專利名稱：一種鏈霉菌微型轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)及其構(gòu)建方法，以及其在鏈霉菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
用傳統(tǒng)的方法如物理或化學(xué)誘變，定點(diǎn)突變等發(fā)現(xiàn)和研究鏈霉菌的基因
繁瑣，效率低下。轉(zhuǎn)座子是目前遺傳突變中一種行之有效的工具，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和分離出可以用于鏈霉菌中的轉(zhuǎn)座子，但是現(xiàn)有的一些轉(zhuǎn)座系統(tǒng)普遍存在多次轉(zhuǎn)座、效率不高、操作復(fù)雜并且來自異源的轉(zhuǎn)座子會(huì)受到鏈霉菌強(qiáng)烈的限制修飾系統(tǒng)的修飾而無法作用等問題，使得鏈霉菌中的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)得不到普遍應(yīng)用，篩選突變和闡明基因功能的工作進(jìn)展緩慢。本發(fā)明中應(yīng)用的轉(zhuǎn)座酶的名稱為IS204，來源于asteroiife (—種諾卡式菌).根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IS204的開放讀碼框的長(zhǎng)度為1134個(gè)堿基，兩端各有一個(gè)
23個(gè)堿基的反向重復(fù)序列(IRL，IRR).在插入的靶位點(diǎn)處會(huì)產(chǎn)生一段8bp的正向重復(fù)序列， 并且ISiY^在諾卡氏菌中轉(zhuǎn)座效率很高。為便于研究鏈霉菌功能基因，避免效率低，假陽性等問題，構(gòu)建高效的轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)具有很高的實(shí)用價(jià)值。由于諾卡氏菌和鏈霉菌都屬于放線菌，所以推測(cè)IS204也可以在鏈霉菌中發(fā)生高效轉(zhuǎn)座。本著這個(gè)思路，我們利用ISJi^構(gòu)建了一個(gè)用于鏈霉菌的高效微型轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，并對(duì)其轉(zhuǎn)座機(jī)理進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一套簡(jiǎn)便高效的研究鏈霉菌功能基因的系統(tǒng)，此系統(tǒng)克服了常規(guī)方法的上述問題，應(yīng)用此系統(tǒng)可在短時(shí)間內(nèi)篩選到足夠數(shù)量的隨機(jī)突變，而且用簡(jiǎn)單的方法即可得到突變位點(diǎn)的核苷酸信息。本發(fā)明首先提供一對(duì)ISiY^的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列，為IRL和IRR位點(diǎn)，其序列分別為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。本發(fā)明提供一個(gè)用于轉(zhuǎn)座的質(zhì)粒，由基于上述的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別位點(diǎn)序列所構(gòu)建，序列如 SEQ ID No. 20 所示，記為 pDZYlOl。所述轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的相應(yīng)元件，包括質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、抗藥性基因、轉(zhuǎn)座酶基因、接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)、紅霉素啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)座酶識(shí)別位點(diǎn)IRL、IRIT1和IRR。構(gòu)建一套研究鏈霉菌功能基因的轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)包括下述步驟(1)抽提 asteroiife的基因組DNA，然后以該基因組DNA作為模板，用引物SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6 j^Nocardia asteroids的基因組中PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度為13Mbp的轉(zhuǎn)座酶片段，然后將該片段插入到PMD19-T中，并在該基因片段上游插入紅霉素啟動(dòng)子。在轉(zhuǎn)座酶下游的一段包含有大腸桿菌復(fù)制子和硫酸安普霉素的片段兩旁分別插入IRL和IRR，使IRL和IRR的序列方向呈反向重復(fù)。構(gòu)建完成后的質(zhì)粒稱為PDZY101，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567，
4挑單菌落與天藍(lán)色鏈霉菌M145進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，抗性篩選。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)座效率穩(wěn)定地達(dá)到10_5，挑菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提基因組，用合適的限制性內(nèi)切酶酶切后，熱失活，用T4DNA 連接酶進(jìn)行片段自連，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選。挑單菌落提質(zhì)粒后用引物SEQ ID No. 7測(cè)序，結(jié)果表明，由于在pDZYlOl中轉(zhuǎn)座酶尾部18bp的序列恰好與其下游的IRR 呈反向重復(fù)，因而轉(zhuǎn)座酶特異性地作用于這兩個(gè)位點(diǎn)，而對(duì)IRL則不發(fā)生作用，其結(jié)果是 PDZY101整個(gè)作為一個(gè)的插入序列插入到鏈霉菌基因組中。另外通過比較插入靶位點(diǎn)的序列，確定為隨機(jī)插入。本發(fā)明將13Mbp的轉(zhuǎn)座酶片段做成地高辛標(biāo)記探針，對(duì)篩選到的鏈霉菌的基因組DNA進(jìn)行Southern blot,結(jié)果表明pDZYlOl作為一個(gè)轉(zhuǎn)座序列在靶基因組中均只插入一次。本發(fā)明通過PCR，將轉(zhuǎn)座酶3’端18bp的堿基缺失突變后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座不能發(fā)生。本發(fā)明將IRR和轉(zhuǎn)座酶3’端300bp —起轉(zhuǎn)移至原來IRL的位置，并保持原來位置處的轉(zhuǎn)座酶3’端為缺失突變，結(jié)果表明轉(zhuǎn)座特異性地發(fā)生在轉(zhuǎn)移之后的轉(zhuǎn)座酶和IRR 處。根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明證明該轉(zhuǎn)座酶只能特異性地作用于緊靠著的兩端反向重復(fù)序列。在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還構(gòu)建了一系列可用于轉(zhuǎn)座的質(zhì)粒，即pDZYlOl的衍生質(zhì)粒，分別記為PDZY102 pDZY107。


