專利名稱：一種家蠶濃核病毒BmDNV的PCR快速檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子診斷和鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速診斷家蠶濃核病毒及基 因組克隆測(cè)序分析的方法。
背景技術(shù)：
家蠶濃核病毒(Bombyx mori densovirus，BmDNV)是我國(guó)蠶繭生產(chǎn)中普遍發(fā)生的 病毒病的病毒，嚴(yán)重威脅著蠶絲業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)。二十世紀(jì)七十年代初期國(guó)外應(yīng)用血清學(xué)方法對(duì)家蠶病毒病進(jìn)行早期診斷。此法能 在蠶感病初期(感染病毒后24h 48h)進(jìn)行確診。我國(guó)于七十年代后期正式開(kāi)始了家蠶病 毒病血清學(xué)早期診斷的研究。王裕興等(王裕興，曹詒孫，錢元駿等.酶對(duì)流免疫電泳對(duì)家 蠶濃核病的早期診斷技術(shù).蠶業(yè)科學(xué)，1983,9(2) :97-102)將免疫酶聯(lián)技術(shù)應(yīng)用到該病的 早期診斷中，發(fā)現(xiàn)酶對(duì)流免疫電泳檢測(cè)靈敏度比對(duì)流免疫電泳提高8倍，最早檢出時(shí)間為 16 h，半數(shù)檢出時(shí)間為21h，均比同樣條件下的對(duì)流免疫電泳提早8 h左右。錢元俊等(錢元 駿，胡雪芳，王紅林.家蠶病毒病血清診斷實(shí)用化研究.蠶業(yè)科學(xué)，1984，10 (3) :155-157) 進(jìn)行了家蠶病毒病血清診斷實(shí)用化研究，研制了抗血清濾紙及其干燥保存的條件和方法； 郭錫杰等(郭錫杰，錢元駿，胡雪芳.家蠶濃核病的免疫酶組織化學(xué)方法早期診斷技術(shù).中 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1985，(5) :82-85)研究了用酶標(biāo)組化法進(jìn)行了 DNV病的早期診斷；錢元俊等 (錢元駿，胡雪芳.家蠶濃核病的血清學(xué)診斷方法.蠶業(yè)科學(xué)，1989，15 0):217-222)進(jìn)行了 多種血清學(xué)診斷家蠶濃核病方法的比較研究，包括雙向免疫擴(kuò)散法(DID)、對(duì)流免疫電泳法 (CIEP )、酶聯(lián)對(duì)流免疫電泳法(ELCIEP )、酶標(biāo)組化法(IEHC )、可溶性酶-抗酶法(PAP )、斑點(diǎn) 免疫結(jié)合測(cè)定法(DIBA)、生物素-親和素系統(tǒng)檢測(cè)法(ABS)以及膠乳凝集試驗(yàn)法(LTA)等， 應(yīng)用這些方法可以檢測(cè)出的純化家蠶濃核病毒BmDNV的量為IX 10—1 IX 10_4 0D。以DIBA 法檢測(cè)靈敏度最高，分別為L(zhǎng)AT法的10倍、ELCIEP法的160倍、CIEP法的1000倍。檢測(cè)蠶 體DNV時(shí)，可在接種后8 h 40 h檢出，以ABS法檢出陽(yáng)性反應(yīng)最早。PCR作為一種新的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有靈敏度高、快速特異、操作簡(jiǎn)單等優(yōu) 點(diǎn)，對(duì)于檢測(cè)臨床標(biāo)本中病原體的核酸序列具有常規(guī)診斷方法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，在應(yīng)用于 細(xì)菌、病毒的診斷與檢測(cè)方面已有較多的報(bào)道并展示其良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)，在運(yùn)用 PCR技術(shù)診斷檢測(cè)和研究家蠶濃核病毒基因方面，已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展(Kageyasu S, Hayakawa T, Isawa H et al. Detection of the Silkworm-pathogenic virus genomes by PCR. Journal of Sericultural Science of Japan，1997，66 (6) : 477—483 ；韓序，女兆 勤，高路等，家蠶濃核病毒(中國(guó)鎮(zhèn)江株)在不同感受性宿主體內(nèi)的復(fù)制.生物工程學(xué)報(bào)， 2007，23 (1) 145-151 ；付艷紅，唐順明，覃光星等.家蠶濃核病毒中國(guó)(鎮(zhèn)江)株基因組的 克隆及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶對(duì)濃核病毒的拯救.