專利名稱：一種用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)dgge分析的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物，可用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE鑒定分析。
背景技術(shù)：
輪枝菌(Verticillium)是自然界廣泛存在的一類真菌，其中包括植物病原真菌和昆蟲病原真菌。蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)是該屬中極有益的一種真菌，包含種類非常豐富，可以感染多種作物上的病原真菌、害蟲和病原線蟲，已被證實(shí)是一種極具潛力的微生物殺蟲劑，在歐美、前蘇聯(lián)等國成功應(yīng)用于溫室害蟲的生物防治。蠟蚧輪枝菌在輪枝菌群落中的存活規(guī)律的闡明，將對指導(dǎo)其在害蟲綜合防治體系中的應(yīng)用具有重要意義。 昆蟲病真菌傳統(tǒng)研究方法主要依賴于選擇性平板培養(yǎng)和蟲餌誘集，然而尚無對蠟蚧輪枝菌敏感的選擇性培養(yǎng)基和供試蟲體，這嚴(yán)重制約了蠟蚧輪枝菌存活規(guī)律的研究。變性梯度電泳(DGGE)技術(shù)由Fischer和Lerman于1979年最先提出，是用于檢測 DNA突變的一種電泳技術(shù)。Myers于1985年首次在DGGE中使用GC發(fā)夾技術(shù)，可防治DNA片段在DGGE膠中完全解鏈，DNA片段中每個(gè)堿基處的序列差異基本都能被區(qū)分開，使DGGE技術(shù)日臻完善。與傳統(tǒng)的微生物研究方法相比，DGGE的一大優(yōu)點(diǎn)是能夠快速、準(zhǔn)確的鑒定各種樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律和種群動(dòng)態(tài)，無需對所研究的微生物進(jìn)行純種培養(yǎng)。DGGE 的另一優(yōu)點(diǎn)是能夠同時(shí)對比分析大量的樣品，既可比對分析不同微生物群落間的差異，也可研究同一微生物群落隨時(shí)間和外部環(huán)境壓力的變化過程。因此，DGGE技術(shù)已成為微生物群落遺傳多樣性和動(dòng)態(tài)分析的強(qiáng)有力工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前缺乏引物用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的問題，而提供一種用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物。本發(fā)明用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物為正向引物Sl (5’-TAACGGAGGGTTA GGGCTCGACC-3，)和反向引物 A1-GC (5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTACG AGCTTTTTAACCA-3，)。本發(fā)明的引物是根據(jù)輪枝菌屬真菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。應(yīng)用本發(fā)明的引物S1/A1-GC可擴(kuò)增出長度為313bp的目的片段，通過DGGE分析PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物可提供樣品中輪枝菌群落結(jié)構(gòu)的信息。


圖1為采用引物S1/A1-GC對樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜。M泳道為 BM2000,1-4號(hào)泳道為樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5號(hào)泳道為空白對照。圖2為采用引物S1/A1-GC對樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式土壤樣品DNA提取稱取5g土壤樣品和Ig玻璃珠至50mL離心管，加入13. 5mL DNA 提取液(0. Imol/LTris base，0. lmol/LEDTA,0. lmol/L 磷酸鈉，1. 5mol/LNaCl, 1 % CTAB, ρΗ8· 0)混合，加入 100 μ L 蛋白酶 K(10mg/mL)，置搖床，225r/min, 37°C搖 30min ；加入 1. 5mL SDS (20% )，置水浴鍋，65°C水浴2h，每隔15 30min緩慢顛倒離心管數(shù)次；取出后室溫， 3000rpm離心5min，收集上清液至新的50mL離心管；土壤樣品沉淀繼續(xù)加4. 5mL DNA提取液和0. 5mL SDS (20%),渦旋10s，置水浴鍋，65°C水浴lOmin，收上清液，與前一次上清液合并，重復(fù)上述操作，收集上清液與前兩次上清合并；上清液加入等體積氯仿-異戊醇(體積比為24 1)，12000rpm離心5min ；將水相轉(zhuǎn)至50mL離心管，加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫沉淀lh，室溫16000rpm離心20min ；收核酸沉淀，加入70%乙醇(冷)，洗滌沉淀兩次，重懸于TE緩沖液，最終體積500 μ L0樣品DNA 中 18S rDNA 的 PCR擴(kuò)增使用引物對 Sl (5，-TAACGGAGGGTTAGGGCTCGACC-3，)和 Al-GC(5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTACGAGCTTTTTAACCA-3，)對樣品中的18S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25 μ L由0. 5 μ L DNA模板(約IOng)、 0. 5 μ L 正向引物 Sl (10 μ Μ)、0. 5 μ L 反向引物 Al-GC (10 μ Μ)、0. 5 μ L dNTPs (10mmol/L)、 2. 5μ L 10XPCR buffer(帶 MgCl2)、0· 2μ 1 TaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，滅菌雙蒸水補(bǔ)足 25 μ L0 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 3min，變性94°C 30s，退火59.5°C 30s，延伸 72°C 45s，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見圖1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE分析丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度為50-70% (由 7mol/L尿素和質(zhì)量濃度40%去離子甲酰胺組成的水溶液作為100%變性劑)，PCR產(chǎn)物上樣量為200ng。DGGE電泳條件為電壓80V，60°C下電泳12h。電泳完畢后用IXSTOR-Green 染色30min，通過Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE見圖2。DGGE凝膠中相關(guān)條帶回收、克隆和測序用滅菌刀片將相關(guān)條帶切下，放入1. 5mL 滅菌離心管，搗碎，加入60 μ L無菌水去離子水清洗，后加入60 μ L無菌水去離子于4°C靜置過夜。取上清液2μ L做DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與T載體連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑挑選。選擇樣品基因組的PCR產(chǎn)物作為參照，DGGE比對陽性克隆子PCR產(chǎn)物的相對位置，淘汰假陽性克隆子。陽性克降子送上海生工測序，測序后登錄Genbank進(jìn)行序列比對。
權(quán)利要求
1. 一種用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物，其特征在于用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE 分析的引物為正向引物 Sl :5’ -TAACGGAGGGTTAGGGCTCGACC-3’反向引物 Al-GC :5’ -CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTACGAGCTTTTTAAC CA-3，。
全文摘要
一種用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物，它涉及一對用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物。本發(fā)明解決了目前缺乏引物用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的問題。本發(fā)明用于輪枝菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物為正向引物S1(5’-TAACGGAGGGTTAGGGCTCGACC-3’)和反向引物A1-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTACGAGCTTTTTAACCA-3’)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102533943SQ20101058147
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者張艷軍, 謝明, 邱衛(wèi)亮 申請人:張艷軍