圖1轉(zhuǎn)座質(zhì)粒PDZY101結(jié)構(gòu)圖。
圖2轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pDZYlOl衍生質(zhì)粒pDZY102結(jié)構(gòu)圖。
圖3轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pDZYlOl衍生質(zhì)粒pDZY103結(jié)構(gòu)圖。
圖4轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pDZYlOl衍生質(zhì)粒pDZY104結(jié)構(gòu)圖。
圖5轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pDZYlOl衍生質(zhì)粒pDZY105結(jié)構(gòu)圖。
圖6轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pDZYlOl衍生質(zhì)粒pDZY106結(jié)構(gòu)圖。
圖7轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pDZYlOl衍生質(zhì)粒pDZY107結(jié)構(gòu)圖。
圖8質(zhì)粒PBY102結(jié)構(gòu)圖。
圖9= ISiY^轉(zhuǎn)座酶在轉(zhuǎn)座鏈霉菌時(shí)的作用位點(diǎn)鑒定圖。其中
(A) :PDZY10rPDZY107的質(zhì)粒圖譜線形示意圖?！?α ”和“ β ”分別代表兩處可能的轉(zhuǎn)座酶作用區(qū)域?！?+ ”和“_”分別代表能或者不能被轉(zhuǎn)座酶識(shí)別。(B):突變部分序列對(duì)比圖。 IRR-I為轉(zhuǎn)座酶尾部及其下游區(qū)域23個(gè)堿基，其中18個(gè)堿基與IRR呈反向重復(fù)。IRR-2是在保持轉(zhuǎn)座酶尾部氨基酸序列不變的基礎(chǔ)上缺失掉16bp之后序列。圖10 轉(zhuǎn)座突變株總基因組Southern雜交結(jié)果。其中
(A)隨機(jī)挑選的16株不同轉(zhuǎn)座突變株。1-16分別為轉(zhuǎn)座突變株基因組，17為M145野生型基因組，18為質(zhì)粒pDZY10L aI和船el雙酶切后所得3. 6kbDNA片段。(B) —株突變株經(jīng)連續(xù)傳代后隨機(jī)挑取16個(gè)子代菌株。1-16分別為轉(zhuǎn)座突變株基因組，17為M145野生型基因組，18為質(zhì)粒pDZY10L aI和船el雙酶切后所得3. 6kbDNA片段。圖11 轉(zhuǎn)座在隨機(jī)插入示意圖。其中圈外的代表轉(zhuǎn)座子插入后轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)錄方向與基因組一致，圈內(nèi)的代表轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)錄方向與基因組相反。黑色為無表型突變株；紫色是和次級(jí)代謝相關(guān)的突變株；綠色是和發(fā)育相關(guān)的突變株；紅色是既和發(fā)育相關(guān)也和次級(jí)代謝相關(guān)的突變株。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步描述 1.轉(zhuǎn)座酶DNA片段的獲得
離^Nocardia asteroids的孢子，提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，用引物SEQ ID No. 5和引物SEQ ID No. 6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，所產(chǎn)生的條帶位于對(duì)照DNA Marker的1400bp下方，與預(yù)期的1365bp目的基因片段大小接近(含酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)。2. pDZYlOl轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的構(gòu)建
以紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea為模板，引物兩端分別設(shè)計(jì)有 Xbal和的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，把PCR產(chǎn)物片段與pMD19_T載體做T-A克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pT-ermE ；以諾卡氏菌 asteroids (mexicana) YP21基因組為模板，以引物SEQ ID No. 5和引物SEQ ID No. 6擴(kuò)增轉(zhuǎn)座酶基因片段，引物兩端分別設(shè)計(jì)有和feoRI的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，用和feoRI酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物片段和質(zhì)粒pT-ermE，然后連接所得的兩條線性片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pT-ermE-tnp。用和分別酶切質(zhì)粒 PBY102和pT-ermE-tnp，再把所得線性片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pDZYlOl。其結(jié)構(gòu)如圖1所示。3. pDZYlOl 衍生質(zhì)粒 pDZY102 pDZY107 的構(gòu)建