蠶業(yè)科學(xué)，2008,34(3) :453-458;余蔚， 姚勤，郭忠建等.家蠶濃核病毒中國(guó)株非結(jié)構(gòu)蛋白I(NSl)的表達(dá).微生物學(xué)報(bào)，2008， 48 O) 191-196)依據(jù)已經(jīng)報(bào)道的家蠶濃核病毒BmDNV基因片段序列設(shè)計(jì)引物，建立了家蠶 濃核病毒BmDNV的PCR診斷方法，但其檢測(cè)的敏感性還有待進(jìn)一步研究。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有家蠶濃核病毒BmDNV檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種家蠶濃 核病BmDNV的PCR快速敏感的檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)；
提供一種家蠶濃核病BmDNV的PCR快速檢測(cè)的方法，包括以下步驟
(1)提取感染家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA；
(2)設(shè)計(jì)引物，對(duì)提取的家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)；
本申請(qǐng)人依據(jù) NCBI 網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上報(bào)道的 BmDNV-3 的 VD2 ssDNA 基因組的核苷酸序列資料(DQ017^9. 1，gi 65306480)，采用 Primer primer 5. 0 設(shè) 計(jì)了一對(duì)合適的PCR擴(kuò)增引物VD2f和VD2r，擬擴(kuò)增的片段為449 bp。上游引物22 bp，位 于其5’端從2379 bp到MOO bp，下游引物22 bp，位于從觀06 bp到觀27 bp之間的序 列，兩引物的核苷酸序列分別如SEQ IDNO 3和SEQ IDNO 4所示 VD2f 5' TCATTGGCAACTGGAACTGGAG 3'； VD2r 5' GCTTGATTACTTGCGGTTCTTA 3，；
本發(fā)明所述PCR反應(yīng)采用25μ L體系2. 5μ L 10XPCR Buffer, 1 μ L dNTPs，正反向 引物濃度為 10 μ M，各加 IuLjIuL DNA 模板，18 μ L ddH20,0. 5μ L Taq 酶(2.5 U/μ L)0 引物擴(kuò)增的PCR循環(huán)為94°C 5 min ； 94°C 45 s，60°C 45 s，72°C 45 s，30循環(huán)；72°C 10 min，4°C 保存；
(3)取5μ L PCR產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用核酸染料Goldview進(jìn)行染 色檢測(cè)。優(yōu)選地，步驟(1)所述感染家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA的提取采用煮沸沉淀 法，具體是取感染家蠶濃核病毒BmDNV的家蠶中腸于研缽中，加1 mL的滅菌水將中腸研磨 充分后裝于1. 5 mL的滅菌離心管中，10000 r/ min離心10 min，取上清400μ L于1. 5 mL 的滅菌離心管中，并加入400 μ L抽提緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ；0. 1 mol/L EDTA，pH 8. 0 ；0. 5% SDS (十二烷基苯磺酸鈉)，于100°C水浴鍋中煮沸裂解10 min后， 取出放于-20°C冰箱中冷卻至室溫，10000 r/min離心5 min將變性的蛋白沉淀，另取上清 700 μ L于1.5 mL的滅菌離心管中，并加入700 μ L預(yù)冷的異丙醇，置-20 °C冰箱中冰凍30 min促進(jìn)沉淀形成；12000 r/min離心10 min沉淀DNA，并棄去上清；用1 mL 70% (V/V)乙 醇洗滌沉淀，然后盡量棄去乙醇，自然晾干，使乙醇揮發(fā)完全，但不能使沉淀過(guò)于干燥，否則 很難溶解；加入 20 μ L TE 溶液(10 mmol/L Tris_HCl，pH 8.0 ；lmmol/L EDTA，pH 8.0)或 滅菌ddH20溶解沉淀，_20°C保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的有益效果是
