-甲基戊酸或它們的鹽，其純度大于60重量％，優(yōu)選大于85重量％，特別優(yōu)選大于90重量％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備2-酮羧酸或其鹽的方法，所述2-酮羧酸具有通式R1-CO-COOH，其中R1為具有3-7個碳原子的支鏈烷基，所述方法包括發(fā)酵步驟，其中使微生物在培養(yǎng)基中生長以提供包含2-酮羧酸或其鹽的培養(yǎng)液。
文檔編號C12P7/50GK102459621SQ201080024741
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月10日 優(yōu)先權日2009年6月5日
發(fā)明者A·卡勞, N·莫蘭, R·格斯特邁爾 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限公司