為研究轉(zhuǎn)座酶作用位點(diǎn)的特征，我們?cè)赑DZY101基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一系列衍生質(zhì)粒 pDZY102、DZY107。
質(zhì)粒構(gòu)建過程如下
以pDZYlOl為模板，用引物SEQ ID No. 8和引物SEQ ID No. 9PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pDZYlOl 上的部分片段，用損ol和損al酶切擴(kuò)增片段，用損ol和MeI酶切質(zhì)粒pDZYlOl，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。用T4DNA連接酶連接回收后的兩條目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pDZY102。其結(jié)構(gòu)如圖2所示。以pDZYlOl為模板，用引物SEQ ID No. 10和引物SEQ ID No. IlPCR擴(kuò)增質(zhì)粒 pDZYlOl上的部分片段，用煬ol和損al酶切擴(kuò)增片段，用損ol和MeI酶切質(zhì)粒pDZYlOl， 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。用T4DNA連接酶連接回收后的兩條目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pDZY103。其結(jié)構(gòu)如圖3所示。以 pDZYlOl 為模板，用引物 SEQ ID No. 12 和引物 SEQ ID No. 13、引物 SEQ ID No. 14和引物SEQ ID No. 15PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pDZYlOl上的部分片段，再以所得的兩條片段為模板，進(jìn)行overlap PCR得到所要片段，用損ol和損al酶切overlap PCR的產(chǎn)物，用損ol 和MeI酶切質(zhì)粒PDZY103，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。用T4DNA連接酶連接回收后的兩條目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pDZY104。其結(jié)構(gòu)如圖4所示。
以 pDZYlOl 為模板，用引物 SEQ ID No. 16 和引物 SEQ ID No. 17、引物 SEQ ID No. 14和引物SEQ ID No. 15PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pDZYlOl上的部分片段，再以所得的兩條片段為模板，進(jìn)行overlap PCR得到所要片段，用損ol和損al酶切overlap PCR的產(chǎn)物，用損ol 和MeI酶切質(zhì)粒PDZY103，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。用T4DNA連接酶連接回收后的兩條目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pDZY105。其結(jié)構(gòu)如圖5所示。以 pDZYlOl 為模板，用引物 SEQ ID No. 16 和引物 SEQ ID No. 17、引物 SEQ ID No. 14和引物SEQ ID No. 15PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pDZYlOl上的部分片段，再以所得的兩條片段為模板，進(jìn)行overlap PCR得到所要片段，用損ol和損al酶切overlap PCR的產(chǎn)物，用損ol 和MeI酶切質(zhì)粒PDZY101，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。用T4DNA連接酶連接回收后的兩條目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pDZY106。其結(jié)構(gòu)如圖6所示。以 pDZYlOl 為模板，用引物 SEQ ID No. 18 和引物 SEQ ID No. 19、引物 SEQ ID No. 14和引物SEQ ID No. 15PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pDZYlOl上的部分片段，再以所得的兩條片段為模板，進(jìn)行overlap PCR得到所要片段，用損ol和損al酶切overlap PCR的產(chǎn)物，用損ol 和MeI酶切質(zhì)粒PDZY103，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。用T4DNA連接酶連接回收后的兩條目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pDZY107。其結(jié)構(gòu)如圖7所示。4.質(zhì)粒PBY102的構(gòu)建具體步驟如下
以質(zhì)粒PSET152為模板，用引物SEQ ID No. 21和引物SEQ ID No. 22擴(kuò)增質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)和阿泊拉抗性基因片段，引物兩端分別設(shè)計(jì)有MeI和feoRI的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，用酶切上述PCR片段，用和Smal酶切質(zhì)粒pRT802，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 回收目的片段。用T4DNA連接酶連接回收后的兩條目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pBY102，序列如SEQ ID No. 23所示。其結(jié)構(gòu)如圖8所示。5.轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的應(yīng)用與插入位點(diǎn)的鑒定