本發(fā)明使用煮沸沉淀法能夠快速有效地提取到家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA，簡(jiǎn)捷 快速，適于小量樣本操作，操作簡(jiǎn)單，僅需0.3 0.5 mL病毒液。使用本發(fā)明方法制備的 DNA樣品能夠滿足PCR方法對(duì)家蠶濃核病毒BmDNV進(jìn)行分子診斷的需要。因此本發(fā)明建立 了用煮沸沉淀法快速抽提BmDNV的模板DNA的方法，為應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行BmDNV的早期診 斷和預(yù)知檢查提供基礎(chǔ)和技術(shù)儲(chǔ)備；
本發(fā)明設(shè)計(jì)的一對(duì)特異的引物VD2f和VD2r，大量實(shí)驗(yàn)證明其具有特異敏感的優(yōu)越性，有效克服了現(xiàn)有家蠶濃核病毒BmDNV的PCR檢測(cè)技術(shù)的敏感性問(wèn)題。


圖1感染家蠶濃核病BmDNV家蠶的檢測(cè)結(jié)果；
圖2煮沸沉淀法、煮沸法、酚-氯仿法制備家蠶濃核病BmDNV模板DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法 如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到 的試劑和材料。實(shí)施例1
本實(shí)施例分別以煮沸沉淀法、煮沸法和酚-氯仿法提取的DNA為模板進(jìn)行家蠶濃核病 # (Bombyx mori densovirus, BmDNV)白勺 PCR本實(shí)施例以家蠶濃核病毒BmDNV (由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶桑生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常規(guī)的 桑葉添食繼代繁殖獲得，也可以采用本領(lǐng)域其他實(shí)驗(yàn)室或者研究院所提供的家蠶濃核病毒 BmDNV)為材料，分別通過(guò)煮沸法、煮沸沉淀法、酚-氯仿法(陳冬妹，林英，王艷霞.一種簡(jiǎn)便 分離高質(zhì)量家蠶基因組DNA的方法.蠶學(xué)通訊，2007，27 (2): 5_9)三種方法制備BmDNV 模板DNA，再經(jīng)PCR方法進(jìn)行家蠶濃核病DNV的分子檢測(cè)鑒定。1.煮沸沉淀法抽提家蠶濃核病毒BmDNV模板DNA
取一條感染家蠶濃核病毒BmDNV的蠶(例如感染所述病毒的死蠶)中腸于研缽中，加1 mL的滅菌水將中腸研磨充分后裝于1. 5 mL的滅菌離心管中，10000 r/ min離心10 min，取 上清400 μ L于1.5 mL的滅菌離心管中，并加入400 μ L抽提緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl， pH 8. 0 ；0. 1 mol/L EDTA, pH 8. 0 ；0. 5% SDS，其余體積用水補(bǔ)足)，于100°C水浴鍋中煮 沸裂解10 min后，取出放于-20°C冰箱中冷卻至室溫，10000 r/min離心5 min將變性的蛋 白沉淀，另取上清700 μ L于1.5 mL的滅菌離心管中，并加入700 μ L預(yù)冷的異丙醇，置-20 °C冰箱中冰凍30 min促進(jìn)沉淀形成；12000 r/min離心10 min沉淀DNA，并棄去上清；用1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，然后盡量棄去乙醇，自然晾干，使乙醇揮發(fā)完全，但不能使沉淀過(guò)于 干燥，否則很難溶解；加入 20 μ L TE 溶液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ； lmmol/L EDTA, PH 8. 0)或滅菌ddH20溶解沉淀，_20°C保存?zhèn)溆谩?.煮沸法抽提家蠶濃核病毒BmDNV模板DNA ；
取一條感染BmDNV的蠶(可以是實(shí)驗(yàn)用的感染BmDNV的活蠶，或者死蠶)的中腸于研缽 中，加1 mL的滅菌水將中腸研磨充分后裝于1. 5 mL的滅菌離心管中，10000 r/min離心 10 min,取上清400 μ L于1.5 mL的滅菌離心管中，并加入400 μ L抽提緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8. 0 ；0. 1 mol/L EDTA，pH 8. 0 ；0. 5% SDS)，于 100°C水浴鍋中煮沸裂解 10 min后，取出放于-20°C冰箱中冷卻至室溫，10000 r/min離心5 min將變性的蛋白沉淀，取 上清300 μ L于1. 5 mL的滅菌離心管中于_20°C冰箱保存以備檢測(cè)。3.酚氯仿法抽提家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA
參考陳冬妹等(陳冬妹，林英，王艷霞.一種簡(jiǎn)便分離高質(zhì)量家蠶基因組DNA的方法.蠶學(xué)通訊，2007，27 (2) 5-9)抽提家蠶基因組DNA的方法，并在此方法上略作修改取 方法1中感病家蠶中腸研磨液上清400 μ L于1. 5 mL的離心管中，加入400 μ L抽提緩沖 液(10 mmol/L Tris-HCl, ρΗ8· 0 ；0. 1 mol/L EDTA, pH 8. 0 ；0. 5% SDS)，用槍頭吹打混 勻，加入蛋白酶K至終濃度為400 500 μ g/mL，輕輕混勻，然后放入50°C水浴鍋中裂解消 化2-3 h;向上述離心管中，加入等體積600 PL的酚/氯仿/異戊醇(25: 24: 1)混合液， 在振蕩器上振蕩混勻；12000 r/min離心10 min，用去尖的槍頭小心移出上層水相至另一新 離心管中；加等體積的氯仿，在振蕩器上振蕩混勻；12000 r/min離心10 min，取出上層水 相至另一新離心管中；加入等體積預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA，后續(xù)操作同1。4. PCR法對(duì)家蠶濃核病毒BmDNV的檢測(cè)
分別對(duì)煮沸沉淀獲得的家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA、煮沸獲得的病毒液、研磨離 心獲得病毒原液(作為對(duì)照)、酚/氯仿法抽提獲得家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA進(jìn)行了 PCR檢測(cè)。依據(jù)NCBI網(wǎng)站(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)上報(bào)道的家蠶濃核病毒 BmDNV-3 的 VD2 ssDNA 基因組的核苷酸序列資料(DQ017^9. 1，gi 65306480)，用 Primer primer 5. 0設(shè)計(jì)了一對(duì)合適的PCR擴(kuò)增引物VD2f / VD2r，擬擴(kuò)增的片段為449 bp。上游 引物22 bp，位于其5’端從2379 bp到MOO bp，下游引物22 bp，位于從沘06 bp到?jīng)a27 bp之間的序列，兩引物的核苷酸序列分別為
VD2f 5' TCATTGGCAACTGGAACTGGAG 3' VD2r 5' GCTTGATTACTTGCGGTTCTTA 3， 上述引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)采用 25 μ L 體系2. 5μ L 10XPCR Buffer, 1 μ L dNTPs，正反向引物濃度 為 ΙΟμΜ，各加 lyL，lyL DNA 模板，18yL ddH20，0. 5 μ L Taq 酶(2. 5 U/μ L)。引物擴(kuò) 增的 PCR 循環(huán)為94°C 5 min ； 94°C 45 s，60°C 45 s，72°C 45 s，30 循環(huán)；72°C 10 min ，4°C保存。取5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用核酸染料Goldview進(jìn)行 染色檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖2所示，附圖2中，泳道M. DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 2為煮 沸沉淀法抽提家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA的PCR產(chǎn)物；3 4為煮沸法抽提家蠶濃核 病毒BmDNV的模板DNA的PCR產(chǎn)物；5 6為家蠶濃核病毒BmDNV病毒液的PCR產(chǎn)物；7 8為酚-氯仿法抽提BmDNV模板DNA的PCR產(chǎn)物；9為陽(yáng)性對(duì)照；10為健康家蠶基因組DNA 的PCR產(chǎn)物；11 ddH20。對(duì)煮沸沉淀法、酚-氯仿法制備的模板均能擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)大小相符 的約449 bp的明亮條帶，而對(duì)煮沸法制備的模板、病毒原液、健康家蠶組織的核酸模板擴(kuò)增 結(jié)果均為陰性，擴(kuò)增不出任何條帶。實(shí)施例2
(1)提取家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA ；