將pDZYlOl轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ET12567，挑取陽性轉(zhuǎn)化子與天藍(lán)色鏈霉菌M145接合轉(zhuǎn)移，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16到20小時(shí)后在培養(yǎng)皿上加入一定濃度的硫酸安普霉素，卡那霉素和萘啶酮酸。繼續(xù)培養(yǎng)4到6天后可觀察到單菌落。將得到的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取總基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶如al酶切4 h后，65°C熱失活20min，用T4DNA連接酶使酶切片段自身環(huán)化.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，用硫酸安普霉素和卡那霉素篩選陽性克隆.培養(yǎng)陽性克隆，提取質(zhì)粒后用引物測(cè)序即可知道轉(zhuǎn)座系統(tǒng)PDZY101插入到天藍(lán)色鏈霉菌M145基因組中的具體位置。6.轉(zhuǎn)座系統(tǒng)遺傳穩(wěn)定性研究
隨機(jī)選取16株轉(zhuǎn)座突變株連同5 coelicolorMU5野生株一起擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提基因組，并將總DNA用如al完全酶解，以pDZYlOl上的aac基因?yàn)樘结?，進(jìn)行Southern雜交實(shí)驗(yàn)。用^aI和MeI雙酶切質(zhì)粒pDZYlOl后得到的3. 6kbDNA片段作為陽性對(duì)照，以 S. coelicolorm^野生型基因組作為陰性對(duì)照。隨機(jī)選取一株轉(zhuǎn)座突變株，在含有阿伯拉霉素和卡那霉素抗性的SFM平板上進(jìn)行
權(quán)利要求
1.一對(duì)ISiW的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列，其特征在于為IRL和IRR位點(diǎn)，其序列分別為SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2.一個(gè)用于轉(zhuǎn)座的質(zhì)粒，其特征在于由基于權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別位點(diǎn)序列所構(gòu)建，序列如SEQ ID No. 20所示，記為pDZYlOl。
3.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的相應(yīng)元件，其特征在于包括質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)、抗藥性基因、轉(zhuǎn)座酶基因、接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)、紅霉素啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)座酶識(shí)別位點(diǎn)IRL、IRR-1和 IRR0
4.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于具體步驟如下以紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea為模板，用引物SEQ ID No. 3和引物SEQ ID No. 4擴(kuò)增紅霉素啟動(dòng)子片段，引物兩端分別設(shè)計(jì)有損al和的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，把PCR產(chǎn)物片段與PMD19-T載體做T-A克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pT-ermE ；以諾卡氏菌yVocart/ia asteroids (mexicana) YP21基因組為模板，以引物SEQ ID No. 5和引物SEQ ID No. 6擴(kuò)增轉(zhuǎn)座酶基因片段，引物兩端分別設(shè)計(jì)有Ba·和的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，用Ba·和酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物片段和質(zhì)粒pT-ermE，然后連接所得的兩條線性片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為pT-ermE-tnp ；用^aI和^boRI分別酶切質(zhì)粒pBY102和pT-ermE-tnp，再把所得線性片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒DNA，即為 pDZYlOl。
5.如權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的衍生質(zhì)粒，記為pDZY102 pDZY107，其特征在于在衍生質(zhì)粒PDZY102結(jié)構(gòu)圖中
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，具體為一種高效的鏈霉菌微型轉(zhuǎn)座突變系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明基于一種來源于諾卡氏菌Norcardia asteroids YP21的轉(zhuǎn)座因子IS204，構(gòu)建一系列含有IS204轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座子pDZY101~pDZY107，鑒定了天藍(lán)色鏈霉菌中IS204轉(zhuǎn)座酶作用位點(diǎn)的特征，并且證明了該轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有良好的遺傳穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)座隨機(jī)性。利用pDZY101及其衍生質(zhì)粒對(duì)S.coelicolor M145進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變，得到了大量的表型突變株，并且在變鉛青鏈霉菌等其它鏈霉菌屬成員中也發(fā)現(xiàn)了類似的特征,這些特點(diǎn)使得該轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在研究模式鏈霉菌功能基因上有著良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102154268SQ20101061063
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者丁曉明, 張欣城, 張渤, 張霖, 趙國(guó)屏, 鮑蕓 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)