生物材料家蠶濃核病毒，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶桑生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)桑葉添食家蠶繼代 繁殖(按照常規(guī)方法，為實(shí)驗(yàn)室為研究目的，將一定濃度的病毒液涂布在新鮮桑葉的葉背， 然后喂食家蠶，使家蠶感染得病的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法)；EDTA購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司； 異丙醇由天津大茂化學(xué)試劑廠出品；無(wú)水乙醇由天津大茂化學(xué)試劑廠出品。步驟(1)所述家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA的提取采用煮沸沉淀法，取感染家蠶濃核病毒BmDNV的家蠶中腸于研缽中，加ImL的滅菌水將中腸研磨充分后裝于1. 5 mL的 滅菌離心管中，10000 r/ min離心10 min，取上清400 μ L于1. 5mL的滅菌離心管中，并加 入 400 μ L 抽提緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ；0. 1 mol/L EDTA, pH 8. 0 ；0. 5% SDS)，于100°C水浴鍋中煮沸裂解10 min后，取出放于_20°C冰箱中冷卻至室溫，10000 r/ min離心5 min將變性的蛋白沉淀，另取上清700 μ L于1. 5 mL的滅菌離心管中，并加入 700 μ L預(yù)冷的異丙醇，置-20°c冰箱中冰凍30min促進(jìn)沉淀形成；12000 r/min離心10 min 沉淀DNA，并棄去上清；用1 mL 70% (V/V)乙醇洗滌沉淀，然后盡量棄去乙醇，自然晾干，使 乙醇揮發(fā)完全，但不能使沉淀過(guò)于干燥，否則很難溶解；加入20 μ L TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ；lmmol/L EDTA, pH 8. 0)或滅菌 ddH20 溶解沉淀，_20°C保存?zhèn)溆谩?2 )設(shè)計(jì)引物，對(duì)提取的家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)；
依據(jù)NCBI網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上報(bào)道的家蠶濃核病毒BmDNV-3的 VD2 ssDNA基因組的核苷酸序列資料(DQ017^9. l，gi 65306480)，采用Primer primer 5.0 設(shè)計(jì)了一對(duì)合適的PCR擴(kuò)增引物VD2f / VD2r，擬擴(kuò)增的片段為449 bp。上游引物22 bp, 位于其5’端從2379 bp到M00 bp，下游引物22 bp，位于從觀06 bp到觀27 bp之間的序 列，兩引物的核苷酸序列分別為
VD2f 5' TCATTGGCAACTGGAACTGGAG 3'； VD2r 5' GCTTGATTACTTGCGGTTCTTA 3，。所述PCR 反應(yīng)采用 25yL 體系2. 5yL 10XPCR Buffer, 1 μ L dNTPs，正反向引 物濃度為 10μΜ，各加 lyL，lyL DNA 模板，18 μ L ddH20,0. 5μ L Taq 酶(2.5 U/μ L)。引 物擴(kuò)增的PCR循環(huán)為94°C 5 min ； 94°C 45 s，60°C 45 s，72°C 45 s，30個(gè)循環(huán)；72°C 10 min，4°C 保存。(3)取5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用核酸染料Goldview進(jìn) 行染色檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖1所示，本發(fā)明方法對(duì)家蠶感染家蠶濃核病毒BmDNV后1 60小 時(shí)的PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道Μ. DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 12分別為家蠶感染家蠶濃核 病毒BmDNV后1 12h的PCR產(chǎn)物；13 20分別為家蠶感染家蠶濃核病毒BmDNV后18 60h (間隔Mi)的PCR產(chǎn)物；21. BmDNV模板DNA的PCR產(chǎn)物；22.健康家蠶基因組DNA的 PCR 產(chǎn)物；23. ddH20。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用煮沸沉淀法，并優(yōu)化工藝條件，實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地提取所述病 毒的DNA，本發(fā)明方法適于小量樣本操作，僅要0. 3 0. 5 mL病毒液，就能滿足常規(guī)分子生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)合本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物，應(yīng)用于所述病毒的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，為生產(chǎn)中 制備家蠶濃核病毒BmDNV模板以及滿足其基因水平的快速診斷提供了重要的試驗(yàn)基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種家蠶濃核病毒BmDNV的PCR快速檢測(cè)的方法，其特征在于包括以下步驟(1)采用煮沸沉淀法抽提家蠶濃核病毒的模板DNA ；(2 )設(shè)計(jì)引物，對(duì)步驟(1)提取的家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)；所述引物的核苷酸序列為VD2f 5' TCATTGGCAACTGGAACTGGAG 3'；VD2r 5' GCTTGATTACTTGCGGTTCTTA 3，；(3)取5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用核酸染料Goldview進(jìn)行染 色檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶濃核病毒BmDNV的PCR快速檢測(cè)的方法，其特征在于步 驟(1)包括以下步驟(a)取研究實(shí)驗(yàn)用的感染BmDNV的家蠶中腸于研缽中，加水研磨，離心留上清液；(b)往步驟(a)制得的上清液中加入抽提緩沖液，水浴下煮沸裂解后冷卻，離心使變性 的蛋白沉淀，取上清液；所述抽提緩沖液組成為10 mmol/L Tris-HCLpH 8. O ；0. 1 mol/L EDTA, pH 8. O ；0. 5% SDS ；(c)按照體積比為1 :1的比例往步驟(b)制得的上清液中加入預(yù)冷的異丙醇，冰 凍使沉淀形成，離心后用體積比濃度為70%的乙醇洗滌沉淀，晾干后加入TE溶液或滅菌 ddH20溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆?；所述TE溶液組成為10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ； 1mmol/L EDTA, pH 8. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的家蠶濃核病毒BmDNV的PCR快速檢測(cè)的方法，其特征在于步 驟(b)加入抽提緩沖液后水浴下煮沸時(shí)間為10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶濃核病毒BmDNV的PCR快速檢測(cè)的方法，其特征在于步 驟(2)所述PCR反應(yīng)采用25yL體系2. 5yL 10XPCR Buffer, 1 μ L dNTPs，正反向引物濃 度為 ΙΟμΜ，各力口 lyL，lyL DNA 模板，18yL ddH20,0. 5μ L Taq 酶(2.5 U/yL);引物擴(kuò) 增的PCR循環(huán)為94°C 5 min ； 94°C 45 s，60°C 45 s，72°C 45 s，30個(gè)循環(huán)；72°C 10 min ，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠶濃核病毒BmDNV的PCR快速檢測(cè)的方法。本發(fā)明采用煮沸沉淀法快速抽提家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR法檢測(cè)家蠶濃核病毒BmDNV。本發(fā)明方法能夠有效地提取到家蠶濃核病毒BmDNV的模板DNA，檢測(cè)快速準(zhǔn)確，適于小量樣本操作，操作簡(jiǎn)單，使用本發(fā)明方法制備的DNA樣品能夠滿足PCR方法對(duì)家蠶濃核病毒BmDNV進(jìn)行分子診斷的需要，為應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行BmDNV的早期診斷和預(yù)知檢查提供基礎(chǔ)和技術(shù)儲(chǔ)備。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102134612SQ201010617198
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者劉吉平, 王永賓 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)